Identification et caractérisation d’une souris mutante Skam26Jus comme un nouveau modèle des anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales très fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés sur 1000 naissances. Elles résultent d’une fermeture incomplète du tube neural lors de l’embryogenèse. L’étiologie des ATN est complexe impliquant des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. La souris représente un outil puissant afin de mieux comprendre la génétique des ATN. Particulièrement, la souris modèle a impliqué fortement la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP) dans ces malformations. Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle souris mutante, Skam26Jus dans le but d’identifier un nouveau gène causant les ATN. Skam26Jus a été générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera. Cette souris est caractérisée par une queue en forme de boucle ou de crochet, soit un phénotype associé aux ATN. La complémentation génétique de la souris Skam26Jus avec une souris mutante d’un gène de la voie PCP Vangl2 (Looptail) a montré une interaction génétique entre le gène muté chez Skam26Jus et Vangl2, suggérant que ces deux gènes fonctionnent dans des voies de signalisation semblables ou parallèles. Un total de 50% des embryons doubles hétérozygotes avec un phénotype de la queue présentent un spina bifida. La cartographie par homozygotie du génome entier suivie par un clonage positionnel a permis d’identifier Lrp6 comme le gène muté chez Skam26Jus. Une mutation homozygote, p.Ile681Arg, a été identifiée dans Lrp6 chez les souris ayant une queue en boucle/crochet. Cette mutation était absente dans 30 souches génétiques pures indiquant que cette mutation est spécifique au phénotype observé. Une étude de phénotype-génotype évalue la pénétrance à 53 % de la mutation Ile681Arg. Lrp6 est connu pour activer la voie canonique Wnt/β-caténine et inhiber la voie non canonique Wnt/PCP. Le séquençage de la région codante et de la jonction exon-intron de LRP6 chez 268 patients a mené à l’identification de quatre nouvelles rares mutations faux sens absentes chez 272 contrôles et de toutes les bases de données publiques. Ces mutations sont p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile; p.Tyr1541Cys et leur pathogénicité prédite in silico indiquent que p.Val1386Ile est bénigne, et que p.Tyr306Hiset p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys sont i possiblement dommageables. Les mutations p.Tyr306His, p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys ont affecté l’habilité de LRP6 d’activer la voie Wnt/β-caténine en utilisant le système rapporteur luciférase de pTOPflash. Nos résultats suggèrent que LRP6 joue un rôle dans le développement des ATN chez une petite fraction de patients ayant une ATN. Cette étude présente aussi Skam26Jus comme un nouveau modèle pour étudier les ATN chez l’humain et fournit un outil important pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des A TN.

Exercice physique et athérosclérose : quels sont les mécanismes physiologiques et moléculaires de l'exercice qui préviennent et protègent de l'athérosclérose? : approche chez un modèle expérimental d'athérosclérose : la souris génétiquement dépourvue en apolipoprotéine E (apoE-/-)

RESUME : L'athérosclérose, pathologie inflammatoire artérielle chronique, est à l'origine de la plupart des maladies cardiovasculaires qui constituent l'une des premières causes de morbidité et mortalité en France. Les études observationnelles et expérimentales montrent que l'exercice physique prévient la mortalité cardiovasculaire. Cependant, les mécanismes précisant les bénéfices cliniques de l'exercice sur l'athérosclérose sont encore largement inconnus. Le but général de ce travail a donc été d'explorer, en utilisant un modèle expérimental d'athérosclérose, la souris hypercholestérolémique génétiquement dépourvue en apolipoprotéine E (apoE-/-), les mécanismes athéroprotecteurs de l'exercice. La dysfonction endothéliale, généralement associée aux facteurs de risque cardiovasculaire, serait l'une des étapes précoces majeures de l'athérogenèse. Elle est caractérisée par une diminution de la biodisponibilité en monoxyde d'azote (NO) avec la perte de ses propriétés vasculo-protectrices, ce qui favorise un climat pro-athérogène (stress oxydatif, adhésion et infiltration des cellules inflammatoires dans la paroi artérielle...) conduisant à la formation de la plaque athéromateuse. L'objectif de notre premier travail a donc été d'explorer les effets de l'exercice d'une part, sur le développement des plaques athéromateuses et d'autre part, sur la fonction endothéliale de la souris apoE-/-. Nos résultats montrent que l'exercice réduit significativement l'extension de l'athérosclérose et prévient la dysfonction endothéliale. L'explication pharmacologique montre que l'exercice stimule la fonction endothéliale via, notamment, une plus grande sensibilité des récepteurs endothéliaux muscariniques, ce qui active les événements signalétiques cellulaires récepteurs-dépendants à l'origine d'une bioactivité accrue de NO. Les complications cliniques graves de l'athérosclérose sont induites par la rupture de la plaque instable provoquant la formation d'un thrombus occlusif et l'ischémie du territoire tissulaire en aval. L'objectif de notre deuxième travail a été d'examiner l'effet de l'exercice sur la qualité/stabilité de la plaque. Nos résultats indiquent que l'exercice de longue durée stabilise la plaque en augmentant le nombre de cellules musculaires lisses et en diminuant le nombre de macrophages intra-plaques. Nos résultats montrent aussi que la phosphorylation de la eNOS (NO Synthase endothéliale) Akt-dépendante n'est pas le mécanisme moléculaire majeur à l'origine de ce bénéfice. Enfin, dans notre troisième travail, nous avons investigué l'effet de l'exercice sur le développement de la plaque vulnérable. Nos résultats montrent, chez un modèle murin de plaque instable (modèle d'hypertension rénovasculaire à rénine et angiotensine II élevés) que l'exercice prévient l'apparition de la plaque vulnérable indépendamment d'un effet hémodynamique. Ce bénéfice serait associé à une diminution de l'expression vasculaire des récepteurs AT1 de l'Angiotensine II. Nos résultats justifient l'importance de l'exercice comme outil préventif des maladies cardiovasculaires. ABSTRACT : Atherosclerosis, a chronic inflammatory disease, is one of the main causes of morbidity and mortality in France. Observational and experimental data indicate that regular physical exercise has a positive impact on cardiovascular mortality. However, the mechanisms by which exercise exerts clinical benefits on atherosclerosis are still unknown. The general aim of this work was to elucidate the anti-atherosclerotic effects of exercise, using a mouse model of atherosclerosis: the apolipoprotein E-deficient mice (apoE-/- mice). Endothelial dysfunction, generally associated with cardiovascular risk factors, has been recognized to be a major and early step in atherogenesis. Endothelial dysfunction is characterized by Nitric Oxide (NO) biodisponibility reduction with loss of NO-mediated vasculoprotective actions. This leads to vascular effects such as increased oxidative stress and increased adhesion of inflammatory cells into arterial wall thus playing a role in atherosclerotic plaque development. Therefore, one of the objective of our study was to explore the effects of exercise on atherosclerotic plaque extension and on endothelial function in apoE-/- mice. Results show that exercise significantly reduces plaque progression and prevents endothelial dysfunction. Pharmacological explanation indicates that exercise stimulates endothelial function by increasing muscarinic receptors sensitivity which in turn activates intracellular signalling receptor-dependent events leading to increased NO bioactivity. The clinical manifestations of atherosclerosis are the consequences of unstable plaque rupture with thrombus formation leading to tissue ischemia. The second aim of our work was to determine the effect of exercise on plaque stability. We demonstrate that long-term exercise stabilizes atherosclerotic plaques as shown by decreased macrophage and increased Smooth Muscle Cells plaque content. Our results also suggest that the Akt-dependent eNOS phosphorylation pathway is not the primary molecular mechanism mediating these beneficial effects. Finally, we assessed a putative beneficial effect of exercise on vulnerable plaque development. In a mouse model of Angiotensine II (Ang II)-mediated vulnerable atherosclerotic plaques, we provide fist evidence that exercise prevents atherosclerosis progression and plaque vulnerability. The beneficial effect of swimming was associated with decreased aortic Ang II AT1 receptor expression independently from any hemodynamic change. These findings suggest clinical benefit of exercise in terms of cardiovascular event protection.

L'impact des cellules souches issues de la moelle sur la néovascularisation dans un modèle de souris de rétinopathie induite par l'oxygène

La rétinopathie induite par l’oxygène (RIO) est un modèle animal semblable aux rétinopathies vue chez l’homme. Dans ce modèle, une destruction des microvaisseaux rétiniens est suivie d’une néovascularisation pathologique qui chez l’homme peut mener à un détachement de la rétine et subséquemment une perte de vision. Afin de remédier à cette revascularisation anarchique, un traitement de cellules souches (hématopoïétiques et mésenchymateuses) a été effectué chez des souris soumises à ce modèle. Les cellules injectées ont pu migrer à la rétine et induire une revascularisation saine (surtout les cellules souches mésenchymateuses). L’injection du milieu de culture de ces cellules induit aussi une revascularisation semblable à celle vue chez les souris traitées avec les cellules indiquant que l’effet thérapeutique des cellules semble être accompli par l’entremise de facteurs paracrines. Ces résultats suggèrent que ces cellules peuvent jouer un rôle au niveau de l’angiogénèse et indiquent un potentiel thérapeutique pour les rétinopathies.

Sélection in vivo par phage display dans un modèle de sténose valvulaire aortique chez la souris pour la découverte de nouveaux peptides ciblant la valve aortique

La sténose valvulaire aortique (SVA) est la maladie des valves cardiaques la plus répandue dans les pays développés qui touche les personnes âgées. La SVA est un processus actif caractérisé par des dépôts de lipides, de l’inflammation, de la fibrose et une calcification active des feuillets qui progresse vers un épaississement et durcissement de la valve aortique et une diminution de l’aire de la valve aortique. Nous avons émis l’hypothèse que la pathogénèse de la SVA modifie progressivement l’endothélium de la valve aortique, ce qui engendre l’expression de biomarqueurs spécifiques aux tissus et à la maladie. On rapporte dans cet étude, l’utilisation de la technique de sélection in vivo par phage display d’une librairie de peptides aléatoires afin de trouver de nouveaux peptides candidats qui se lieraient à des biomarqueurs spécifiques à la valve aortique malade d’une souris. Des souris ATX (LDLr-/-;Tg(hApoB+/+)) âgées atteintes de la SVA ont été utilisées pour la sélection in vivo d’une librairie de peptides aléatoires de 7 acides aminés contraints ou linéaires. Après 4 tours de criblage, on a caractérisé 14 phages différents qui ont été séparés en 5 motifs consensus pour la librairie linéaire et 11 phages différents qui représentent 5 différents motifs consensus pour la libraire de peptides contraints. La spécificité de 4 phages candidats de la librairie linéaire et de 5 phages de la librairie contrainte a été étudiée par l’immunomarquage des peptides d’intérêt exprimés par les phages sur les coupes de tissus de la valve aortique malade par rapport aux tissus contrôles du foie, du rein, de la rate, du ventricule et du poumon. Parmi eux, 6 phages représentent des peptides candidats intéressants qui ont besoin d’être testés davantage pour évaluer leur spécificité in vivo à la valve. Bien qu’il reste encore de la validation à effectuer, les peptides candidats spécifiques trouvés peuvent représenter des agents moléculaires d’imagerie utiles ou des transporteurs dans la livraison de drogue qui ciblent la valve aortique malade.

Étude de la physiopathologie des souris déficientes en 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA lyase (HL) : un modèle de la déficience humaine en HL

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude de la physiopathologie des souris déficientes en 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA lyase (HL) : un modèle de la déficience humaine en HL

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Interrelation entre déficits métaboliques et neuropathologie associée à la maladie d’Alzheimer chez la souris 3xTg-AD

La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative qui cause le plus important nombre de cas de démence. On estime que près de 15% des canadiens âgés de plus de 65 ans sont atteints de la MA. Avec le vieillissement de la population, le nombre de cas augmentera de manière substantielle dans les prochaines années. À l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de ralentir la progression de la maladie. Pour plus de 99% des cas, ses causes exactes demeurent indéterminées. Toutefois, de nombreux facteurs de risque ont été identifiés. Parmi eux, on retrouve plusieurs facteurs liés au métabolisme énergétique dont l’obésité et le diabète de type 2 (DT2). De manière intéressante, des modifications du métabolisme, telles qu’une résistance à l’insuline centrale et périphérique, sont également observées chez les patients Alzheimer. Afin de mieux comprendre l’interaction entre le DT2 et la MA, nous avons d’abord étudié les altérations métaboliques chez la souris triple transgénique (3xTg-AD), un modèle murin de la MA. Nous avons, en premier lieu, observé une intolérance au glucose qui progresse avec l’âge, qui est plus importante chez les femelles et qui semble liée à l’accumulation du peptide beta-amyloïde (Aβ) humain dans le pancréas. Ensuite, nous avons nourri cette souris avec une diète riche en gras pour vérifier l’impact d’une aggravation des déficits métaboliques sur la pathologie Alzheimer. L’aggravation de l’intolérance au glucose chez les souris 3xTg-AD semblait liée à l’atrophie des îlots de Langerhans et, en conséquence, à une réduction de la production d’insuline en réponse à l’injection de glucose. En plus de l’aggravation des déficits métaboliques, la diète riche en gras a augmenté de manière drastique l’accumulation de la forme soluble du peptide Aβ dans le cortex et a déterioré la mémoire des souris 3xTg-AD. De manière intéressante, l’élévation du peptide Aβ et les troubles de la mémoire ont été rétablis par l’administration d’une seule dose d’insuline. Aussi, nous avons observé une augmentation du peptide Aβ dans le plasma 30 minutes à la suite de l’injection d’insuline, suggérant qu’il est possible que la baisse rapide du peptide soit en partie causée par une élévation de la clairance du peptide au cerveau. Ces résultats renforcent les évidences supportant le potentiel thérapeutique de l’insuline dans le traitement de la MA. Toutefois, les résultats chez les patients mettent en lumière l’inefficacité de l’administration intranasale d’insuline chez les porteurs de l’allèle 4 du gène de l’apolipoprotéine E (APOE4). Afin de comprendre les raisons qui expliquent cette différence de réponse à l’insuline chez les porteurs de l’APOE4, nous avons injecté des souris exprimant l’APOE3 et l’APOE4 humain avec de l’insuline dans le but de vérifier l’effet central et périphérique de l’insuline chez ces animaux. Les souris APOE4 montrent une plus importante élévation de la signalisation de l’insuline au cerveau comparativement aux souris APOE3. Cette plus haute réponse est aussi associée à une élévation plus importante de la phosphorylation de la protéine tau, un marqueur neuropathologique de la MA. En somme, ces résultats suggèrent qu’il existe un cercle vicieux entre la MA et le DT2. L’administration d’insuline a un potentiel thérapeutique intéressant pour la MA, malgré des effets limités chez les patients APOE4 en raison de son impact probable sur la phosphorylation de la protéine tau.

Étude de la fonction ovarienne chez les souris déficientes des enzymes hyaluronidases

Les mammifères femelles naissent avec un très grand nombre de follicules ovariens primordiaux (104-106); par contre, la grande majorité (99%) de ces follicules n’atteignent jamais la maturité et subissent l’atrésie, principalement par l’apoptose des cellules de la granulosa. Notre laboratoire a démontré que les hyaluronidases des mammifères induisent l’apoptose des cellules de la granulosa et sont impliquées dans l’atrésie des follicules mais que cet effet apoptotique ne serait pas dû à leur activité enzymatique. Notre modèle propose que les hyaluronidases aient un rôle dans les follicules non destinés à ovuler. Le but de la présente étude est d’évaluer la folliculogénèse et la fertilité des souris déficientes de ces enzymes. Les résultats montrent que la délétion de Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne des souris mais qu’il pourrait y avoir un effet compensatoire par Hyal-1 chez les souris déficientes de Hyal-3 étant donné que son expression est augmentée chez ces souris. La délétion de Hyal-1 a pour effet d’augmenter le nombre des follicules primordiaux, primaires et secondaires, particulièrement chez les souris de bas âge, et de diminuer le niveau d’apoptose des cellules de la granulosa. Afin d’évaluer la fonction de Hyal-1, -2 et -3 sans effet compensatoire entre elles, nous avons voulu créer une souris déficiente des ces 3 hyaluronidases spécifiquement dans les gonades en utilisant le système Cre/loxP. Un vecteur contenant la séquence Cre sous le contrôle du promoteur de Inhibin-α, qui conduit l’expression des gènes en aval chez les cellules somatiques des gonades, a été construit avec succès. En conclusion, cette étude nous révèle que Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne mais que la délétion de Hyal-1 augmente la folliculogénèse et diminue l’apoptose des cellules de la granulosa.

Les cellules stromales multipotentes accélèrent la guérison de plaies cutanées chez les souris irradiées via la sécrétion de la chimiokine SDF-1α

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes (RI) peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération des tissus. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent largement inconnus encore aujourd’hui, ce qui a pour effet de limiter le développement d’approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle de guérison de plaie cutanée chez la souris, nous avons cherché à déterminer les mécanismes par lesquels l’exposition aux RI limite la régénération de la peau. Nos résultats démontrent que l’induction de la "stromal-derived growth factor 1α" (SDF-1α), une cytokine normalement surexprimée dans les tissus hypoxiques, est sévèrement diminuée dans les plaies de souris irradiées versus non-irradiées. Ce défaut corrèle avec un retard de guérison des plaies et est encore évident plusieurs mois suivant l’exposition aux RI, suggérant qu’il y a une altération permanente de la capacité de la peau à se réparer. Parce que SDF-1α est secrété principalement par les fibroblastes du derme, nous avons évalué le potentiel des cellules stromales multipotentes (MSCs), qui sont reconnues pour secréter des niveaux élevés de SDF-1α, à accélérer la régénération de la peau chez les souris irradiées. L’injection de MSCs en périphéries des plaies a mené à une accélération remarquable de la guérison de la peau chez les souris exposées aux RI. Les actions des MSCs étaient principalement paracrines, dû au fait que les cellules n’ont pas migré à l’extérieur de leur site d’injection et ne se sont pas différentiées en kératinocytes. L’inhibition spécifique de l’expression de SDF-1α a mené à une réduction drastique de l’efficacité des MSCs à accélérer la fermeture de plaie indiquant que la sécrétion de SDF-1α par les MSCs est largement responsable de leur effet bénéfique. Nous avons découvert aussi qu’un des mécanismes par lequel SDF-1α accélère la guérison de plaie implique l’augmentation de la vascularisation au niveau de la peau blessée. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent collectivement que SDF-1α est une importante cytokine dérégulée au niveau des plaies cutanées irradiées, et que le déclin du potentiel de régénération des tissus qui est observé suivant une exposition au RI peut être renversé, s’il est possible de restaurer le microenvironnement de la blessure avec un support stromal adéquat.

Rôle du système rénine-angiotensine intrarénal dans l’hypertension et les dommages rénaux chez les souris transgéniques diabétiques

Plusieurs expériences et études cliniques ont démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) peut induire l’hypertension, un facteur de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires et rénales. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique substrat du RAS. Cependant, il n’a pas encore été démontré si l’activation du RAS intrarénal peut à elle seule induire des dommages rénaux, indépendamment de l’hypertension systémique, et ainsi jouer un rôle prépondérant dans la progression de la néphropathie diabétique. Afin d’explorer le rôle du RAS intrarénal dans les dommages rénaux, un diabète a été induit par l’injection de streptozotocin chez des souris transgéniques (Tg) surexprimant l’Agt de rat dans les cellules des tubules proximaux du rein (RPTC). Les souris Tg diabétiques ont été traitées soit avec des inhibiteurs du RAS (perindopril et losartan), de l’insuline ou une combinaison des deux pour 4 semaines avant d’être euthanasiées. Pour une autre étude, des souris Tg non-diabétiques ont été traitées soit avec des inhibiteurs du RAS, l’hydralazine (vasodilatateur) ou l’apocynine (inhibiteur de la NADPH oxydase) pour une période de 8 semaines avant l’euthanasie. Des souris non-Tg ont été utilisées comme contrôles. Des cellules immortalisées de tubule proximal de rat (IRPTC) transfectées de manière stable avec un plasmide contenant l’Agt ou un plasmide contrôle ont été employées comme modèle in vitro. Nos résultats ont démontré que les souris Tg présentaient une augmentation significative de la pression systolique, l’albuminurie, l’apoptose des RPTC et l’expression de gènes pro-apoptotiques par rapport aux souris non-Tg. Les mêmes changements ont été observés chez les souris Tg diabétiques par rapport aux souris non-Tg diabétiques. L’insuline et/ou les inhibiteurs du RAS ont permis d’atténuer ces changements, sauf l’hypertension qui n’était réduite que par les inhibiteurs du RAS. Chez les IRPTC transfectées avec l’Agt in vitro, les hautes concentrations de glucose augmentent l’apoptose et l’activité de la caspase-3 par rapport aux cellules contrôles et l’insuline et/ou les inhibiteurs du RAS empêchent ces augmentations. En plus des changements physiologiques, les RPTC des souris Tg présentent aussi une augmentation significative de la production des espèces réactive de l’oxygène (ROS) et de l’activité de la NADPH oxydase, ainsi qu’une augmentation de l’expression du facteur de croissance transformant-beta 1 (TGF-β1), de l’inhibiteur activateur du plasminogène de type 1 (PAI-1), des protéines de la matrice extracellulaire, du collagène de type IV et de la sousunité p47 de la NADPH oxydase. Le traitement des souris Tg avec l’apocynine et le perindopril a permis d’améliorer tous ces changements, sauf l’hypertension qui n’était pas corrigée par l’apocynine. D’autre part, l’hydralazine a prévenu l’hypertension, sans modifier l’albuminurie, l’apoptose des RPTC ou l’expression des gènes pro-apoptotiques. Ces résultats montrent bien que l’activation du RAS intrarénal et l’hyperglycémie agissent de concert pour induire l’albuminurie et l’apoptose des RPTC, indépendamment de l’hypertension systémique. La génération des ROS via l’activation de la NADPH oxydase induit en partie l’action du RAS intrarénal sur l’apoptose des RPTC, la fibrose tubulo-interstitielle et l’albuminurie chez les souris Tg. D’autre part, une expérience en cours a tenté d’encore mieux délimiter les effets de l’activation du RAS intrarénal, tout en éliminant la néphrotoxicité du STZ. Pour cette étude, les souris Tg surexprimant l’Agt de rat dans leurs RPTC ont été croisées aux souris Ins2Akita, un modèle spontané de diabète de type I, afin de générer des souris Akita-rAgt-Tg. Les résultats préliminaires indiquent que le RAS intrarénal est activé dans les souris Akita et que la combinaison avec l’hyperglycémie induit du stress du réticulum endoplasmique (ER) dans les RPTC in vivo. Le stress du ER contribue à l’apoptose des RPTC observée dans le diabète, à tout le moins dans le modèle Akita. Le traitement avec des inhibiteurs du RAS permet d’atténuer certains des dommanges rénaux observés dans les souris Akita-rAgt-Tg.

Modulation du cytochrome P450 dans un modèle murin d'insuffisance rénale chronique

Introduction : Les modèles murins sont grandement utilisés dans l’étude des maladies rénales et des pathologies associées. La concentration de la créatinine sérique est un bon indicateur de la filtration glomérulaire et en présence d’insuffisance rénale chronique (IRC), les concentrations de créatinine sérique (et la clairance) reflètent la sévérité de l’IRC. De plus, il a été démontré que l’IRC modifie le métabolisme des médicaments en diminuant l’activité et l’expression des enzymes hépatiques du cytochrome P450 (CYP450). Afin d’étudier la modulation du P450 par l’IRC avec un modèle murin et de confirmer nos résultats chez le rat, nous devons 1) développer un modèle d’IRC chez la souris, 2) mettre au point une technique de dosage des marqueurs de l’IRC et, 3) évaluer l’expression protéique du CYP450 en présence IRC. Matériel et Méthode : Trois modèles chirurgicaux d’IRC chez la souris ont été développés. Une méthode du dosage de la créatinine par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) a été mise au point chez la souris et l’expression protéique du P450 a été mesurée par immunobuvardage de type Western. Résultats : Plusieurs paramètres de CLHP comme le pH, la concentration et le débit de la phase mobile modifient le pic d’élution et le temps de rétention de la créatinine. Concernant le modèle expérimental, on observe une perte de poids et une augmentation de la concentration plasmatique de la créatinine chez les souris avec une IRC. De plus, l’expression protéique de plusieurs isoformes du cytochrome P450 est modulée par l’IRC. Nous observons une diminution du CYP 2D de 42% (p < 0,01), du CYP 3A11 de 60% et du CYP 1A de 37% (p <0,01) par rapport aux souris témoins. On ne dénote aucun changement significatif au niveau de l’isoforme 2E1. Conclusion : Il est possible d’induire une insuffisance rénale chronique chez la souris suite à une néphrectomie. La technique de dosage de la créatinine par CLHP est précise et exacte et permet de caractériser la sévérité de l’IRC chez la souris. L’expression protéique du CYP450 est régulée à la baisse dans le foie des souris atteintes d’IRC.

L'étude du rôle immunomodulateur des IVIG dans un modèle murin humanisé de réaction du greffon contre l'hôte

La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) est une complication majeure des greffes de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) qui survient dans 30 à 70% des cas et peut causer la mort, malgré un traitement prophylactique bien conduit. Il existe donc une réelle demande clinique pour améliorer ces traitements prophylactiques. Parce que ces traitements prophylactiques reposent en général sur des agents immunosuppresseurs, ceux-ci contribuent à diminuer la reconstitution immunitaire du patient, ce qui a un impact défavorable sur les infections et les taux de rechute d’hémopathie maligne, et donc limite leur utilisation. Les immunoglobulines (IVIG) pourraient représenter une alternative intéressante puisqu’elles ont des propriétés immunomodulatrices et qu’elles sont de plus couramment utilisées en clinique pour traiter des patients ayant un déficit immunitaire. Leur capacité à réduire l’apparition et la sévérité de la GvHD, sans toutefois inhiber ou nuire à la reconstitution immunitaire chez le patient n’a néanmoins jamais été clairement démontrée. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer l’efficacité des IVIG à réduire l’incidence et la sévérité de la GvHD dans un modèle murin humanisé de GvHD, ainsi que de déterminer le mécanisme d’action des IVIG. Ce modèle consiste à injecter des huPBMCs à des souris immunodéprimées ne pouvant les rejeter. Les résultats obtenus suggèrent que les IVIG possèdent un effet immunomodulateur permettant de réduire les signes cliniques et de retarder l’apparition de la GvHD, tout en permettant l’apparition de cellules NK. Les IVIG agiraient de façon indirecte sur les huPBMCs afin d’induire l’apparition des cellules NK.

Modulation du cytochrome P450 par l’insuffisance rénale chronique dans un modèle murin transgénique

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une diminution de la clairance métabolique des médicaments résultant en partie de l’inhibition des cytochromes P450 (CYP450) et des enzymes de phase II, notamment la N-acétyltransférase 2 (NAT2), tel que démontré chez le rat. Nous avons précédemment démontré le rôle de l'hormone parathyroïdienne (PTH) dans la diminution des CYP450 hépatiques chez le rat souffrant d’IRC. Toutefois, l’étude des mécanismes sous-jacents pouvant être facilitée par l’utilisation de souris transgéniques, l’objectif de cette étude consiste à confirmer ces résultats dans un modèle murin. D’abord, afin de valider ce modèle expérimental, une IRC a été induite par néphrectomie subtotale 3/4 chez des souris C57BL/6, puis l’expression protéique et génique des CYP450 et de la Nat2 hépatiques a été étudiée. Les résultats indiquent que l’IRC induit effectivement une diminution d’expression de ces enzymes dans un modèle murin. Ensuite, des souris mutantes pour le gène codant la PTH (PTH-/-) et les souris correspondantes de type sauvage (PTH+/+) ont été néphrectomisées, puis l’expression protéique et génique des CYP450 hépatiques a été analysée. Si la PTH est responsable de la diminution du CYP450 en situation d’IRC, les souris PTH-/- atteintes d’IRC ne devraient présenter aucune baisse d’expression. Les résultats obtenus pour les souris PTH-/- ne peuvent être interprétés, puisque chez les souris PTH+/+ atteintes d'IRC, le CYP450 hépatique est inchangé par rapport aux souris PTH+/+ témoins. Des expériences supplémentaires seront requises afin de déterminer si la régulation à la baisse du CYP450 précédemment observée est contrecarrée par l’absence de PTH.

Étude d’un modèle murin de vieillissement sur la sténose valvulaire aortique

La sténose valvulaire aortique (SVA) est une pathologie associée au vieillissement et aux facteurs de risque cardiovasculaire. Afin d’étudier la SVA et d’explorer de nouvelles thérapies, plusieurs modèles animaux ont été récemment développés, mais la plupart de ces modèles ciblent les mécanismes de développement de la SVA reliés à l’hypercholestérolémie. Le syndrome de Werner (WS) est une maladie caractérisée par un vieillissement prématuré. Récemment, il a été découvert que des souris mutantes ayant une délétion du domaine hélicase du gène Werner, responsable du WS, démontraient un profile hémodynamique typique de la SVA. De ce fait, nous avons émis l’hypothèse que ces souris pourraient développer une SVA plus rapidement que des souris de type sauvage. Nous avons donc étudié les effets cette mutation chez des souris WrnΔhel/Δhel, en comparant le taux de progression d’une SVA entre des souris WrnΔhel/Δhel (WrnΔhel) et des souris de type sauvage comme groupe contrôle. À la suite d’une diète riche en sucre et en gras sur une période de 24 semaines, les souris WrnΔhel ont démontré une diminution plus prononcée de leur aire de valve aortique (mesures échocardiographiques) que les souris contrôles, supportée par les analyses histologiques concernant la fibrose des valves aortiques. Les souris n’ont toutefois développé aucun signe évident d’athérosclérose comme l’infiltration de lipides ou l’inflammation, bien que certaines caractéristiques liées à la dysfonction endothéliale semblent être augmentées chez les souris WrnΔhel. D’autres mesures échocardiographiques indiquant une SVA, comme une hypertrophie du ventricule gauche dans le groupe WrnΔhel, ont été obtenues. Nous avons aussi observé des indices de vieillissement plus marqués quant aux analyses sanguines et de la moelle osseuse des souris WrnΔhel en comparaison avec les souris contrôles. Par conséquent, ce modèle expérimental de vieillissement pourrait être utilisé pour les études futures sur la SVA sans les principaux effets athérogéniques des autres modèles expérimentaux.

Évaluation des désordres cardiovasculaires chez des souris bêta-thalassémiques

L’hémoglobine est une protéine contenue dans les globules rouges dont la principale fonction est le transport de l’oxygène. Chaque molécule d’hémoglobine est un tétramère constitué de deux paires de globines identiques de type α et β. La β-thalassémie est une maladie génétique hématopoïétique provenant de mutations du gène encodant l'hémoglobine. Ce désordre se caractérise par une diminution ou une absence totale de la synthèse de la chaîne β-globine résultant principalement en une anémie hémolytique sévère ainsi que des complications multisystémiques, telles que la splénomégalie, des déformations osseuses et une dysfonction hépatique et rénale. Actuellement, les transfusions sanguines chroniques représentent le traitement standard des patients β-thalassémiques. Cette thérapie nécessite l’administration conjointe d’un traitement chélateur de fer puisqu’elle entraîne une accumulation pathologique du fer, considéré à ce jour comme la source principale des complications cardiovasculaires de la β-thalassémie. Néanmoins, malgré le traitement efficace de la surcharge de fer transfusionnelle, l’insuffisance cardiaque demeure encore la principale cause de mortalité chez les patients atteints de β-thalassémie. Cette observation indique possiblement la présence d’un mécanisme complémentaire dans le développement de la physiopathologie cardiaque β-thalassémique. L’objectif du présent projet consistait donc à étudier les altérations cardiovasculaires de la β-thalassémie indépendamment de la surcharge de fer transfusionnelle. En utilisant un modèle murin non-transfusé de la β-thalassémie majeure, nous avons d’abord évalué in vivo, par méthode d’imagerie novatrice échographique à haute fréquence, les propriétés hémodynamiques vasculaires. Nos résultats d’index de Pourcelot ainsi que de résistance vasculaire périphérique totale ont démontré une perturbation de l’écoulement microcirculatoire chez les souris β-thalassémiques non-transfusées. Subséquemment, nous avons étudié la fonction endothéliale de régulation du tonus vasculaire de vaisseaux mésentériques isolés. Nos résultats ont révélé un dysfonctionnement de la réponse vasodilatatrice dépendante de l’endothélium chez les souris β-thalassémiques malgré une augmentation de l’expression de l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote ainsi qu’un remodelage de la carotide commune caractérisé par un épaississement de la paroi vasculaire. Finalement, notre étude échocardiographique de la fonction et la morphologie cardiaque a montré, chez les souris β-thalassémiques, le développement d’une hypertrophie et une dysfonction ventriculaire gauche en l’absence de transfusions sanguines chroniques ou de dépôts directs de fer dans le myocarde. L’ensemble des résultats présentés dans le cadre de cette thèse indique la présence d’une pathologie cardiovasculaire chez les souris β-thalassémiques non-transfusés. Nos travaux permettent de proposer un mécanisme de la pathophysiologie cardiovasculaire β-thalassémique, indépendant de la charge de fer transfusionnelle, impliquant les effets compensatoires d’une anémie chronique combinés à une vasculopathie complexe initiée par les érythrocytes endommagés et l’hémolyse intravasculaire.