Saúde pública e as empresas químico-farmacêuticas

O artigo trata da formação da indústria farmacêutica brasileira. Aborda algumas questões de história econômica e social, tais como o surgimento do sistema de saúde pública, as práticas de combate às doenças infecciosas, desde as desinfecções e produção de substâncias químicas pela indústria, à soroterapia e produção de soros e vacinas nas instituições de pesquisa científica públicas e nas empresas farmacêuticas privadas. Toma para análise da indústria farmacêutica privada nacional, a empresa Instituto Pinheiros - Produtos Terapêuticos S.A., enfatizando as relações entre seus cientistas, no desenvolvimento de produtos, de tecnologia e da própria discussão científica com as instituições públicas de pesquisa criadas no âmbito da política de saúde pública pelo estado de São Paulo.

Validação do processo de limpeza de tanque multiuso utilizado para formulação de vacinas

A validação de limpeza de equipamentos é requisito regulatório para assegurar que os procedimentos de limpeza removem os resíduos de produto e agente de limpeza existentes até um nível de aceitação pré-determinado, garantindo que não haja contaminação cruzada. A metodologia analítica escolhida para monitorar a ocorrência de contaminação cruzada foi a determinação de carbono orgânico total (TOC) por ser uma técnica não específica permitindo assim quantificar os resíduos antes e após o procedimento de limpeza. Para execução desta validação foi selecionado o pior caso em relação ao contaminante. A vacina Hib foi escolhida como pior caso, pois possui maior aderência ao aço inox 316L, apresentando uma menor percentagem de recuperação, quando comparada à vacina Meningite A e C, sendo respectivamente de 93,0% e 98,4% para o tempo de extração de 30 segundos e 67,8% e 72,6% para o tempo de extração de 10 segundos. O resíduo aceitável de produto em água de rinsagem foi de 0,0007 g/mL de polissacarídeo (0,49 g/mL de TOC) e em swab foi de 0,006 g/mL de polissacarídeo (3,49 g/mL de TOC). As amostras retiradas para determinação de resíduo de produto foram analisadas e corrigidas pelo fator de recuperação deste resíduo para amostras de água de rinsagem que é de 98,5% e para amostras em swab que é de 98,4%. Já o resíduo aceitável para agente de limpeza (NaOH) foi de 3,5 g/mL que fornece um pH de 9,94, porém não existem evidências que a concentração calculada de resíduo de NaOH não interferirá quimicamente ao entrar em contato com a vacina. Assim o critério adotado foi o mesmo da água para injetáveis, segundo USP que é pH entre 5 e 7. As amostras retiradas para determinação de resíduo de agente de limpeza não foram corrigidas pelo fator de recuperação uma vez que o critério utilizado é muito mais crítico que o calculado. Todas as análises realizadas apresentaram resultados dentro dos parâmetros aceitáveis permitindo a conclusão de que o procedimento de limpeza para tanque de aço inox 316L é eficiente removendo os resíduos até níveis aceitáveis, evitando assim uma contaminação cruzada

Validação de métodos analíticos - estudos de casos relevantes de atividades dos laboratórios de controle de qualidade de vacinas

A validação dos métodos de análises em situações fora da rotina, em P&D pesquisa e desenvolvimento, pode tornar-se um processo de difícil solução, em oposição àquelas de rotina, onde as concentrações são conhecidas. Nesta última situação, o método analítico é validado e aprovado com simplicidade. Apesar dos elementos de qualidade básicos para análises em P&D serem os mesmos adotados nas análises de rotina, fatores como o comportamento imprevisível da amostra, a composição desconhecida da matriz e interdependência com o analito, mesmo a incerteza a respeito da escolha do método instrumental, requer uma atenção renovada nos elementos de qualidade existentes. A razão pode ser atribuída à imprevisibilidade do procedimento analítico e a extensão do esforço adicional dos elementos de qualidade. As incertezas das análises em P&D requerem uma cuidadosa consideração do problema, assim como a disponibilidade de técnicas analíticas. Ao mesmo tempo, devem-se observar o planejamento e organização do trabalho, a supervisão do desenvolvimento analítico e a adequação dos aspectos técnico e organizacional - no trabalho de P&D, a definição de responsabilidades e a competência do corpo técnico. A garantia da qualidade nas indústrias farmacêuticas é estabelecida pelo desenvolvimento de especificações apropriadas para matérias-primas, produtos intermediários e produtos finais. A importância de especificações adequadas foi estabelecida e exemplos foram dados no desenvolvimento de especificação típica para produtos farmacêuticos, tais como a vacina e matéria prima. Isto incluiu uma discussão dos tipos de parâmetros que precisam ser controlados e uma indicação dos valores numéricos ou faixas esperadas para muitos materiais utilizados. A metrologia analítica que necessita ser aplicada para demonstrar a observância com as especificações foi discutida, com as implicações de desempenho do método para diferenciar variações na qualidade do produto e a simples variabilidade analítica. Esse trabalho foi escrito para laboratórios, com a finalidade de dar um suporte na implementação da validação de métodos analíticos e introduzir o conceito de incerteza da medida nas análises de rotina. O objetivo foi fornecer de uma maneira compreensível e prática a metodologia dos cálculos das medidas de incerteza baseados principalmente em dados de controle de qualidade e de validação já existentes. Exemplos práticos retirados diretamente do Laboratório de Metrologia e Validação, FIOCRUZ / Bio-Manguinhos, foram apresentados. Entretanto, o tratamento usado neste trabalho é genérico e pode ser aplicável a outros laboratórios químicos

Construção, clonagem e expressão do fragmento B da toxina diftérica de Corynebacterium diphtheriae (cepa PW- 8) em Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau

A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado. Por outro lado, o BCGr pUS977dtbPW8, quando submetido a seis sub-cultivos consecutivos in vitro não apresentou diferença significativa na capacidade de expressar o DTB, demonstrando portanto a persistência da estabilidade funcional da linhagem recombinante. A estabilidade estrutural da construção pUS977dtbPW8 também foi avaliada por PCR confirmando a presença do gene dtb em colônias do BCGr pUS977dtbPW8 . Adicionalmente, foi possível avaliar preliminarmente in vitro a capacidade soroneutralizante dos soros de camundongos imunizados com BCGr pUS977dtbPW8 após 30 e 60 dias em células VERO. A ação citotóxica da toxina diftérica entre as diluições de 1/4 e 1/16 foram neutralizadas com o pool de soros imunes com 60 dias. Finalmente, em nosso estudo foi possível avaliar o potencial da vacina BCG como vetor de expressão de um antígeno de Corynebacterium diphtheriae in vitro e in vivo.

Subpopulações e ativação de linfócitos T CD4+ e T CD8+ em crianças e adolescentes HIV positivos vacinados contra Neisseria meningitidis C

Neisseria meningitidis sorogrupo C (MenC) tem sido causador de surtos no Brasil, desde 2005. Vacinas conjugadas contra MenC estão disponíveis desde 1999 nos países desenvolvidos e mais recentemente no Brasil. São vacinas eficazes em pacientes imunologicamente normais, mas pouco se conhece sobre o impacto em pacientes HIV+. O objetivo principal deste estudo foi investigar se há alguma correlação entre a resposta de LT CD4+ de memória e a resposta de anticorpos específicos para o MenC, assim como conhecer as populações de memória dos LT CD8+, em crianças e adolescentes infectados pelo HIV respondedores ou não à vacina MenC conjugada. Amostras de sangue de 36 pacientes HIV+ foram coletadas antes e após imunização, para análises laboratoriais, soros e células coletadas foram congelados e enviados ao nosso laboratório para a análise da resposta imune humoral e celular. Utilizamos o ensaio bactericida para avaliar a resposta humoral e dividir a população de estudo em soroconversor positivo e soroconversor negativo. A citometria de fluxo foi aplicada para identificação das seis subpopulações de LT CD4+ e T CD8+ e avaliação do perfil de ativação. Não encontramos mudanças no perfil de distribuição das subpopulações antes e após a vacinação. A subpopulação LT CD4+ Int correlacionou positivamente com os títulos de anticorpos e a ativação, de um modo geral, estava elevada nos respondedores, conferindo certa importância para essa célula. Semelhanças foram observadas entre as subpopulações LT CD4+ e T CD8+. Em suma, este estudo revelou importantes associações entre a resposta de anticorpos bactericidas após a vacinação, o perfil de distribuição das subpopulações de LT CD4+ LT CD8+ e seu status de ativação.

Vacinas Anticárie

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Enfermidades infecciosas : alertas na escola : retorno seguro : prevención e calendario de vacinas. 'Enfermedades infecciosas : alertas en la escuela : regreso seguro : prevención y calendario de vacunas'.

Resumen basado en el de la publicación

O uso de nanoanticorpos no design de vacinas

Por volta da década de 90, foram descobertos na família Camelidae anticorpos desprovidos de cadeias leves e em que o seu domínio variável era constituído unicamente por cadeias pesadas (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3). Estes fragmentos passaram a ser conhecidos por Nanoanticorpos, não só pelo seu pequeno tamanho e flexibilidade, mas também por se tratar de uma nova geração de anticorpos terapêuticos, os quais apresentam várias vantagens face aos anticorpos convencionais, uma vez que não são imunogénicos e têm uma alta estabilidade térmica e química, entre tantas outras características inerentes. As suas aplicações são diversas: podem ser usados como tratamento e diagnóstico médico, na veiculação de fármacos e no desenvolvimento de vacinas. Uma das tecnologias moleculares mais usadas na clonagem e expressão dos Nanoanticorpos é a tecnologia de «Phage Display» que pode ser categorizada em duas vertentes: o sistema vector de fago e o sistema vector de fagemídeo. Os vectores fágicos mais usados são os bacteriófagos filamentosos, como o M13, capazes de infetar bactérias gram negativas, como a Escherichia coli. Trata-se de uma ferramenta biotecnológica poderosa e promissora, destacando-se na área da medicina.

Doença infecciosa bursal: avaliação da patogenicidade de vacinas comercializadas no Brasil em aves livres de patógenos específicos.

A doença infecciosa bursal ( DIB ) é uma enfermidade viral, que acomete galinhas provocando imunodepressão sendo, economicamente, importante para a indústria avícola. O controle da DIB é realizado através de diferentes vacinas assim como programas de vacinação. No presente trabalho, a patogenicidade de três vacinas intermediárias ( I1, I2 e I3 ), duas intermediárias mais patogênicas ( IP1, IP2 ) e três vacinas contendo vírus forte ( F1, F2 e F3 ) foi avaliada. Aves vacinadas com IP1, IP2, F1, F2 e F3 apresentaram tamanho da bolsa de Fabrício, significativamente, menor em relação ao grupo controle e aos animais vacinados com I1, I2 e I3. Por outro lado, a vacina I3 produziu título de anticorpos semelhante ao grupo controle diferindo de todas as demais vacinas. Porém I1 e I2 induziram títulos de anticorpos maiores que o grupo controle, sendo que I1 promoveu a formação de título de anticorpos semelhante à IP1, IP2, F1, F2 e F3. Os escores de lesão histopatológica mostraram que I1, I2 e I3 induziram graus similares de lesão da bolsa, sendo que I2 e I3 não diferiram do grupo controle, enquanto I1 apresentou diferença. As vacinas intermediárias mais patogênicas, assim como as vacinas“fortes“ promoveram escores de lesão, significativamente, maiores que as demais vacinas testadas. Esses resultados sugerem que as vacinas intermediárias mais patogênicas e as vacinas “fortes“ são capazes de causar severos danos na bolsa de Fabrício. Também foi possível inferir que a bursometria pode ser inadequada para a avaliação vacinal, porém pode ser utilizada na escolha da vacina para programas de vacinação. Além disso, observou-se que as vacinas “fortes“ induziram a formação de títulos de anticorpos mais altos que as demais vacinas, porém algumas vacinas intermediárias são capazes de promover títulos semelhantes.

Prevalência de anticorpos contra sarampo, caxumba e rubéola antes e após vacinação de escolares com três diferentes vacinas triplices virais

Objetivo: Avaliar a soroprevalência para sarampo, caxumba e rubéola em escolares antes e após a administração de três diferentes vacinas tríplices virais. Método: Para o presente estudo foram coletadas 692 amostras de sangue antes da vacinação e 636 amostras 21 a 30 dias após, nas quais foi realizada a pesquisa de anticorpos IgG pelas técnicas de enzimaimunoensaio (ELISA), com utilização dos kits comerciais Enzygnost® Behring, Marburg/Germany, para sarampo e caxumba, e Rubenostika® Organon Teknica, Holland, para rubéola. As amostras com resultados negativos e limítrofes para sarampo e caxumba foram posteriormente tituladas pelo teste de neutralização em placa e, as para a rubéola, pela técnica de inibição da hemaglutinação. As vacinas utilizadas foram: vacina A - E-Zagreb, L-Zagreb e Wistar RA 27/3 (Tresivac); vacina B - Moraten, J-Lynn e Wistar RA 27/3 (MMR II); e vacina C - Schwarz, Urabe AM-9 e Wistar RA 27/3 (Trimovax). Resultados: Quanto à prevalência de anticorpos IgG antes da vacinação, 79,2% (IC95%: 76,0 - 82,2) das amostras foram positivas para o sarampo. Para a caxumba e rubéola, os resultados positivos obtidos foram 69,4% (IC95%: 65,8 - 72,8) e 55,4% (IC95%: 51,6 - 59,2), respectivamente. Vinte e um a trinta dias após a administração das vacinas A, B e C, os resultados de soropositividade foram de 100,0%, 99,5% e 100,0%, respectivamente, para sarampo, 99,5%, 94,5% e 92,5% para a caxumba e 92,6%, 91,3% e 88,2% para a rubéola. Conclusões: Os resultados de soroprevalência antes da administração das vacinas permitem considerar que: (a) na amostra de escolares vacinados para o sarampo, uma proporção de 20,8% dos sujeitos apresentaram níveis de anticorpos insuficientes (13,0% negativos e 7,8% limítrofes) para proteção de doença clínica, e (b) na amostra de escolares sem vacinação prévia para caxumba e rubéola, encontrou-se proporções de 30,7% e 44,6% de sujeitos suscetíveis, respectivamente. As três vacinas tríplices virais mostraram ser imunogênicas para sarampo, caxumba e rubéola, com níveis ótimos de soroconversão, tendo a vacina A (Tresivac - SII) evidenciado taxa de 99,5% de soroconversão para o componente da caxumba, com diferença estatisticamente significativa em relação às outras duas (P<0,01).

Análise de vacinas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de marek por PCR em tempo real e cultivo celular.

A doença de Marek (MD), causada por um alfaherpesvírus, é uma enfermidade linfoproliferativa que acomete principalmente galinhas. Como não existe tratamento, a melhor forma de prevenção e controle da MD é através do uso de vacinas atenuadas, que vêm sendo usadas desde 1970. Este trabalho descreve a análise de vacinas vivas congeladas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de Marek (herpesvírus de peru – HVT) por PCR em tempo real (qPCR) e por cultivo em células de embrião de galinha. Foram avaliadas três vacinas (cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. As análises da homogeneidade inter e intra-lote apresentaram, respectivamente, média ± desvio padrão de 2,6 ± 1,7%, 2,1 ± 1,1% e 1,2 ± 0,1% e média ± desvio padrão de 1,5 ± 0,1%, 1,2 ± 0,8% e 1,0 ± 0,3% para A, B e C, respectivamente. A qPCR subestimou os títulos das vacinas concentradas 4x e superestimou os títulos das vacinas diluídas 8x, enquanto o cultivo celular superestimou os títulos das vacinas concentradas. As vacinas apresentaram quantidades diferentes de células/dose e unidade formadoras de placa/dose. Conseqüentemente, a relação PFU/célula também foi diferente, o que demonstra a necessidade de construção de curvas diferentes, para cada fabricante, para a titulação por qPCR.

Titulação de vacinas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de marek por pcr em tempo real

A Doença de Marek é uma enfermidade linfoproliferativa das aves, causada por um alfaherpesvírus e caracterizada pela infiltração de células em nervos periféricos, gônadas, íris, vísceras, músculos e pele. Desde 1970, vacinas atenuadas têm sido utilizadas como ferramenta principal no controle da doença. Esse trabalho descreve a implantação da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) para a titulação de vacinas contra o vírus da doença de Marek do sorotipo 3, herpesvírus dos perus (HVT). A qPCR foi comparada com a técnica tradicional de titulação, baseada no cultivo celular de fibroblastos de embrião de galinha. Foram avaliadas três vacinas vivas (congeladas, cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. A técnica molecular apresentou alta correlação entre os valores de threshold cycle (CT) e respectivas diluições das vacinas (R2 = 0,99), indicando que, dentro desta faixa linear testada (102 a 104 PFU/dose), a qPCR foi capaz de quantificar as vacinas disponíveis no mercado. A reprodutibilidade da titulação em cultivo celular e qPCR foi avaliada pela realização dos testes em três dias distintos a partir de ampolas de um mesmo lote da vacina. Os títulos obtidos por ambos os métodos demonstraram alta reprodutibilidade e coerência com o fornecido pelo fabricante. Caracterizou-se também a proporção de vírus livres e associados às células, onde foi observado que, pelo menos, 90% dos vírus encontravamse na forma associada. Este trabalho indicou que a qPCR é reprodutível, rápida e menos trabalhosa do que a titulação em cultivo celular tradicionalmente utilizada.

Obtenção e avaliação da proteína BYC (Boophilus Yolk pro-Cathepsin) recombinante em uma vacina contra o carrapato Boophilus microplus

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grande prejuízo à pecuária. O principal método de controle deste parasita baseia-se no uso de acaricidas, entretanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle promissor. A Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese que foi anteriormente testada como imunógeno vacinal. Neste estudo, o cDNA da BYC foi amplificado por PCR e clonado em dois vetores de expressão para produção de duas formas da proteína recombinante com cauda de histidina, rBYC e rBYC-Trx (fusionada com tioredoxina). As duas formas foram expressas em Escherichia coli na forma de corpúsculos de inclusão (CI) e comparadas quanto ao nível de expressão, solubilidade e rendimento na purificacão. Três agentes desnaturantes (N-lauroil sarcosina, hidrocloreto de guanidina e uréia) foram testados para solubilização dos CIs. Sarcosina foi o agente mais eficiente, solubilizando mais de 90 % de rBYC-Trx e rBYC. As duas proteínas recombinantes foram purificadas em cromatografia de afinidade por metal (Ni2+), sob condições desnaturantes. O rendimento na purificação da proteína solúvel foi de 84 % para r-BYC-Trx e 6 % para rBYC. As duas formas foram reconhecidas por soro de coelhos, camundongos e bovinos previamente imunizados com BYC nativa, demonstrando a existência de epítopos comuns entre a BYC nativa e as formas recombinantes expressas em E. coli. Para verificar o potencial vacinal da proteína recombinante, um grupo de bovinos Hereford foi imunizado com rBYC e desafiado com 20.000 larvas de B. microplus por animal. Os soros dos bovinos imunizados reconheceram a BYC nativa em ELISA e “Western blot”, com títulos entre 500 e 4.000. Os resultados do desafio mostraram uma proteção parcial contra a infestação, com 25 % de proteção global. O perfil de expressão de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ) foi verificado por RT-PCR, porém os resultados não permitiram identificar a polarização da resposta imune em Th1 ou Th2. Os resultados de imunoproteção obtidos com a BYC recombinante foram similares aos obtidos na imunização de bovinos com BYC nativa, indicando a possibilidade de uso da forma recombinante como imunógeno vacinal.

Caracterização e correlação do fenômeno pró-zona com títulos de sororeatividade do VDRL e reação de imuno- fluorescência indireta em soros de pacientes com sífilis

AZEVEDO, Luciana Karla Araújo de, et al. Caracterização e correlação do fenômeno pró-zona com títulos de sororeatividade do VDRL e reação de imuno-fluorescência indireta em soros de pacientes com sífilis. Revista Brasileira de Análises Clínicas, Rio de Janeiro, v. 38, n. 2, p. 183-187, 2006.

Títulos de anticorpos aglutinantes induzidos por vacinas comerciais contra leptospirose bovina

No presente estudo, 100 fêmeas bovinas foram divididas em cinco grupos de 20 animais cada. Os grupos experimentais receberam quatro diferentes vacinas comerciais (B, C, D e E), e um grupo permaneceu como controle. Amostras foram colhidas no dia da aplicação da primeira dose e nos dias 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 120, 150 e 180 pós-vacinação (PV). A triagem dos animais foi feita pela análise sorológica com 6 antígenos de leptospiras, escolhendo-se os animais não reagentes. Os títulos de anticorpos foram monitorados pela soroaglutinação microscópica (SAM) com os sorovares Canicola, Grippotyphosa, Hardjo, Icterohaemorrhagiae, Pomona e Wolffi. Todas as vacinas induziram, aos 3 dias PV, títulos de anticorpos aglutinantes para os sorovares Hardjo e Wolffi, que persistiram até o 150º dia PV. Os sorovares Hardjo e Wolffi induziram os maiores títulos de anticorpos aglutinantes. A vacina D, apesar de não possuir o sorovar Wolffi em sua composição foi capaz de induzir anticorpos aglutinantes contra este sorovar. Somente foram detectados anticorpos contra o sorovar Canicola nos animais vacinados com a bacterina D. A vacina que induziu os maiores títulos médios de anticorpos, considerando todos os sorovares testados foi a D.