Seqüenciamento de peptídeos usando espectrometria de massas: um guia prático

This paper introduces the basics of peptide mass spectra interpretation applied to proteomics and is directed to chemists, biochemists and biologists. The manuscript presents a well detailed protocol aiming to serve as a first choice guide for understanding peptide sequencing. The tutorial was elaborated based on both a thorough bibliographic revision and the author's experience. In order to prove the applicability of the proposed guide, spectra obtained on different instruments have been successfully interpreted by applying the presented rational.

Classificação taxonômica das estirpes de rizóbio recomendadas para as culturas da soja e do feijoeiro baseada no seqüenciamento do gene 16S rRNA

As culturas da soja [Glycine max (L.) Merrill] e do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) são de grande importância econômica e social para o Brasil e ambas podem ter seu requerimento de nitrogênio suprido pela simbiose com bactérias da ordem Rhizobiales. Para garantir a maximização do processo biológico, deve-se proceder à inoculação de estirpes de rizóbio eficientes e competitivas, recomendadas pela pesquisa. No Brasil, foram comercializados, na safra 2001/2002, 14 milhões de doses de inoculantes, dos quais 99 % para as culturas da soja e do feijoeiro. Neste trabalho, determinou-se a posição taxonômica das estirpes utilizadas em inoculantes comerciais para as duas culturas, pelo seqüenciamento da região do DNA que codifica o gene 16S rRNA, que é suficientemente variável, mas carrega as informações necessárias para permitir a análise filogenética de bactérias. O seqüenciamento permitiu definir que duas das estirpes recomendadas para a cultura da soja, SEMIA 587 e SEMIA 5019 (= 29 w), pertencem à espécie Bradyrhizobium elkanii e as duas outras, SEMIA 5079 (=CPAC 15) e SEMIA 5080 (= CPAC 7), à espécie B. japonicum. Determinou-se, ainda, que a estirpe SEMIA 4080 (=PRF 81), recomendada para o cultura do feijoeiro, pertence à espécie Rhizobium tropici. As seqüências obtidas foram depositadas no banco mundial de genes do National Center for Biotechnology Information.

Seqüenciamento de peptídeos usando espectrometria de massas: um guia prático

This paper introduces the basics of peptide mass spectra interpretation applied to proteomics and is directed to chemists, biochemists and biologists. The manuscript presents a well detailed protocol aiming to serve as a first choice guide for understanding peptide sequencing. The tutorial was elaborated based on both a thorough bibliographic revision and the author's experience. In order to prove the applicability of the proposed guide, spectra obtained on different instruments have been successfully interpreted by applying the presented rational.

Seqüenciamento e variabilidade do fragmento genômico de Xylella fastidiosa amplificado pelos iniciadores RST31/33

Xylella fastidiosa é agente causal de diversas doenças de importância econômica como a clorose variegada dos citros (Citrus spp.) (CVC), mal de Pierce da videira (Vitis vinifera), escaldadura da ameixeira (Prunus salicina) e requeima do cafeeiro (Coffea arabica). A seqüência nucleotídica do fragmento genômico, específico de X. fastidiosa, amplificado pelo par de iniciadores RST31/33 foi determinada para 38 isolados de citros e para isolados de videira, cafeeiro e ameixeira objetivando avaliar o nível de polimorfismo entre isolados e a identidade genômica do fragmento. Não foi observado polimorfismo de seqüência nucleotídica entre isolados de citros, mas foi detectado polimorfismo entre isolados de citros e de videira, cafeeiro e ameixeira. A presença do sítio de clivagem RsaI, que distingue isolados de citros e videira de isolados de ameixeira e outras espécies arbóreas, foi identificada em um isolado de ameixeira proveniente dos EUA mas não em outro proveniente do Brasil.

Análise da sensibilidade do seqüenciamento de lavra em função da incerteza do modelo geológico

Quantificação de incerteza e risco tem aplicação direta no projeto de limites de cava e na programação de produção. Pequenas variações nas condições de contorno de um projeto podem ter impacto significativo sobre o retorno final do mesmo na ordem de milhões de dólares. Preço de mercado do bem mineral, o custo de capital, taxas de atratividade, etc, são fatores usualmente testados para analisar a viabilidade de um empreendimento, porém, raramente é considerada a incerteza relacionada ao atributo geológico em questão. O propósito de um planejamento de lavra tem sido prover subsidio para o engenheiro de minas decidir sobre a capacidade de minerar determinadas unidades de lavra do depósito a partir de teores estimados. Salienta-se porém que existe, a partir dos dados amostrais, incertezas a respeito do modelo geológico que devem ser consideradas ao se projetar uma cava e desenvolver a lavra. A simulação geoestatistica tem a capacidade de produzir múltiplos modelos equiprováveis, os quais podem ser avaliados independentementecomo possíveis cenários do depósito mineral. Simulação condicional, ao contrário de técnicas de interpolação e estimativa, provê respostas para questões associadas a risco devido à variações nos teores do modelo geológico. Ao gerar múltiplos cenários tem-se acesso à probabilidade e conseqüentemente às variações de retorno financeiro e rotas de extração de minério de um projeto. o presente trabalho tem como objetivo a investigação de novas metodologias que contribuam para a construção de cenários de planejamento de lavra e avaliação do impacto provocado nestes pela incerteza fornecida a partir de modelos simulados. As respostas buscadas dentro da abordagem sugerida por esse trabalho, compreendem a definição de uma metodologia para controle e planejamento de lavra a médio e longo prazo por incorporação da flutuabilidade local associada ao minério, avaliando a sensibilidade do retorno financeiro e o traçado de lavra em relação ao método de geração do modelo geológico de teores. Para solucionar o problema em questão, sugere-se a geração de modelos estocásticos e a alimentação de múltiplos modelos selecionados por critérios considerados relevantes para a delimitação do espaço de incerteza. A aplicação de funções de transferência tais como mudança de suporte e seqüenciamento de produção sobre os modelos simulados é a chave para a obtenção de respostas a respeito do impacto sobre a lucratividade de um projeto. Ao alimentar à essas funções modelos equiprováveis que preservam as características estatísticas e a conectividade espacial dos dados amostrais mas que invariavelmente possuem diferentes distribuições de teores tem-se a dimensão em termos econômicos do risco associado à incerteza geológica. Foi confrontado o retorno financeiro produzido por modelos simulados e verificou-se para o caso especifico que os métodos de simulação geoestatistica empregados não produziram diferenças significativas quando comparados casos selecionados segundo os mesmos critérios. Porém, entre cenários extremos gerados pelo mesmo algoritmo de simulação foram verificadas desigualdades relevantes. Verificou-se também a transferência de minério entre diferentes classes de qualidade ao proceder-se com variações nas dimensões dos blocos de lavra.

Biologia do gene pheA de Mycobacterium tuberculosis : clonagem, seqüenciamento e superexpressão do seu produto - a proteína prefenato desidratase

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Seqüenciamento de peptídeos usando espectrometria de massas: um guia prático

This paper introduces the basics of peptide mass spectra interpretation applied to proteomics and is directed to chemists, biochemists and biologists. The manuscript presents a well detailed protocol aiming to serve as a first choice guide for understanding peptide sequencing. The tutorial was elaborated based on both a thorough bibliographic revision and the author's experience. In order to prove the applicability of the proposed guide, spectra obtained on different instruments have been successfully interpreted by applying the presented rational.

Estudo populacional de Anopheles darlingi utilizando análise de RAPD e seqüenciamento de genes mitocondriais

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Complementação do seqüenciamento do genoma do Southern bean mosaic virus, isolado São Paulo, expressão da porção C-terminal da polimerase e produção de anti-soro policlonal

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Identificação de estirpes de rizóbios por seqüenciamento parcial dos genes 16S rDNA e nifH

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Proteína capsidial do Rupestris stem pitting-associated vírus: seqüenciamento do gene, expressão em Escherichia coli, purificação e produção de anti-soro policlonal

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Identificação de comunidades bacterianas de solo por seqüenciamento do gene 16S rRNA

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Variabilidade genética de três colônias de Triatoma rubrovaria (Blanchard, 1843), (Hemiptera, Reduviidae), oriundas do estado do Rio Grande do Sul, avaliadas por meio do seqüenciamento de genes do DNA mitocondrial e ribossomal

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Seqüenciamento e expressão da trombopoietina canina

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)