Preparació de materials monolítics quirals contenint derivats de poli-4R-hidroxi-L-prolina per a la separació de molècules enantiomèriques per cromatografia líquida

Projecte de recerca elaborat a partir d’una estada a la Universitat de California a Berkeley, Estats Units, entre març i juny de 2007. La cromatografia líquida emprant fases estacionàries quirals ha estat una de les tècniques més desenvolupades per a la separació d’enantiòmers. A més de presentar una elevada enantioselectivitat, és desitjable que els materials utilitzats amb aquesta finalitat permetin separacions altament cost-efectives. Una alternativa a l’us de mètodes més convencionals, en què el selector quiral està ancorat sobre gel de sílice particulada, és la utilització de materials monolítics, que es caracteritzen per ser d’una sola peça i altament porosos. L’elevada porositat d’aquests materials, una de les característiques que els fan més útils, permet treballar amb un flux de fase mòbil molt superior al permès amb les matrius convencionals. Aquest fet permet disminucions considerables dels temps d’anàlisi amb pressions de columna molt inferiors als límits establerts per garantir la seva durabilitat. D’altra banda, l’enantioselectivitat i la resolució vers als diferents analits es manté constant. El projecte, de quatre mesos de durada, s’ha centrat en la preparació de materials monolítics quirals de naturalesa orgànica o inorgànica contenint com a selectors quirals derivats de poli-hidroxi-prolina. Aquest materials s’han aplicat com a fases estacionàries quirals en cromatografia líquida en format estàndard i capil•lar. Els resultats cromatogràfics (selectivitat i eficiència) s’han comparat amb els obtinguts amb columnes de matriu particulada preparades prèviament.

Preparació, estudi estructural i aplicabilitat de derivats de Poli-(4R)-hidroxi-L-prolina a la separació d’enantiòmers per tècniques cromatogràfiques o relacionades

La separació d’enantiòmers (isòmers òptics) és molt important en molts diversos camps, com les síntesis quirals, biologia, i en el camp de la farmacologia especialment. És per això, que es fa necessari de disposar de tècniques i mètodes analítics ràpids, fiables i sensibles per a la separació d’enantiòmers. La present tesi s’emmarca en el camp de la separació d’enantiòmers, concretament en la preparació de fases estacionàries quirals per al seu ús en cromatografia liquida. En aquest sentit, s’ha desenvolupat la síntesi i caracterització de molècules polimèriques quirals derivades de l’aminoàcid L-prolina que incorporades en matrius de gel de sílice poden constituïr columnes quirals per a la separació d’enantiòmers per cromatografia liquida. S’han estudiat les característiques enantioselectives d’aquests nous materials en la separació de molècules quirals, trobant-se ésser satisfactòriament enantioselectius. L’interès que suscita l’obtenció d’enantiòmers a gran escala fa que la recerca s’orienti a la recerca de materials amb elevada capacitat de càrrega, és a dir, que puguin donar lloc a la separació d’elevades quantitats d’enantiòmers. Amb aquesta finalitat s’han dut a terme assaigs de capacitat de càrrega, que han posat de manifest la possible aplicació d’aquests materials a la separació preparativa d’enantiòmers. També s’ha parat especial atenció a l’estudi de les característiques de la matriu de gel de sílice, assajant-se altres materials de sílice més porosos i que permeten així treballar amb fluxos més elevats tot reduint-ne el temps d’anàlisi i els costos associats a la separació preparativa d’enantiòmers. L'estudi conformacional d'aquests nous selectors també ha estat contemplat per tal d'explicar l'enantioselectivitat específica que s'observa en certs dissolvents orgànics en els qual es duu a terme la separació dels enantiòmers.

Variação nos níveis de prolina, diamina e poliaminas em cultivares de trigo submetidas a déficits hídricos

O objetivo deste trabalho foi avaliar duas cultivares de trigo (Triticum aestivum L.) Anahuac e IAC-24, cultivadas em solo arenoso, sob três regimes de umidade do solo (-0,027 a -0,1 MPa; -0,027 a -0,045 MPa; e -0,027 MPa -- irrigação constante). Foram analisadas as variações nos níveis de prolina, da diamina (putrescina) e das poliaminas (espermina e espermidina) e o teor relativo de água (TRA) durante o perfilhamento, emborrachamento, floração e no enchimento dos grãos. Nas plantas submetidas a déficits hídricos foi verificada menor TRA e acúmulo de prolina e putrescina; em relação às poliaminas não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Nos tratamentos sob déficit hídrico, a cultivar IAC-24 apresentou teores mais elevados de prolina e putrescina, o mesmo sendo verificado com a cultivar Anahuac quando submetida a tratamento sem déficit hídrico.

Influência da disponibilidade hídrica e da acidez do solo no teor de prolina livre de guandu

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, no teor de prolina livre da parte aérea das cultivares de guandu, IAPAR 43-Aratã e IAC Fava Larga. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2x3x4 (cultivar x disponibilidade hídrica x acidez), com quatro repetições. Em condições de restrição hídrica severa, a cultivar IAC Fava Larga pode ser considerada tolerante, em virtude do maior acúmulo de prolina livre. A presença de alumínio no solo, associada à restrição hídrica severa, apresentou efeito sinergístico sobre os teores de prolina livre.

Produção de prolina e suscetibilidade ao glufosinato de amônio em plantas transgênicas de citrumelo Swingle

O objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade de plantas transgênicas de citrumelo Swingle com elevada produção de prolina, ao herbicida glufosinato de amônio. As plantas utilizadas apresentavam a inserção do gene mutante da enzima delta1-pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS), responsável pela biossíntese de prolina. A expressão do gene p5cs em plantas transgênicas causou aumento nas quantidades de prolina em tecidos foliares, em até cinco vezes, quando comparadas às plantas-controle tratadas com 200 µM de glufosinato de amônio. As plantas transgênicas acumularam maior quantidade de NH4+ nas folhas, em relação às plantas não-transgênicas. Os danos causados pelo herbicida foram avaliados in vitro, utilizando-se discos foliares cultivados em meio MS com diferentes concentrações de glufosinato de amônio. Observou-se maior clorose em discos foliares das plantas transgênicas, o que comprova a maior suscetibilidade de plantas de citrumelo Swingle com alta produção de prolina ao herbicida.

Crescimento e conteúdo de prolina em plântulas de guandu submetidas a estresse osmótico e à putrescina exógena

O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito da aplicação da poliamina putrescina no acúmulo de prolina e no crescimento inicial de plântulas de guandu cultivadas sob estresse hídrico ou salino, e avaliar se esta poliamina pode ser usada como atenuadora desses estresses. Sementes de duas cultivares de guandu, BRS Mandarim e Caqui, foram germinadas em caixas gerbox forradas com papel de filtro umedecido com 0,0, -0,2, -0,3, -0,4, -0,5 MPa de PEG 6000 ou 0, 20, 40, 60, 80 e 120 mmol L-1 de NaCl, na ausência (0 mmol L-1) ou na presença (0,5 mmol L-1) de putrescina. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2x5x2 e 2x6x2 (duas cultivares, cinco níveis de deficiência hídrica ou seis níveis de estresse salino, e presença ou ausência de putrescina), com quatro repetições. O crescimento das plântulas é acentuadamente reduzido pelas condições de restrição hídrica e salinidade. A putrescina exógena incrementa, sob ambos os estresses, os teores de prolina nas plântulas de guandu, especialmente na cultivar BRS Mandarin, e atenua os efeitos da deficiência hídrica moderada nas cultivares estudadas. Os estresses de restrição hídrica e de salinidade causam acúmulo de prolina na parte aérea e nas raízes de ambas as cultivares. A prolina pode ser considerada um bom indicador bioquímico e fisiológico desses estresses em plântulas de guandu.

Rustificação de plantas de Eucalyptus dunnii Maiden e a relação entre as concentrações de carboidratos solúveis totais e de prolina foliar e a tolerância ao frio

O objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito da aclimatação sobre a tolerância ao frio de mudas de Eucalyptus dunnii Maiden (clone K-1007) e a relação entre a tolerância ao frio e as concentrações foliares de carboidratos solúveis totais e de prolina. O delineamento experimental utilizado foi de blocos ao acaso com quatro repetições. Os tratamentos consistiram de diferentes períodos de aclimatação (0, 7, 21 e 42 dias de exposição às plantas a temperaturas diurnas de 5 ºC e noturnas de 1 ºC). Após cada período de aclimatação, as mudas foram submetidas a quatro gradientes de temperatura negativas (-2 ºC, -4 ºC, -6 ºC e -8 ºC), por 3 h cada gradiente. Após cada período de aclimatação, foram avaliadas as concentrações foliares de carboidratos solúveis totais e prolina. Após cada gradiente de temperatura negativa, foram coletadas amostras foliares para a avaliação da temperatura letal de 50% (TL50). Os dados foram submetidos à análise de regressão linear e teste de correlação de Pearson. As mudas de E. dunnii apresentaram aumento nos teores de carboidratos solúveis até 28 dias de aclimatação; após esse período, as concentrações permaneceram estáveis. Observou-se correlação negativa entre a temperatura letal de 50% (TL50) e a concentração de carboidratos solúveis totais no tecido foliar. Dessa forma, observou-se aumento na tolerância ao frio com o aumento dos teores de carboidratos solúveis no período de aclimatação de até 28 dias.

Efeito dos cofatores hidroquinona, prolina e triptofano no enraizamento de miniestacas de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla

Este estudo teve como objetivo avaliar a eficiência dos cofatores hidroquinona, prolina e triptofano, associados ao regulador de crescimento AIB (ácido indolbutírico) na propagação vegetativa pelo enraizamento de miniestacas de quatro clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla. As miniestacas foram coletadas no minijardim clonal realizado em sistema de hidroponia em canaletas. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, constituído de quatro concentrações para cada cofator e quatro clones, em quatro repetições e parcelas compostas de 16 plantas/repetição. Foram realizadas avaliações na casa de vegetação, casa de sombra e ao sol nas miniestacas enraizadas. Concluiu-se que o triptofano (0,8 mg L-1) e a hidroquinona (0,2 a 0,4 mg L-1), aplicados associados ao AIB, melhoraram o enraizamento em três clones dos quatro clones avaliados; enquanto a prolina (0,2 a 0,4 mg L-1), aplicada associada ao AIB, promoveu melhoria expressiva no enraizamento das miniestacas nos quatros clones estudados, evidenciando ser entre os cofatores testados o mais eficiente.

Efecto de estrés inducido con NaCI, Cu²? y Fe²? en biomasa, timol, carvacrol y prolina en orégano mexicano (lippia graveolens H.B.K.).

Tesis (Doctorado en Ciencias con Acentuación en Química de Productos Naturales) UANL, 2012.

Efeitos in vitro e in vivo da prolina sobre a atividade da creatinaquinase em encéfalo de ratos jovens

Hiperprolinemia tipo II é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado pela deficiência de ∆1 pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, levando ao acúmulo de prolina no plasma e nos tecidos. Embora sintomas neurológicos ocorram em diversos pacientes, a neurotoxicidade da prolina ainda é controversa. O principal objetivo do presente estudo foi investigar o efeito das administrações aguda e crônica de prolina na atividade da creatinaquinase em córtex, cerebelo e encéfalo médio de ratos Wistar. No tratamento agudo, uma única injeção subcutânea de prolina foi administrada em ratos de 22 dias de vida. No tratamento crônico, a prolina foi administrada quatro vezes ao dia, do 6o ao 21o dia de vida. Os resultados mostraram que a atividade da creatinaquinase foi inibida significativamente nas três estruturas dos ratos submetidos à administração aguda de prolina. Por outro lado, a atividade da enzima aumentou nos animais submetidos à administração crônica. Também foi investigado o efeito in vitro da prolina sobre a atividade da creatinaquinase nas mesmas estruturas encefálicas em ratos de 22 dias não tratados. A prolina inibiu significativamente a atividade da creatinaquinase. Considerando a importância da creatinaquinase na manutenção da homeostase energética encefálica, é possível que a alteração da atividade dessa enzima no encéfalo possa ser um dos mecanismos pelo qual a prolina deva ser neurotóxica.

Efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da Na+, K+-ATPase de cérebro de ratos

A hiperprolinemia tipo II é um erro inato do metabolismo de aminoácido causado pela deficiência na atividade da Ä1 pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de prolina. A doença caracteriza-se fundamentalmente por epilepsia, convulsões e um grau variável de retardo mental, cuja etiopatogenia ainda é desconhecida. No tecido nervoso, a Na+, K+ - ATPase controla o ambiente iônico relacionado com a atividade neuronal, regulando o volume celular, o fluxo de íons e o transporte de moléculas ligadas ao transporte de Na+, tais como, aminoácidos, neurotransmissores e glicose. Evidências na literatura mostram que recém nascidos humanos com baixos níveis de Na+, K+ -ATPase cerebral apresentam epilepsia e degeneração espongiforme. Alterações na atividade desta enzima têm sido associadas a várias doenças que afetam o sistema nervoso central, como isquemia cerebral e doença de Parkinson. Considerando que a inibição da Na+, K+ - ATPase por ouabaína tem sido associada com liberação de neurotransmissores, incluindo glutamato, em uma variedade de preparações neuronais, e que alguns autores sugerem que o efeito da prolina sobre a sinapse glutamatérgica possa ser, pelo menos em parte, responsável pelos sintomas neurológicos encontrados nos pacientes com hiperprolinemia, no presente trabalho verificamos efeitos dos modelos experimentais agudo e crônico de hiperprolinemia tipo II sobre a atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo de ratos. No modelo crônico, a prolina foi administrada a ratos Wistar duas vezes ao dia do 6o ao 28o dia de vida, enquanto que no modelo agudo os animais, com 15 dias de vida, receberam uma única injeção de prolina e foram sacrificados 1hora após a administração da droga. Os animais tratados crônicamente com prolina não apresentaram alterações significativas no peso corporal, do encéfalo, do hipocampo e do córtex cerebral, bem como nas quantidades de proteínas do homogenizado cerebral e da membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo. Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa na atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de cérebro de animais tratados aguda e crônicamente com prolina. Foram também testados os efeitos in vitro da prolina e do glutamato sobre a atividade da Na+, K+- ATPase. Os resultados mostraram que os dois aminoácidos, nas concentrações de 1,0 e 2,0 mM, inibiram significativamente a atividade da enzima. O estudo da interação cinética entre prolina e glutamato, sugere a existência de um sítio único de ligação na Na+, K+ - ATPase para os dois aminoácidos. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais a prolina é neurotóxica. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes com hiperprolinemia tipo II.

Influência da disponibilidade hídrica e da acidez do solo no teor de prolina livre de guandu

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da disponibilidade hídrica e da acidez do solo, no teor de prolina livre da parte aérea das cultivares de guandu, IAPAR 43-Aratã e IAC Fava Larga. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2x3x4 (cultivar x disponibilidade hídrica x acidez), com quatro repetições. em condições de restrição hídrica severa, a cultivar IAC Fava Larga pode ser considerada tolerante, em virtude do maior acúmulo de prolina livre. A presença de alumínio no solo, associada à restrição hídrica severa, apresentou efeito sinergístico sobre os teores de prolina livre.

Variação nos níveis de prolina, diamina e poliaminas em cultivares de trigo submetidas a déficits hídricos

O objetivo deste trabalho foi avaliar duas cultivares de trigo (Triticum aestivum L.) Anahuac e IAC-24, cultivadas em solo arenoso, sob três regimes de umidade do solo (-0,027 a -0,1 MPa; -0,027 a -0,045 MPa; e -0,027 MPa -- irrigação constante). Foram analisadas as variações nos níveis de prolina, da diamina (putrescina) e das poliaminas (espermina e espermidina) e o teor relativo de água (TRA) durante o perfilhamento, emborrachamento, floração e no enchimento dos grãos. Nas plantas submetidas a déficits hídricos foi verificada menor TRA e acúmulo de prolina e putrescina; em relação às poliaminas não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Nos tratamentos sob déficit hídrico, a cultivar IAC-24 apresentou teores mais elevados de prolina e putrescina, o mesmo sendo verificado com a cultivar Anahuac quando submetida a tratamento sem déficit hídrico.

ATIVIDADE DE PEROXIDASES (EC 1.11.1.7) E TEOR DE PROLINA em FEIJOEIRO Phaseolus vulgaris L. CULTIVADO em CONDIÇÕES DE SALINIDADE

Alterações nos níveis de prolina e na atividade da peroxidase foram estudadas em folhas e raízes de feijoeiro em função da resposta à salinidade do meio. A atividade da peroxidase (E.C. 1.11.1.7) e o teor de prolina das folhas foi maior do que nas raízes. Os resultados mostraram que a atividade da peroxidase diminuiu, enquanto os teores de prolina aumentaram gradualmente nas plantas cultivadas em meio salino. Ocorreu diminuição do teor de potássio e aumento de sódio nos órgãos analisados, com o aumento da concentração salina.

ATIVIDADE DE PEROXIDASES (EC 1.11.1.7) E TEOR DE PROLINA NO EMBRIÃO E COTILÉDONES DE FEIJOEIRO Phaseolus vulgaris L. em CONDIÇÕES DE SALINIDADE

Os efeitos da salinidade sobre a atividade de peroxidases foram acompanhadas no embrião e em cotilédones de feijoeiro Phaseolus vulgaris L. cv. Carioca, observando-se em ambos, aumento na atividade das enzimas. Com relação ao teor de prolina, ocorreu decréscimo constante no embrião de feijoeiro cultivado em condições salinas, entretanto, nos cotilédones, verificou-se aumento progressivo em condições de presença ou ausência de salinidade.