Identification of the p28 subunit of eukaryotic initiation factor 3(eIF3k) as a new interaction partner of cyclin D3.

Cyclin D3 is found to play a crucial role not only in progression through the G1 phase as a regulatory subunit of cyclin-dependent kinase 4 (CDK 4) and CDK 6, but also in many other aspects such as cell cycle, cell differentiation, transcriptional regulation and apoptosis. In this work, we screened a human fetal liver cDNA library using human cyclin D3 as bait and identified human eukaryotic initiation factor 3 p28 protein (eIF3k) as a partner of cyclin D3. The association of cyclin D3 with eIF3k was further confirmed by in vitro binding assay, in vivo coimmunoprecipitation, and confocal microscopic analysis. We found that cyclin D3 specifically interacted with eIF3k through its C-terminal domain. Immunofluorescence experiments showed that eIF3k distributed both in nucleus and cytoplasm and colocalized with cyclin D3. In addition, the cellular translation activity in HeLa cells was upregulated by cyclin D3 overexpression and the mRNA levels are constant. These data provide a new clue to our understanding of the cellular function of cyclin D3.

Caractérisation du motif acidique de la sous-unité p28 de l’IL-27 et étude des propriétés partagées entre cette protéine, le CNTF, CLC/CLF et l’interleukine-6

L’interleukine 6 (IL-6) est une cytokine qui joue un rôle essentiel dans l’inflammation. Son récepteur (IL-6R) est composé de la chaîne non signalétique IL-6Rα et de la chaîne transductrice du signal gp130, commune aux cytokines de la famille IL-6. La liaison de l’IL-6 à son récepteur permet l’activation de plusieurs voies de signalisation, notamment des voies Jak/STAT1 et préférentiellement Jak/STAT3. De façon complémentaire, nous avons démontré que l’IL-6 est capable d’activer la voie Jak/STAT5 dans les lymphocytes T CD4. L’activation de cette voie de signalisation pourrait être impliquée dans le rétrocontrôle des effets pro-inflammatoires de l’IL-6 sur les cellules T CD4. Le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) et la « cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 » (CLC/CLF) sont deux cytokines de la famille de l’IL-6 qui signalent à travers un récepteur commun, le récepteur au CNTF (CNTFR), composé du CNTFRα, « leukaemia inhibitory factor receptor β » (LIFRβ) et gp130. Toutes deux exercent des actions au niveau du système immunitaire, or la chaîne CNTFRα de leur récepteur n’y est pas exprimée. Il a été montré que le CNTFR humain peut également activer un récepteur formé des sous-unités IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Nous avons comparé les effets du CNTF et du CLC/CLF de souris sur des transfectants exprimant LIFRβ et gp130 et les chaines α connues de la famille IL-6 (IL-6Rα, IL-11Rβ et CNTFRα). Nos résultats indiquent que le CNTF de souris, comme le CNTF humain est capable d’activer un récepteur formé de l’IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Toutefois cette propriété n’est pas partagée par CLC/CLF et le récepteur impliqué dans les effets de cette cytokine sur le système immunitaire reste donc à identifier. L’IL-27 appartient à la famille de l’IL-6 composée d’une sous-unité cytokinique, p28, associée à un récepteur soluble « l’Epstein-Barr virus-induced gene 3» (EBI3). La sous-unité p28 peut s’associer avec le récepteur soluble CLF pour former une cytokine capable d’activer les lymphocytes T. Dans le but de caractériser cette cytokine, nous avons montré que p28/CLF agit aussi sur les lymphocytes B et permet leur différenciation en plasmocytes. Le partage de l’IL-6R par l’IL-6 et p28/CLF semble être à l’origine de la similarité des effets de ces deux cytokines. De plus, nous avons observé des effets semblables à ceux de l’IL-6 suite à l’association de la sous-unité p28 seule avec la chaîne IL-6Rα. En effet, afin de mieux caractériser la cytokine p28/CLF, nous avons étudié les effets dus au recrutement de la chaîne IL-6Rα par la sous-unité p28. Les cytokines de la famille de l’IL-6 sont composées de quatre hélices α disposées de façon anti-parallèle deux à deux. La sous-unité p28 possède, au niveau d’une boucle reliant deux hélices α, un motif de plusieurs acides glutamiques consécutifs (motif polyE) qui n’est retrouvé dans aucune autre cytokine de cette famille. Nous avons démontré que ce motif est impliqué dans la liaison de cette sous-unité avec l’hydroxyapatite et l’os. Cette caractéristique de p28 pourrait permettre un ciblage de l’IL-27 (p28/EBI3) et de p28/CLF préférentiellement vers la niche endostéale des cellules souches et des cellules immunitaires.

Differential Effect of IL-27 on Developing versus Committed Th17 Cells

IIL-27 counters the effect of TGF-beta+IL-6 on naive CD4(+) T cells, resulting in near complete inhibition of de novo Th17 development. In contrast, little is known about the effect of IL-27 on already differentiated Th17 cells. A better understanding of how IL-27 regulates these cells is needed to evaluate the therapeutic potential of IL-27 in Th17 cells-associated diseases. In this study, we show that IL-27 had surprisingly little effect on committed Th17 cells, despite its expression of a functional IL-27R. Contrary to de novo differentiation of Th17 cells, IL-27 did not suppress expression of retinoid-related orphan receptor (ROR)gammat or RORalpha in committed Th17 cells. Consistent with this finding, the frequency of committed Th17 cells and their cytokine secretion remained unaffected by IL-27. Both memory Th17 cells (CD4(+)CD25(-)CD62L(low)) that developed in vivo and encephalitogenic Th17 cells infiltrating the CNS of mice developing experimental autoimmune encephalomyelitis produced similar amounts of IL-17A when reactivated with IL-23 in the absence and presence of exogenous IL-27. Finally, IL-27 failed to suppress encephalitogenicity of Th17 cells in an adoptive transfer of experimental autoimmune encephalomyelitis. Analysis ex vivo of transferred Th17 cells in the spleen and CNS of recipient mice showed that cells retained similar phenotype irrespective of whether cells were treated or not with IL-27. Our data demonstrate that in contrast to inhibition of de novo differentiation of Th17 cells, IL-27 has little or no effect on committed Th17 cells. These findings indicate that therapeutic applications of IL-27 might have a limited efficacy in inflammatory conditions where aggressive Th17 responses have already developed.

Independent and Interdependent Immunoregulatory Effects of IL-27, IFN-β, and IL-10 in the Suppression of Human Th17 Cells and Murine Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

IFN-ß, IL-27, and IL-10 have been shown to exert a range of similar immunoregulatory effects in murine and human experimental systems, particularly in Th1- and Th17-mediated models of autoimmune inflammatory disease. In this study we sought to translate some of our previous findings in murine systems to human in vitro models and delineate the interdependence of these different cytokines in their immunoregulatory effects. We demonstrate that human IL-27 upregulates IL-10 in T cell-activated PBMC cultures and that IFN-ß drives IL-27 production in activated monocytes. IFN-ß-driven IL-27 is responsible for the upregulation of IL-10, but not IL-17 suppression, by IFN-ß in human PBMCs. Surprisingly, IL-10 is not required for the suppression of IL-17 by either IL-27 or IFN-ß in this model or in de novo differentiating Th17 cells, nor is IL-27 signaling required for the suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by IFN-ß in vivo. Furthermore, and even more surprisingly, IL-10 is not required for the suppression of Th17-biased EAE by IL-27, in sharp contrast to Th1-biased EAE. In conclusion, IFN-ß and IL-27 both induce human IL-10, both suppress human Th17 responses, and both suppress murine EAE. However, IL-27 signaling is not required for the therapeutic effect of IFN-ß in EAE. Suppression of Th17-biased EAE by IL-27 is IL-10-independent, in contrast to its mechanism of action in Th1-biased EAE. Taken together, these findings delineate a complex set of interdependent and independent immunoregulatory mechanisms of IFN-ß, IL-27, and IL-10 in human experimental models and in murine Th1- and Th17-driven autoimmunity.

Caractérisation d'une nouvelle cytokine composite formée de CLF et de la sous-unité p28 de l'IL-27

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Primäre und sekundäre autokrine Wirkung von IL-27 auf neonatale dendritische Zellen

Neugeborene begegnen nach der Geburt einer Vielzahl von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, wodurch nach und nach eine Besiedelung ihrer Haut und Schleimhäute stattfindet. In diesem Kontext muss jedoch verhindert werden, dass es zu schädliche Überreaktionen gegen die neuen Antigenen kommt. Die in der Kindheit erhöhte Infektionsanfälligkeit stellt somit eine essentielle Adaptation des neonatalen Immunsystems an die Herausforderungen der ersten Lebensphase dar. Dennoch wird das neonatale Immunsystem häufig als unreif bezeichnet, da insbesondere Th1-Antworten weniger stark ausfallen, als bei Erwachsenen. Während bekanntermaßen bei neonatalen DCs ein Defekt in der Produktion von IL-12 vorliegt, wird das ebenfalls als Th1-Zytokin geltende IL-27 von neonatalen DCs verstärkt gebildet, und dies bereits im unstimulierten Zustand der Zellen. rnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Einflusses von IL-27 auf die Kapazität der DCs, angeborene und adaptive Immunantworten zu modulieren. Da DCs den Rezeptor für IL-27 auch auf ihrer eigenen Oberfläche tragen, lag der Schwerpunkt der Untersuchungen auf den primären und sekundären autokrinen Wirkungen des IL-27. Hierbei wurde beobachtet, dass im Vergleich zu adulten DCs bei neonatalen DCs stärkere durch IL-27 ausgelöste autokrine Effekte auftraten. Die primäre autokrine Wirkung zeigte sich darin, dass IL-27 seine eigene Produktion, sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Proteinebene, anregte. Auf Proteinebene fielen diese Effekte bei Neonaten stärker aus, als bei Adulten.rnDarüber hinaus konnten, insbesondere bei neonatalen DCs, sekundäre autokrine Effekte von IL-27 bezüglich der Expression proinflammatorischer Zytokine, Chemokine, kostimulatorischer Moleküle und antiviraler Gene nachgewiesen werden. rnNeonatale DCs sind demnach nicht nur dazu in der Lage, größere Mengen an IL-27 zu bilden, sie können auch in vielfältiger Weise auf das Zytokin reagieren, was eine zentrale Rolle von IL-27 im Immungeschehen Neugeborener verdeutlicht. rn

Epstein–Barr virus-induced gene 3 and the p35 subunit of interleukin 12 form a novel heterodimeric hematopoietin

The Epstein–Barr virus-induced gene 3 (EBI3) is a novel soluble hematopoietin component related to the p40 subunit of interleukin 12 (IL-12). When EBI3 was expressed in cells, it accumulated in the endoplasmic reticulum and associated with the molecular chaperone calnexin, indicating that subsequent processing and secretion might be dependent on association with a second subunit. Coimmunoprecipitations from lysates and culture media of cells transfected with expression vectors for EBI3 and/or the p35 subunit of IL-12 now reveal a specific association of EBI3 with p35. Coexpression of EBI3 and p35 mutually facilitates their secretion. Most importantly, a large fraction of p35 in extracts of the trophoblast component of a human full-term normal placenta specifically coimmunoprecipitated with EBI3, indicating that EBI3 is in a heterodimer with p35, in vivo. Because EBI3 is expressed in EBV-transformed B lymphocytes, tonsil, spleen, and placental trophoblasts, the EBI3/p35 heterodimer is likely to be an important immunomodulator.

Cutting Edge: Suppression of GM-CSF Expression in Murine and Human T Cells by IL-27

GM-CSF is a potent proinflammatory cytokine that plays a pathogenic role in the CNS inflammatory disease experimental autoimmune encephalomyelitis. As IL-27 alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis, we hypothesized that IL-27 suppresses GM-CSF expression by T cells. We found that IL-27 suppressed GM-CSF expression in CD4+ and CD8+ T cells in splenocyte and purified T cell cultures. IL-27 suppressed GM-CSF in Th1, but not Th17, cells. IL-27 also suppressed GM-CSF expression by human T cells in nonpolarized and Th1- but not Th17-polarized PBMC cultures. In vivo, IL-27p28 deficiency resulted in increased GM-CSF expression by CNS-infiltrating T cells during Toxoplasma gondii infection. Although in vitro suppression of GM-CSF by IL-27 was independent of IL-2 suppression, IL-10 upregulation, or SOCS3 signaling, we observed that IL-27-driven suppression of GM-CSF was STAT1 dependent. Our findings demonstrate that IL-27 is a robust negative regulator of GM-CSF expression in T cells, which likely inhibits T cell pathogenicity in CNS inflammation.

The role of EBI-3 in a murine model of lung metastases of melanoma

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenpräsentierenden Zellen exprimierte EBI-3 gehört zur Familie der löslichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intravenöse Injektion der B16-F10 Zelllinie führte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer höheren Lebenserwartung dieser Mäuse im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Darüber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten Mäusen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden während Änderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die kürzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zusätzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs unterstützt wurden, erklärt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten Mäusen produzierten höhere Mengen an IFN-g während die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Moleküle exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verstärkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser Mäuse. Dies wiederum resultierte im TNF- und TRAIL abhängigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten Mäuse, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten Mäusen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypmäuse transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empfängermäusen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.

Rôle et expression de l'interleukine-27 dans le contexte de la sclérose en plaques

Des études antérieures ont indiqué que l’IL-27 supprime le développement de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle murin de la sclérose en plaques (SEP). L’expression en ARNm d’IL-27 est maximale au pic du développement de l’EAE. Cependant, sa contribution dans la pathogenèse de la SEP demeure irrésolue. Nous avons investigué si l’IL-27 contribue à moduler les réponses immunes dans le système nerveux central (SNC) de patients SEP. Nos résultats d’immunohistochimie sur échantillons post-mortem de cerveaux humains ont révélé que la production des deux sous-unités d’IL-27 (EBI-3 et p28) est plus élevée chez des patients comparés à des contrôles. De plus, les astrocytes (GFAP) et les microglies/macrophages (Iba1) représentent des sources biologiques importantes de l’IL-27 dans les lésions. Les lymphocytes T CD4 et CD8 qui infiltrent le SNC des patients expriment d’ailleurs le récepteur de l’IL-27 composé des chaînes gp130 et TCCR, supportant le concept que ces cellules pourraient répondre aux sources locales d’IL-27. Nous avons également démontré que des combinaisons de cytokines pro-inflammatoires (IFNγ, IL-1β et TNF) augmentent l’expression in vitro d’IL-27 par les astrocytes et macrophages humains, et que les microglies/macrophages de phénotype M1 produisent l’IL-27. Enfin, nous avons démontré que les astrocytes humains expriment aussi le récepteur à l’IL-27 et répondent à l’IL-27 par la phosphorylation de STAT1, mais pas de STAT3. Une telle signalisation dans ces cellules mène à l’augmentation d’expression de la molécule de co-inhibition PD-L1 et de la sécrétion de la chimiokine CXCL10.

Profile of IL-2, IL-4, IL-10, IFN- ? , TNF- ? and KC-like cytokines in pregnant bitches

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Inhibition of IL-1, IL-6, and TNF-alpha in immune-mediated inflammatory diseases

Blockade of cytokines, particularly of tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha), in immuno-inflammatory diseases, has led to the greatest advances in medicine of recent years. We did a thorough review of the literature with a focus on inflammation models in rodents on modified gene expression or bioactivity for IL-1, IL-6, and TNF-alpha, and we summarized the results of randomized controlled clinical trials in human disease. What we have learned herewith is that important information can be achieved by the use of animal models in complex, immune-mediated diseases. However, a clear ranking for putative therapeutic targets appears difficult to obtain from an experimental approach alone. This is primarily due to the fact that none of the disease models has proven to cover more than one crucial pathogenetic aspect of the complex cascade of events leading to characteristic clinical disease signs and symptoms. This supports the notion that the addressed human immune-mediated diseases are polygenic and the summation of genetic, perhaps epigenetic, and environmental factors. Nevertheless, it has become apparent, so far, that TNF-alpha is of crucial importance in the development of antigen-dependent and antigen-independent models of inflammation, and that these results correlate well with clinical success. With some delay, clinical trials in conditions having some relationship with rheumatoid arthritis (RA) indicate new opportunities for blocking IL-1 or IL-6 therapeutically. It appears, therefore, that a translational approach with critical, mutual reflection of simultaneously performed experiments and clinical trials is important for rapid identification of new targets and development of novel treatment options in complex, immune-mediated, inflammatory diseases.