Preparation, structural analysis and prebiotic potential of arabinoxylo-oligosaccharides

Arabinoxylo-oligosaccharides (AXOS) can be prepared enzymatically from arabinoxylans (AX) and AXOS are known to possess prebiotic potential. Here the structural features of 10 cereal AX were examined. AX were hydrolysed by Shearzyme® to prepare AXOS, and their structures were fully analysed. The prebiotic potential of the purified AXOS was studied in the fermentation experiments with bifidobacteria and faecal microbiota. In AX extracted from flours and bran, high amounts of a-L-Araf units are attached to the b-D-Xylp main chain, whereas moderate or low degree of substitution was found from husks, cob and straw. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy showed that flour and bran AX contain high amounts of a-L-Araf units bound to the O-3 of b-D-Xylp residues and doubly substituted b-D-Xylp units with a-L-Araf substituents at O-2 and O-3. Barley husk and corn cob AX contain high amounts of b-D-Xylp(1→2)-a-L-Araf(1→3) side chains, which can also be found in AX from oat spelts and rice husks, and in lesser amounts in wheat straw AX. Rye and wheat flour AX and oat spelt AX were hydrolysed by Shearzyme® (with Aspergillus aculeatus GH10 endo-1,4-b-D-xylanase as the main enzyme) for the production of AXOS on a milligram scale. The AXOS were purified and their structures fully analysed, using mass spectrometry (MS) and 1D and 2D NMR spectroscopy. Monosubstituted xylobiose and xylotriose with a-L-Araf attached to the O-3 or O-2 of the nonreducing end b-D-Xylp unit and disubstituted AXOS with two a-L-Araf units at the nonreducing end b-D-Xylp unit of xylobiose or xylotriose were produced. Xylobiose with b-D-Xylp(1→2)-a-L-Araf(1→3) side chain was also purified. These AXOS were used as standards in further identification and quantification of corresponding AXOS from the hydrolysates in high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) analysis. The prebiotic potential of AXOS was tested in in vitro fermentation experiments. Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 and B. longum ATCC 15707 utilized AXOS from the AX hydrolysates. Both species released L-arabinose from AXOS, but B. adolescentis consumed the XOS formed, whereas B. longum fermented the L-arabinose released. The third species tested, B. breve ATCC 15700, grew poorly on these substrates. When cultivated on pure AXOS, the bifidobacterial mixture utilized pure singly substituted AXOS almost completely, but no growth was detected with pure doubly substituted AXOS as substrates. However, doubly substituted AXOS were utilized from the mixture of xylose, XOS and AXOS. Faecal microbiota utilized both pure singly and doubly substituted AXOS. Thus, a mixture of singly and doubly substituted AXOS could function as a suitable, slowly fermenting prebiotic substance. This thesis contributes to the structural information on cereal AX and preparation of mono and doubly substituted AXOS from AX. Understanding the utilization strategies is fundamental in evaluating the prebiotic potential of AXOS. Further research is still required before AXOS can be used in applications for human consumption.

Pienten sokeriyhdisteiden eristäminen ja tunnistus kuusen solususpensioliuoksesta

Biologisesti aktiivisilla oligosakkarideilla on vaikutuksia kasvin kasvuun ja kehittymiseen. Tietyn tyyppiset oligosakkaridit voivat myös indusoida puolustusreaktion valikoivasti oligosakkaridista riippuen. Useat biologisesti aktiiviset oligosakkaridit on löydetty kasvien soluseinää keinotekoisesti hajottamalla. Pro gradu -tutkielman tarkoituksena oli karakterisoida kuusen (Picea abies) solukkolinjan A3/85 solususpensiokasvatukseen erittämiä oligosakkarideja. Kuusisolukko A3/85 on otollinen kandidaatti tutkimukseen, sillä sen on todettu erittävän solunulkoista ligniiniä suspensioliuokseen. Oligosakkarideja karakterisoitiin yhden ja neljän vuorokauden kasvatuksista. Alustan sokeripitoisuutta alennettiin neljän vuorokauden kasvatuksissa karakterisoinnin helpottamiseksi. Oligosakkaridien pitoisuudet voivat olla hyvin alhaisia, joten solujen tuottamia yhdisteitä seurattiin myös radioaktiivisen D-[U-14C]-glukoosin avulla. Kasvien soluseinässä yleiset glukuronihappo, galakturonihappo, ksyloosi, arabinoosi ja apioosi valmistetaan glukoosi-6-fosfaatista, joko myo-inositolihapetusreitin tai sokerihapetusreitin kautta. Lisäksi tutkittiin, muuttuuko radioaktiivisen leiman jakautuminen näytteissä, kun kasvatusliuoksessa on tai ei ole myo-inositolia. Kasvatusliuos fraktioitiin geelisuodatuskromatografialla. Fraktioiden sisältämät yhdisteet eroteltiin paperikromatografialla ja värjättiin hopeanitraatilla, aniliinivetyftalaatilla tai ninhydriinillä. Hopeanitraatti on hyödyllinen monosakkaridien, oligosakkaridien ja alditolien värjäyksessä. Radioaktiivisuuden kertymistä yhdisteisiin seurattiin nestetuikelaskimella ja autoradiografialla. Paperikromatografialla erotelluista yhdisteistä valittiin mielenkiintoiseksi koetut yhdisteet, jotka eristettiin preparatiivisella paperikromatografialla. Eristetyille yhdisteille tehtiin happohydrolysointi, borohydridikäsittely tai entsymaattinen Driselaasi -käsittely. Happohydrolysointi avaa sokeriyksiköiden väliset glykosidiset sidokset. Natriumborohydridipelkistys muuttaa oligosakkaridiketjun pelkistävän sokerin sokerialkoholiksi ja Driselaasi -käsittely avaa isoprimeveroosin Xyl-Į-(1ĺ6)-Glc -sidosta lukuun ottamatta muut glykosidiset sidokset. 14C-leima on jakautunut myo-inositolin kanssa kasvatetun näytteen fraktioinnissa vahvemmin suurimolekyylisiin yhdisteisiin, kun taas ilman myo-inositolia kasvatetussa näytteessä suurin aktiivisuus D-[U-14C]-glukoosin jälkeen on trisakkaridien alueella. Suspensioliuoksista analysoitiin useita oligosakkarideja polymerisaatioasteella 1-4. Analysoiduista yhdisteistä kolme sisälsivät ksyloosia, jota solut voivat syntetoida joko myo-inositolin hapetusreitin tai glukoosin hapetusreitin kautta. Myo-inositolin puuttuminen alustasta lisäsi näiden leimattujen yhdisteiden pitoisuutta. Alustan myo-inositoli ei ole radioaktiivista, joten myo-inositolihapetusreitin kautta valmistetut monosakkaridit eivät näy autoradiografiassa. Vaikuttaisi siis siltä, että myo-inositolihapetusreitti on aktiivinen ainakin, jos solukolle tarjotaan myo-inositolia. Lisätty myo-inositoli vähentää sokerihapetusreitin aktiivisuutta. Työn aikana onnistuttiin eristämään ja osittain tunnistamaan useita kuusen suspensioliuoksen yhdisteitä. Myo-inositolihapetusreitti todettiin aktiiviseksi solukkokasvatuksessa, kun ravintoalustassa on myo-inositolia.

Tandemmassaspektrometrinen menetelmä neutraalien isomeeristen oligosakkaridien rakenteen määrittämisessä

Tutkimuksen tavoitteena oli ottaa käyttöön tandemmassaspektrometrinen (MS/MS) menetelmä, jolla voidaan analysoida polysakkarideista purkautuneiden oligosakkaridien rakenteita. Tavoitteena oli, että menetelmällä voidaan määrittää glykosidisten sidosten eri asemat monosakkaridirakenteiltaan samanlaisista neutraaleista lineaarisista oligosakkarideista. Kirjallisuustutkimuksessa tarkasteltiin oligosakkaridien rakenteiden määrittämiseen käytettyjä MS/MS-menetelmiä ja oligosakkaridien pilkkoutumisreaktioita MS/MS-analyysissa. Kirjallisuuden perusteella MS/MS-analyysissa oligosakkaridien pilkkoutuminen voi tapahtua joko glykosidisen sidoksen katkeamisella tai monosakkaridirenkaan halkeamisella. Monosakkaridirenkaan pilkkoutumisesta muodostuvia tuoteioneja voidaan käyttää glykosidisen sidoksen aseman määrittämiseen. Kokeellisessa tutkimuksessa selvitettiin aluksi monosakkaridirakenteiltaan isomeerisilla disakkaridimalliaineilla glykosidisen sidoksen sijainnin vaikutus disakkaridin pilkkoutumiseen MS/MS-analyysissa. Tämän jälkeen pyrittiin löytämään tunnetuista tri- ja tetrasakkaridimalliaineista näitä eri sidoksille tyypillisiä tuoteionien jakaumia. Tunnettujen tri- ja tetrasakkaridien pilkkoutuminen yhdenmukaisesti disakkaridien pilkkoutumisen kanssa antaisi mahdollisuuden pitkäketjuisempien oligosakkaridien glykosidisten sidosten tunnistamiseen sovelletulla MS/MS-menetelmällä. MS/MS-analyysit tehtiin ioniloukkumassadetektorilaitteistolla käyttäen sähkösumutusionisaatiota (ESI). Oligosakkaridit määritettiin positiivisella ionisaatiolla litium- ja natriumaddukti-ioneina ja negatiivisella ionisaatiolla kloridiaddukti-ioneina. Vertaamalla tri- ja tetrasakkarideista MS/MS-analyyseissa muodostuneita tuoteioneja disakkarideista muodostuneisiin tuoteioneihin, voitiin sekä positiivisella että negatiivisella ionisaatiolla määrittää oligosakkaridin pelkistävän pään sidoksen asema. Negatiivisella ionisaatiolla tri- ja tetrasakkarideista muodostuneista tuoteioneista voitiin määrittää myös muiden kuin pelkistävän pään sidosten asemia. Positiivisella ionisaatiolla muiden sidosten määrittäminen ei ollut mahdollista, koska rengasfragmentti-ioneja muodostui pääosin oligosakkaridin pelkistävästä päästä. Glykosidisen sidoksen katkeamisesta muodostuneet tuoteionit analysoitiin edelleen MS3-analyysilla. MS3-analyysissa muodostuneista tuoteioneista ei voitu tulkita sidosten asemia, koska lähtöionit koostuivat sekä terminaalisen että pelkistävän pään isomeerisista ioneista.