缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究—纯化、结晶及金属簇的组成与分布

从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE－52、Sephacryl S－200及Q－Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase，PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin，Bfr）。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度;而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1，但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等，2004）。 通过Sephacryl S－200柱洗脱峰收集精度的调整及Q－Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting），以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似，从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46-50%;而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外，与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-tagged ΔnifZ Av1（Hu等，2004）的信号明显不同。这就表明，ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-tagged ΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等（1998）对nifZ产物（NifZ）和nifW产物（NifW）可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响;nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZ Av1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25%PEG 6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体;在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显;PEG 6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZ Av1制备物的纯度达到90%以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。

固氮酶金属原子簇对其结构和功能的影响

一、 △nifZ MoFe蛋白的纯化、特性及晶体生长 从缺失nifZ的棕色因氮菌突变种DJ194中，经离子交换层析和凝胶过滤提纯得到△nifZ MoFe蛋白，其纯度可达SDS凝胶电泳纯。它的Fe、Mo含量分别为野生型OP MoFe蛋白的56.6%和75.0%左右;C_2H_2、H~+还原活性和△H_2均只有OP MoFe蛋白的14.6%、21.7%和21.7%;其可见吸收光谱、CD及AR谱都与OP MoFe蛋白有较大差异，其中，可以反应P-cluster氧还状态和含量的ε_(450nm)、ε_(700nm)及△ε_(450nm)均要比OP MoFe蛋白低;由紫外CD谱反映的△nifZ MoFe蛋白的构象也与OP MoFe蛋白有所不同。由此我们推测，nifZ可能与固氮酶MoFe蛋白中P-cluster的合成或组装有关。为进一步阐明△nifZ MoFe蛋白的结构和功能特性，我们对△nifZ MoFe蛋白的晶体生长进行了研究，通过对沉淀剂浓度、缓冲体系和pH、蛋白浓度以及温度等条件的不断优化组合，目前我们已获得棕色短斜四棱柱形△nifZ MoFe蛋白的最大晶体为0.15 * 0.09mm。 二、 MoFe(C,O)与含Mo、Mn和Cr重组液重组的比较研究 MoFe(R)经O_2和o-phen共同处理后，成为部分缺失FeMoco和P-cluster的不全蛋白(MoFe(C,O))，其C_2H_2还原活性降至MoFe(R)的40%左右，将其分别与含Mo、Cr和Mn的重组液进行保温重组，其C_2H_2还原活性及光谱学特征都得到明显恢复。通过对不同重组液及与MoFe(C,O)形成的重组蛋白的比较，我们认为：1)MoFe(R)中的Fe和Mo原子可能是逐步被鳌合除去的，且不同蛋白中的Fe和Mo原子的缺失程度不同，因而MoFe(C,O)会以多种状态存在;2)在重组液配制过程中，发生的一系列颜色变化及沉淀反应与其是否具有重组激活能力具有相关性，重组液中可能已合成一些简单的含M(M=Mo或Cr或Mn或V)的铁硫化物，但不可能形成完整的金属原子簇;3)含M(M=Mo或Cr或Mn)的重组液均能使MoFe(C,O)中遭到破坏的FeMoco和P-cluster及其连接部分得以重新组装和修复，进而恢复其底物还原活性和光谱学特征。 三、 含锰固氮酶的初步探索 棕色固氮菌突变种UW_3(nifH~-)不能在含钼的培养中固氮生长，但能在含MnSO_4的无氮培养基中固氮生长。用含MnSO_4的无钼无氮培养基培养该突变种从中纯化得到的固氮酶组分1蛋白，其C_2H_2及H~+还原活性约相当于MoFe(R)的20%左右，Mn元素含量测定表明，其中已经含有Mn元素，Fe/Mn比值比OP MoFe蛋白中的Fe/Mo低。这些结果表明：UW_3突变种在该种条件下可能已表达了不同于已发现的三种固氮酶的新的固氮酶组分1蛋白，并且其中含有Mn元素。

几种固氮菌突变种固氮酶的特性及晶体生长

一，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白的晶体生长的研究进展 在一定的结晶条件下，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白将从溶液中结晶出深棕色的短斜四棱柱晶体。PEG 8000、MgCl2、NaCl、Tris的浓度及缓冲液的pH对该蛋白的结晶及晶体生长影响的系统研究表明，它们的浓度和pH较低时，不出晶体;当pH高于8.0，随着前三种化合物浓度的逐渐提高，便在一周内出现大量小品体;再提高浓度后，便延长结晶时问但出质好、数少而个大的晶体;然后晶体随浓度的提高而又变小、变多、甚至晶质变差，直至不再出晶体。影响晶体生长的各因子的最适浓度随其它条件的改变而有所不同。当缓冲液的pH为8.2而PEG 8000，MgCl’、NaCI、蛋白质和Tris的浓度分别为1.86%、300 mmol/L、400 mmoUL、4.64g/L、53 mmo/L时，首次发现在一滴悬滴结晶液中只有一颗较大的优质晶体（最大两边线度均为0.16mm）。 二，从分别含Mn和Cr的培养基中生长的固氮菌突变种UW3中纯化的固氮酶的特性和结晶 缺失nifH基因的棕色固氮菌突变种UW3，在有钼环境中不能固氮生长，但能在无钼而含MnS01或Na2Cr01的无氮培养基中固氮生长。分别经超声破碎、加热除去部分杂蛋白、离子交换柱层析和Sephacryl S-200或S-300柱层析的分离纯化，分别得到二种固氮酶组分l蛋白。金属元素测定表明，这两种蛋白除含铁元素外还分别含有锰和铬元素。它们的吸收光谱、CD和AR谱互不完全相同，并都与OP-MoFe蛋白存在较大差异。含Mn固氮酶也能还原C2H2、质子和N2，对它们的还原的比活性都分别约为MoFe蛋白活性的50%。初步结果表明，这一突变种在这两种培养条件下都可能已表达了不同于已发现的三种固氮酶的新固氮酶组分l蛋白-MoFe、VFe和FeFe蛋白，分别为含Mn或Cr的固氮酶组分1蛋白，分别被称为uw3，-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白。通过对PEG 8000、MgCI2、NaCI和缓冲液的种类和浓度等结晶条件的大量优化组合实验，首次获得uw3-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白的的晶体。最大晶体为21.4×14.3×2.1μm。

固氮菌突变种DJ35钼铁蛋白和UW3细菌铁蛋白的纯化、特性、晶体生长及鉴定

一、棕色固氮菌突变种DJ35固氮酶钼铁蛋白的纯化、体外重组及结晶研究 　　棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ35的菌体破碎后，所得的未经加热的粗提物经DEAE Cellulose 52柱层析后得到部分纯的钼铁蛋白（ΔnifE Av1）和铁蛋白(Av2)。部分纯的ΔnifE Av1再经Sephacryl S-300和Q-Sepharose Fast Flow柱层析进一步纯化，便首次得到SDS凝胶电泳检测为基本纯的ΔnifE Av1。SDS-PAGE及Western blotting的结果表明，ΔnifE Av1具有与野生型棕色固氮菌钼铁蛋白(OP Av1)相同的亚基种类和组成（α2β2）。质子还原活性测定表明，在与Av2进行活性互补时ΔnifE Av1不具有明显的质子还原活性，而与从OP Av1抽提出的FeMoco抽提液保温后便可与Av2实现活性互补。这表明，ΔnifE Av1是一种缺失FeMoco的钼铁蛋白。 　　将ΔnifE Av1用过量的邻菲啰啉(o-phenanthroline)厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，便得到部分丢失Fe的ΔnifE Av1©。在同时存在Av2和MgATP发生系统的条件下，ΔnifE Av1©, 而不是处理前的ΔnifE Av1，可为由KMnO4或Na2CrO4、高柠檬酸铁、Na2S、Na2S2O4 和二硫苏糖醇组成的含Mn或含Cr重组液(RS-Mn或RS-Cr)显著激活，但在缺少MgATP或Av2的条件下，RS-Mn和RS-Cr则不能激活ΔnifE Av1©。这就表明，RS-Mn和RS-Cr对ΔnifE Av1©的激活都需要邻菲啰啉的预处理及Av2和MgATP的同时存在。从分别缺失nifZ和nifB点突变的固氮菌突变种DJ194和UW45中纯化得到的钼铁蛋白，ΔnifZ Av1和NifB- Av1，经邻菲啰啉厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，也分别得到部分丢失Fe的ΔnifZ Av1©和NifB- Av1©。与ΔnifE Av1©一样，这两种蛋白在Av2和MgATP同时存在时也可被RS-Cr和含Mo重组液（RS-Mo）明显激活。 　　为获得可供X-射线衍射的ΔnifE Av1的大单晶，对组成蛋白质沉淀剂的各种化合物的种类和浓度、缓冲液的pH值、结晶方法及蛋白样品的批次、浓度等结晶条件进行了大量优化研究。首次获得了ΔnifE Av1的深棕色短斜四棱柱晶体，并对其蛋白组成进行了鉴定。 二、铬铁蛋白中残存的棕色固氮菌细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定 　　从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白。在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现，棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现。SDS-和厌氧天然-PAGE皆表明，棕色晶体主要由与Av1类似大小的亚基（~60 kD）组成，而砖红色晶体则主要由~20 kD亚基组成。Western-blotting表明只有~60 kD亚基可与OP Av1的抗体发生反应，而~20 kD亚基则无这种反应。在部分纯的CrFe蛋白中，~20 kD的蛋白含量远低于~60 kD蛋白的含量，表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白中的一种污染蛋白。用3,5-二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明，形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白。质谱分析表明，该晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白（AvBF）。分辨率为2.34 Å的X-射线衍射结果也表明，砖红色晶体属于H3空间群，晶胞参数为a = 124.965 Å, b= 124.965 Å 和 c = 287.406 Å。首次完成的结构解析也表明，这种砖红色晶体确为24聚体的AvBF。 关键词：棕色固氮菌突变种DJ35和UW3; ΔnifE Av1; 铬铁蛋白; 细菌铁蛋白; 纯化和特性; 体外激活组装; 晶体生长及组成鉴定