Amélioration de la prise de greffe hématopoïétique par une thérapie cellulaire à base de cellules souches mésenchymateuses

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération du tissu hématopoïétique. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent encore inconnus, ce qui limite le développement de nouvelles approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle murin de prise de greffe, nos résultats démontrent que l’endommagement du microenvironnement par l’irradiation a un impact limitant sur le nichage hématopoïétique. Parce que le microenvironnement est composé principalement de cellules dérivées des cellules souches mésenchymateuses (CSM), nous avons évalué le potentiel des CSM à régénérer le tissu hématopoïétique par la reconstitution de la niche osseuse. Cette thérapie a mené à une augmentation remarquable du nichage hématopoïétique chez les souris irradiées. Les causes moléculaires impliquées dans le nichage hématopoïétiques sont encore inconnues, mais nous avons remarqué l’augmentation de la sécrétion de la cytokine « granulocyte-colony stimulating factor » (G-CSF) dans l’espace médullaire suite à l’irradiation. Le G-CSF est impliqué dans la mobilisation cellulaire et est fort possiblement nuisible à une prise de greffe. Nous avons évalué le potentiel d’une thérapie à base de CSM sécrétant le récepteur soluble du G-CSF afin de séquestrer le G-CSF transitoirement et les résultats obtenus démontrent que le blocage du G-CSF favorise le nichage hématopoïétique. Globalement, les données présentées dans ce mémoire démontrent que le microenvironnement osseux et le niveau de G-CSF dans la moelle sont importants dans le processus de nichage hématopoïétique et que la baisse du potentiel de régénération du tissu hématopoïétique suite à l’irradiation peut être renversée à l’aide d’une thérapie cellulaire de CSM génétiquement modifiées ou non.

Étude des effets du phénotype de sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques

L’irradiation (IR) est utilisée dans le traitement de plusieurs cancers et désordres hématologiques, en particulier dans les protocoles de conditionnement précédents les transplantations de moelle osseuse. L’emploi de doses réduites d’IR semble favoriser le succès de la prise de greffe. Cette observation soulève un point de plus en plus discuté dans la littérature, soit l’importance de l’intégrité du microenvironnement pour la transplantation et le bon fonctionnement de l’hématopoïèse. L’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse in vitro. Ce mécanisme de défense cellulaire entraînant un arrêt de prolifération permanent est également observé in vivo dans différents systèmes, mais n’a pas encore été étudié dans le contexte de la niche hématopoïétique. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour objectif de déterminer si l’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse et si une telle induction altère les fonctions hématopoïétiques. Nos résultats ont permis de démontrer pour la première fois qu’une IR corporelle totale induit effectivement la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse. En outre, cette altération du microenvironnement affecte la lymphopoïèse B de façon Ink4a/Arf-dépendante (1er article). De plus, les modifications systémiques qui résultent de l’IR compromettent l’homéostasie osseuse en augmentant la résorption de l’os, sans toutefois diminuer la formation de celui-ci (2e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les effets de la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques. Par ailleurs, elles suggèrent que l’emploi de drogues et/ou de procédés n’induisant pas la sénescence des cellules stromales de l’os offrirait un meilleur pronostic à long terme pour les patients.

Implication de la prostaglandine D2 dans le contrôle du métabolisme osseux chez l'homme

Les prostaglandines sont des médiateurs lipidiques impliqués dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. De récentes évidences dans la littérature ainsi que de notre laboratoire ont fait ressortir le fait que la PGD2 pourrait être impliquée dans le contrôle du métabolisme osseux. Mes travaux de doctorat ont été effectués selon cette hypothèse et ont déterminé l’effet de la PGD2 sur la différenciation des cellules souches mésenchymateuses et des précurseurs ostéoclastiques, en plus d’étudier le rôle de cette prostaglandine dans la réparation des fractures chez l’homme. De plus, j’ai étudié l’internalisation et la désensibilisation des récepteurs de la PGD2, DP et CRTH2. D’un point de vue moléculaire, mes résultats démontrent un patron d’internalisation et désensibilisation différent pour les 2 récepteurs de la PGD2. Bien que la cinétique d’internalisation de ces récepteurs soit la même, l’internalisation de DP est régulée par les arrestines 2 et 3, la GRK2 et la PKC, alors que l’arrestine 3, les GRK2, 5 et 6, PKC et PKA régulent celle de CRTH2. L’internalisation de DP et CRTH2 est réduite par la co-expression de Rab4 et Rab11 respectivement, ce qui suggère des systèmes de recyclage différents. En analysant la signalisation de ces récepteurs, nous avons découvert que la GRK2 régule la signalisation de DP, alors que les 3 GRKs étudiées, soient les GRK2, 5 et 6 régulent la signalisation de CRTH2. Nous avons également démontré que les récepteurs de la PGD2 ont des effets différents sur la différenciation des CSMs humaines. En effet, la différenciation adipocytaire est augmentée de façon significative par la PGD2 et cet effet est dû à l’activation du récepteur PPAR-γ par un métabolite de la PGD2. L’activation du récepteur DP diminue l’adipogenèse alors que CRTH2 n’y joue pas de rôle significatif. Cependant, CRTH2 augmente significativement la différenciation des CSM en ostéoblastes, alors que l’activation de DP l’inhibe. Mes travaux ont montré que la PGD2 module l’ostéoclastogenèse et la résorption osseuse en abaissant l’expression de gènes impliqués dans celles-ci. En effet, les gènes NFATC1, RANK et CathK sont fortement régulés à la baisse par l’activation des récepteurs de la PGD2. Pour terminer, nous avons identifié l’axe de la PGD2 comme étant important lors du remodelage osseux chez l’homme. En comparant une cohorte de patients ayant une fracture osseuse à des contrôles, nous avons découvert que la production de PGD2 et l’expression d’une de ses synthétases sont significativement plus élevées que chez les contrôles. Parallèlement, la production de PGE2 ne diffère pas entre les groupes indiquant que l’augmentation de PGD2 n’est pas due à l’inflammation non spécifique causée par la fracture. De plus, l’augmentation de synthèse de PGD2 corrèle avec l’augmentation de la BAP, un marqueur clinique de formation osseuse. J’ai donc démontré que la PGD2, par l’entremise de l’activation de CRTH2, est un médiateur lipidique important pour la physiologie osseuse et que son activation pourrait favoriser l’anabolisme osseux.

"Préservation du stock osseux acétabulaire lors de l'arthroplastie de la hanche : étude clinique randomisée et étude de modélisation par ordinateur "

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude du transport ionique membranaire par la mesure de concentration dans le microenvironnement externe de la membrane : mise au point de la technique du "piège ionique"

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Rôle du TGF-β dans la modulation du microenvironnement tumoral leucémique

Le microenvironnement tumoral et les cellules et molécules signal (cytokines et chimiokines) qu’ils contiennent sont reconnus comme jouant un rôle prépondérant dans la progression des tumeurs. Il devient donc nécessaire d’étudier la relation entre les molécules signal, les cellules infiltrantes et les cellules tumorales. Le TGF-β est une puissante cytokine immunosuppressive et suppressive de la croissance cellulaire, dont le rôle dans la formation du microenvironnement tumoral leucémique est mal connu. Dans cette étude, nous avons étudié le modèle injectable de leucémie lymphoïde T EL4 (cellules tumorales produisant du TGF-β) de souche C57BL/6. Nous avons caractérisé l’infiltration de cellules myéloïdes et lymphoïdes au niveau des tumeurs par cytométrie en flux et par microscopie à fluorescence. L’analyse des cellules infiltrant les tumeurs EL4 nous a permis de montrer la forte présence de lymphocytes T et de cellules myéloïdes CD11b+. Nous avons donc poursuivi l’étude afin de mieux caractériser ces cellules. Nous avons montré que ces cellules se retrouvent en périphérie de la tumeur et en périphérie des vaisseaux sanguins de la tumeur. Ces cellules ont des phénotypes nous laissant croire qu’elles appartiennent à la famille des cellules dite myéloïdes suppressives. Ces cellules ont de forts niveaux de transcrits de VEGF et de MMP9 au niveau de la tumeur ainsi qu’au niveau systémique, mais ne semblent pas avoir une forte capacité inhibitrice in vitro. Afin de déterminer si la production tumorale de TGF-β influe le recrutement de ces cellules, nous avons transformé des cellules EL4 à l’aide d’un shRNA afin de diminuer la production de TGF-β (shRNA-TGF-β) et, comparé l’infiltration myéloïde et lymphoïde de tumeurs formées avec des cellules EL4 contrôles (shRNA-Luc). Une diminution de 50% dans les niveaux de transcrits de TGF-β n’affecte pas la croissance tumorale mais semble diminuer l’infiltration par des cellules myéloïdes. La présente étude nous a permis de mieux comprendre le modèle de leucémie EL4 et le rôle des populations cellulaires myéloïdes dans le microenvironnement tumoral leucémique. La diminution du TGF-β produit par les cellules tumorales réduit l’infiltration de ces populations myéloïdes dans la tumeur EL4. Le rôle précis de ces cellules est encore à déterminer. Ces résultats sont en accord avec le fait qu’une thérapie anti-TGF-β n’est pas suffisante pour contrer la progression tumorale, mais pourrait influer sur le résultat post-chimiothérapie et l’immunothérapie en altérant la composition du microenvironnement.

Influence du microenvironnement inflammatoire sur la sénescence contrôlée par la réponse aux dommages à l'ADN, et sa régulation par l’induction du stress à la chromatine

La sénescence cellulaire, ou l’arrêt irréversible de la prolifération, influence des processus physiologiques et pathologiques, comme le cancer. Parmi les caractéristiques de la sénescence, se retrouve le PSAS ou phénotype sécrétoire associé à la sénescence. Le PSAS est composé d’une variété de cytokines, facteurs de croissance et protéases. Ses actions pro- et anti-tumorale sont connues, mais l’on ignore laquelle prédomine. Mes travaux s’attardent aux effets du PSAS sur l’induction de la sénescence dans les cellules environnantes et à sa régulation. Nous avons démontré que le PSAS ne synergise pas avec la dysfonction télomérique chronique ou aigue, afin de causer un arrêt de croissance. Également, l’étude du mécanisme responsable de l’induction de la sénescence par stress à la chromatine, suggère que la kinase c-Abl n’est pas requise pour cette voie, contrairement à des publications antérieures. Mes travaux éclairent les mécanismes d’action et la régulation du PSAS dans la sénescence induite par dysfonction télomérique et par stress à la chromatine.

Vers une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie osseuse reliée à la fibrose kystique

Les patients atteints de la fibrose kystique (FK) ont désormais un âge médian de survie dépassant la cinquantaine. Par contre, avec ce vieillissement surviennent de nouvelles complications dont l'une des plus prévalente est la maladie osseuse associée à la FK. Les souris dont le Cftr est invalidé génétiquement présentent une densité osseuse amoindrie qui découle d’un débalancement du remodelage osseux caractérisé par une diminution de la formation et une augmentation de la résorption osseuse. L'observation que plusieurs modèles murins FK ont un phénotype ostéopénique et ce, même en absence de certains facteurs étiologiques (inflammation chronique, prise de glucocorticoïdes, insuffisance pancréatique etc.) laisse croire que le Cftr, le gène muté dans la FK, joue un rôle non-négligeable dans le métabolisme osseux. Le présent projet étudiera l’impact de l’absence du CFTR, sur les ostéoblastes (Ob) et ostéoclastes (Oc) dans un modèle murin de FK, soit les souris Cftr-/- de souche BALB/c. De plus, les Ob, sont reconnus comme ayant un effet modulateur sur le microenvironnement leucocytaire de la moelle osseuse (MO). Ce projet visera également à investiguer l’impact de l’absence du CFTR sur la niche leucocytaire de la MO. Nos résultats de densitométrie osseuse et de microtomographie à rayons X ont confirmé que les souris Cftr -/- ont une densité osseuse et un contenu minéral osseux abaissé, une diminution du volume osseux trabéculaire, un nombre amoindri de travées osseuses et une plus grande séparation entre les travées comparé aux souris Cftr+/+. Afin de mieux comprendre ce phénotype osseux, nous avons vérifié et confirmé que l’expression génique et protéique du CFTR est présente chez des Ob dérivés de la MO, mais est absent au niveau des Oc dérivés de la MO. Ces observations corroborent nos résultats portant sur la différenciation des cellules osseuses où nous avons démontré que seule la différenciation et fonction ostéoblastique sont affectées par l'absence du CFTR. Ce défaut ostéoblastique semble influencer négativement la leucopoïèse puisque nous observons une quantité moindre de cellules T, de macrophages et de cellules dendritiques chez les souris Cftr -/- vs. Cftr +/+. À la lumière de ces résultats, l'absence du CFTR semble avoir un impact important sur les ostéoblastes et la moelle osseuse.

Rôle du microenvironnement apoptotique tissulaire et du MFG-E8 dans la modulation de la réponse inflammatoire

L’inflammation fait partie des processus réactionnels de défense dont dispose l’organisme en réponse aux agressions, assurant l’intégrité de l’hôte. En réponse au dommage tissulaire, plusieurs médiateurs inflammatoires interviennent dans le processus de l’inflammation. Lors de ces dommages, des signaux de dangers provenant de cellules endommagées sont relâchés dans l’environnement tissulaire, pouvant causer des dommages cellulaires et tissulaires. Les macrophages, tout comme d’autres cellules, peuvent être activés par ces signaux de danger, menant à la sécrétion de molécules telles que des cytokines et des chimiokines pouvant modifier le microenvironnement tissulaire. Les insultes au tissu sain peuvent entrainer la mort cellulaire telle que l’apoptose. Les molécules pouvant être relâchées lors de celle-ci contribuent au microenvironnement, notamment de par l’influence de celles-ci sur le macrophage. Parmi ces médiateurs, nous avons identifié le Milk Fat Globule-Epidermal growth factor 8 (MFG-E8), un acteur important dans la résolution de l’inflammation, comme étant relâché spécifiquement par les cellules apoptotiques. Nous avons émis l’hypothèse que le microenvironnement apoptotique tissulaire, via la relâche de MFG-E8, module le phénotype du macrophage, modifiant le microenvironnement, la réponse inflammatoire ainsi que le devenir de l’insulte tissulaire. Nos objectifs sont 1) de caractériser ce microenvironnement apoptotique tissulaire et la cinétique de relâche du MFG-E8 par les cellules apoptotiques, 2) d’en évaluer son rôle dans la modulation du phénotype du macrophage ainsi que 3) d’en étudier, in vivo, son influence sur l’environnement inflammatoire et le devenir tissulaire. Dans le premier article présenté, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques relâchent le MFG-E8 de façon Caspase-3 dépendante. La stimulation des macrophages par l’environnement conditionné par les cellules endothéliales apoptotiques mène à l’adoption d’un profil macrophagien davantage anti-inflammatoire et moindrement pro-inflammatoire. Ce phénotype est réduit par l’inhibition de la Caspase-3 et il dépend de la présence de MFG-E8. De plus, le potentiel du MFG-E8 à la reprogrammation du macrophage pro-inflammatoire a été démontré via un modèle expérimental de péritonite. Ce changement phénotypique médié par MFG-E8 implique une signalisation STAT3. Ayant démontré que les cellules épithéliales apoptotiques, à l’instar des cellules endothéliales apoptotiques, relâchent elles aussi de façon apoptose-dépendante le MFG-E8, nous avons étudié plus exhaustivement un modèle in vivo riche en apoptose épithéliale, l’obstruction urétérale unilatérale. Dans ce deuxième article présenté, nous rapportons l’implication bénéfique de MFG-E8 dans ce modèle de pathologie rénale obstructive. Nous avons constaté que la présence ou l’administration de MFG-E8 réduit le dommage tissulaire et la fibrose. La protection conférée par MFG-E8 est médiée via la modulation de l’activation de l’inflammasome. De plus, nos résultats illustrent l’importance du phénotype anti-inflammatoire du macrophage médié par le MFG-E8 dans la régulation négative de l’activation de l’inflammasome rénal et du dommage tissulaire. Cette thèse présente la première description de la relâche Caspase-3-dépendante de MFG-E8 par les cellules apoptotiques. Elle démontre également l’importance du MFG-E8 dans le microenvironnement apoptotique inflammatoire dans l’atténuation du phénotype pro-inflammatoire du macrophage. De plus, nous avons démontré son rôle protecteur dans des modèles in vivo de transplantation aortique et de réparation tissulaire, de même que dans un modèle de maladie rénale chronique où nous avons montré que cette protection conférée par MFG-E8 est médiée par la régulation négative de l’inflammasome tissulaire. Nos résultats suggèrent ainsi que le MFG-E8 pourrait être considéré comme un interrupteur inflammatoire et ainsi comme une cible potentielle dans la modulation de maladies inflammatoires.