PPAR beta a player in astrocyte metabolism and morphology

AbstractPPARP is a nuclear receptor responding in vivo to several free fatty acids, and implicated in cell metabolism, differentiation and survival. PPARp is ubiquitously expressed but shows high expression in the developing and adult brain. PPARp is expressed in different cell types such as neurons and astrocytes, where it might play a role in metabolism. To study this nuclear receptor the laboratory engineered a PPARP -/- mouse model. The aim of my PhD was to dissect the role of PPARP in astrocytes.Experiments in primary culture revealed that cortical astrocytes from PPARP -/- mouse have an impaired energetic metabolism. Unstimulated PPARP -/- astrocytes exhibit a 30% diminution in glucose uptake, correlating to a 30% decrease in lactate release and intracellular glucose. After acute stimulation by D- aspartate mimicking glutamate exposure, both WT and -/- astrocytes up-regulate their metabolism to respond to the increasing energy needed (ATP) for glutamate uptake. According to the Astrocyte Neuron Lactate Shuttle Hypothesis (ANLSH), the ratio between glucose uptake/ lactate release is 1. However, stimulated PPARp -/- astrocytes display a higher increase in lactate release than glucose uptake which remains lower than in WT. The extra glucose equivalents could come from the degradation of intra cellular glycogen stores, which indeed decrease in PPARP -/- cells upon stimulation. Lower glucose metabolism correlates with a decreased acute glutamate uptake in PPARP -/- astrocytes. Reciprocally, we also observed an increase of glutamate uptake and ATP production after treatment of WT astrocytes with a PPARp agonist. Glutamate transporter protein expression is not affected. However, their trafficking and localization might be altered as PPARp -/- astrocytes have higher cholesterol levels, which may also affect proper transporter structure in the membrane.Metabolism, transporter localization and cholesterol levels are respectively linked to cell mobility, cell cytoskeleton and cellular membrane composition. All three functions are important in astrocytes to in vivo acquire star shaped morphology, in a process known as stellation. PPARP -/- astrocytes showed an impaired acquired stellation in presence of neurons or chemical stimuli, as well as more actin stress fibers and cell adhesion structures. While non stellation of astrocytes is mainly an in vitro phenomenon, it reveals PPARp -/- primary astrocytes inability to respond to different exterior stimuli. These morphological phenotypes correlate with a slower migration in cell culture wound healing assays.This thesis work demonstrates that PPARp is implicated in cortical astrocyte glucose metabolism. PPARp absence leads to an unusual intracellular glycogen use. Added to the effect on acute glutamate uptake and astrocyte migration, PPARp could be an interesting target for neuroprotection therapies.RésuméPPARP est un récepteur nucléaire qui a pour ligands naturels certains acides gras libres. Il est impliqué dans le métabolisme, la différentiation et la survie des cellules. PPARP est ubiquitaire, et a une expression élevée dans le cerveau en développement ainsi qu'adulte. PPARp est exprimé dans différents types cellulaires tels que les neurones et les astrocytes, où il régule potentiellement leurs métabolismes. Pour étudier ce récepteur nucléaire, le laboratoire a créé un modèle de souris PPARp -/-. L'objectif de ma thèse est de comprendre le rôle de PPARp dans les astrocytes.Les expériences montrent un défaut du métabolisme énergétique dans les astrocytes corticaux primaires tirés de souris PPARp -/-. Sans stimulation, l'entrée du glucose dans les astrocytes PPARP -/- est diminuée de 30% ce qui correspond à une diminution de 30% du relargage du lactate. Après stimulation par du D-Aspartate qui mime une exposition au glutamate, les astrocytes WT et -/- augmentent leur métabolisme en réponse à la demande accrue en énergie (ATP) due à l'entrée du glutamate. D'après l'Astrocyte Neuron Lactate Shuttle Hypothesis (ANLSH), le ratio entre le glucose entrant et le lactate sortant est de 1. Cependant le relargage du lactate dans les astrocytes PPARP-/- est plus élevé que l'entrée du glucose. L'apport supplémentaire de glucose transformé en lactate pourrait provenir de la dégradation des stocks de glycogène intracellulaire, qui sont partiellement diminués après stimulation dans les cellules PPARP -/-. Un métabolisme plus faible du glucose corrèle avec une réduction de l'import du glutamate dans les astrocytes PPARp -/-. Réciproquement, nous observons une augmentation de l'import du glutamate et de la production d'ATP après traitement avec l'agoniste pour PPARp. Bien que l'expression des transporteurs de glutamate ne soit pas affectée, nous ne pouvons pas exclure que leur localisation et leur structure soient altérées du fait du niveau élevé de cholestérol dans les astrocytes PPARp -/-.Le métabolisme, la localisation des transporteurs et le niveau de cholestérol sont tous liés au cytosquelette, à la mobilité, et à la composition des membranes cellulaires. Toutes ces fonctions sont importantes pour les astrocytes pour acquérir leur morphologie in vivo. Les astrocytes PPARP -/- présentent un défaut de stellation, aussi bien en présence de neurones que de stimuli chimiques, ainsi qu'un plus grand nombre de fibres de stress (actine) et de structures d'adhésion cellulaire. Bien que les astrocytes non stellaires soient principalement observés in vitro, le défaut de stellation des astrocytes primaires PPARp -/- indique une incapacité à répondre aux différents stimuli extérieurs. Ces phénotypes morphologiques corrèlent avec une migration plus lente en cas de lésion de la culture.Ce travail de thèse a permis de démontrer l'implication de PPARP dans le métabolisme du glucose des astrocytes corticaux. L'absence de ce récepteur nucléaire amène à l'utilisation du glucose intracellulaire, auquel s'ajoutent les effets sur l'import du glutamate et la migration des astrocytes. PPARp aurait des effets neuroprotecteurs, et de ce fait pourrait être utilisé à des fins thérapeutiques.

Regulation of intestinal cholesterol transport and metabolism by high glucose levels = Régulation intestinale du transport et du métabolisme du cholestérol par le glucose

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Régulation du métabolisme et du transport des lipides dans les macrophages : potentiel anti-athérosclérotique des ligands du CD36

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés. Le récepteur CD36, exprimé à la surface des macrophages, joue un rôle déterminant dans l’internalisation des lipoprotéines oxydées menant à la formation des cellules spumeuses dans l’espace sous endothélial, première étape du développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons montré précédemment que les sécrétines de l’hormone de croissance sont des ligands du récepteur CD36 qui possèdent un site de liaison qui chevauche celui des lipoprotéines oxydées. Cependant, aucune étude n’avait rapporté les effets potentiels des ligands sélectifs du CD36 sur la progression des lésions athérosclérotiques et le métabolisme lipidique au niveau des macrophages. Ainsi, ce projet de doctorat visait à évaluer le potentiel anti-athérosclérotique du EP 80317, un ligand sélectif du CD36, et élucider les mécanismes à l’origine de ses effets sur le métabolisme et le transport des lipides au niveau des macrophages. À cette fin, des souris déficientes en apolipoprotéine E (apoE-/-), nourries avec une diète riche en lipides et en cholestérol, ont été traitées quotidiennement pendant 12 semaines avec le EP 80317, montrant un puissant effet anti-athérosclérotique associé à une réduction de 51% des lésions aortiques et de 30% du taux plasmatique de cholestérol total. Cette même étude a permis de montrer une réduction de l’internalisation des lipoprotéines oxydées ainsi qu’une augmentation de l’expression des gènes/protéines impliqués dans l’efflux du cholestérol au niveau des macrophages, comme le peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), liver x receptor α (LXRα) et les transporteurs ABCA1 et ABCG1, entraînant une réduction de la formation des cellules spumeuses. Ces observations nous ont conduits à élucider les mécanismes moléculaires engendrés par la liaison d’un ligand sélectif au récepteur CD36 dans les macrophages. Les études ont permis de montrer que les ligands du CD36 entraînent une augmentation de l’efflux du cholestérol vers les transporteurs ABCA1 et ABCG1 en augmentant l’expression protéique de la cyclooxygénase 2 (COX-2) consécutive à la phosphorylation de la MAP kinase ERK1/2. L’activation de COX-2 stimule la production intracellulaire de la prostaglandine 15d-PGJ2, cette dernière conduisant à l’activation du PPARγ. Finalement, une troisième étude nous a permis de mettre en évidence les effets du EP 80317 sur le transport inverse du cholestérol in vivo. L’injection de macrophages J774 radiomarqués avec du cholestérol tritié dans la cavité péritonéale de souris avec le EP 80317 nous a permis de montrer que le EP 80317 entraîne une réduction de la radioactivité retrouvée dans le foie tandis qu’il augmente celle retrouvée dans les fèces par comparaison aux souris contrôles, sans néanmoins modifier le profil plasmatique du radiotraceur entre les deux groupes. De plus, l’expression des gènes impliqués dans le transport du cholestérol au niveau intestinal comme le LXRα, ABCA1, ABCG5 ainsi que ABCG8 ont été régulés à la hausse par le EP 80317 tandis que l’expression de NPC1L1, un transporteur impliqué dans l’absorption du cholestérol, a été régulé à la baisse. Toutefois, les gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol au niveau du foie ne sont pas modulés par le EP 80317. En conclusion, les travaux effectués dans le cadre de cette thèse nous ont permis de montrer que l’activation du récepteur CD36 par le EP 80317 pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l’athérosclérose. Les effets anti-athérosclérotiques et hypocholestérolémiants des ligands synthétiques du récepteur CD36 sont en partie engendrés par 1) la régulation du métabolisme des lipides au niveau des macrophages en réponse à l’activation du PPARγ par son ligand endogène, le 15d-PGJ2 et 2) par une augmentation du transport inverse du cholestérol, particulièrement par une augmentation de l’efflux transintestinal.

Étude de l'implication des navettes du pyruvate découlant du métabolisme mitochondrial du glucose dans la régulation de la sécrétion d'insuline par les cellules bêta pancréatiques

Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par une résistance à l’insuline des tissus périphériques et par une incapacité des cellules β pancréatiques à sécréter les niveaux d’insuline appropriés afin de compenser pour cette résistance. Pour mieux comprendre les mécanismes déficients dans les cellules β des patients diabétiques, il est nécessaire de comprendre et de définir les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Dans les cellules β pancréatiques, le métabolisme du glucose conduit à la production de facteurs de couplage métabolique, comme l’ATP, nécessaires à la régulation de l’exocytose des vésicules d’insuline. Le mécanisme par lequel la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose déclenche l’exocytose des vésicules d’insuline est bien décrit dans la littérature. Cependant, il ne peut à lui seul réguler adéquatement la sécrétion d’insuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage métaboliques qui ont été suggérés afin de relier le métabolisme du glucose à la régulation de la sécrétion d’insuline. Les mécanismes impliqués demeurent cependant à être caractérisés. Le but de la présente thèse était de déterminer l’implication des navettes du pyruvate, découlant du métabolisme mitochondrial du glucose, dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans les cellules β, les navettes du pyruvate découlent de la combinaison des processus d’anaplérose et de cataplérose et permettent la transduction des signaux métaboliques provenant du métabolisme du glucose. Dans une première étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la navette pyruvate/citrate dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose, puisque cette navette conduit à la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage métabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux métabolique à travers la glycolyse en réoxydation le NADH. Une étude effectuée précédemment dans notre laboratoire avait suggéré la présence de cette navette dans les cellules β pancréatique. Afin de tester notre hypothèse, nous avons ciblé trois étapes de cette navette dans la lignée cellulaire β pancréatique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et l’activité de l’ATP-citrate lyase (ACL) et l’enzyme malique (MEc), deux enzymes clés de la navette pyruvate/citrate. L’inhibition de chacune de ces étapes par l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interférant a corrélé avec une réduction significative de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Les résultats obtenus suggèrent que la navette pyruvate/citrate joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Parallèlement à notre étude, deux autres groupes de recherche ont suggéré que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate étaient aussi importantes pour la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ainsi, trois navettes découlant du métabolisme mitochondrial du glucose pourraient être impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’insuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage métabolique possiblement très important pour la sécrétion d’insuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est formé par MEc, alors que l’isocitrate déshydrogénase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate. Dans notre première étude, nous avions démontré l’importance de l’expression de ME pour la sécrétion adéquate d’insuline en réponse au glucose. Dans notre deuxième étude, nous avons testé l’implication de IDHc dans les mécanismes de régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. La diminution de l’expression de IDHc dans les INS 832/13 a stimulé la sécrétion d’insuline en réponse au glucose par un mécanisme indépendant de la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose. Ce résultat a ensuite été confirmé dans les cellules dispersées des îlots pancréatiques de rat. Nous avons aussi observé dans notre modèle que l’incorporation du glucose en acides gras était augmentée, suggérant que la diminution de l’activité de IDHc favorise la redirection du métabolisme de l’isocitrate à travers la navette pyruvate/citrate. Un mécanisme de compensation à travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la sécrétion d’insuline observée en réponse à la diminution de l’expression de IDHc. Les travaux effectués dans cette deuxième étude remettent en question l’implication de l’activité de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate, dans la transduction des signaux métaboliques reliant le métabolisme du glucose à la sécrétion d’insuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate à conduire à la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules β. Le malonyl-CoA régule le métabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transférase 1, l’enzyme limitante dans l’oxydation des acides gras. Ainsi, l’élévation des niveaux de malonyl-CoA en réponse au glucose entraîne une redirection du métabolisme des acides gras vers les processus d’estérification puis de lipolyse. Plus précisément, les acides gras sont métabolisés à travers le cycle des triglycérides/acides gras libres (qui combinent les voies métaboliques d’estérification et de lipolyse), afin de produire des molécules lipidiques signalétiques nécessaires à la modulation de la sécrétion d’insuline. Des études effectuées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que l’activité lipolytique de HSL (de l’anglais hormone-sensitive lipase) était importante, mais non suffisante, pour la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans une étude complémentaire, nous nous sommes intéressés au rôle d’une autre lipase, soit ATGL (de l’anglais adipose triglyceride lipase), dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et aux acides gras. Nous avons démontré que ATGL est exprimé dans les cellules β pancréatiques et que son activité contribue significativement à la lipolyse. Une réduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interférant ou son absence dans les îlots pancréatiques de souris déficientes en ATGL a conduit à une réduction de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose en présence ou en absence d’acides gras. Ces résultats appuient l’hypothèse que la lipolyse est une composante importante de la régulation de la sécrétion d’insuline dans les cellules β pancréatiques. En conclusion, les résultats obtenus dans cette thèse suggèrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ce mécanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du métabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question l’implication de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Le rôle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant à être déterminé. Finalement, nos travaux ont aussi démontré un rôle pour ATGL et la lipolyse dans les mécanismes de couplage métabolique régulant la sécrétion d’insuline.

Contribution de la muqueuse intestinale au métabolisme présystémique du diltiazem chez le lapin et chez l'homme

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Impact du métabolisme périphérique du mivacurium sur la modélisation pharmacocinétique et pharmacodynamique de l'effet myorelaxant chez la patient jeune et âgé

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Impact du métabolisme périphérique du mivacurium sur la modélisation pharmacocinétique et pharmacodynamique de l'effet myorelaxant chez la patient jeune et âgé

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 contribuent au maintien de l’homéostasie du cholestérol intratesticulaire

Le testicule assure la production des spermatozoïdes et la sécrétion de la testostérone. Chaque fonction est assumée par un compartiment cellulaire distinct: l’épithélium séminifère et le tissu interstitiel. Le cholestérol, présent dans les deux compartiments, est un composé indispensable aux membranes cellulaires et un précurseur essentiel de la testostérone. Dans le compartiment interstitiel, environ 40 % du cholestérol utilisé pour la production hormonale est importé du sang à partir des lipoprotéines HDL et/ou LDL. Dans l’épithélium séminifère, la cellule de Sertoli assure le contrôle et le maintien de la spermatogenèse. Elle a la capacité de synthétiser du cholestérol à partir de l’acétate in vitro, néanmoins, il n’y a pas d’évidence qu’elle le fait in vivo. De plus il existe, au niveau des tubules séminifères, une barrière hémato-testiculaire qui empêche le libre passage de plusieurs composés sanguins, y compris le cholestérol. Nous avons testé l’hypothèse qu’il existe des moyens d’importation du cholestérol sanguin, mais aussi l’exportation du cholestérol intra-tissulaire, qui contourneraient cette barrière et qui contribueraient au maintien du taux intratubulaire du cholestérol compatible avec le bon déroulement de la spermatogenèse. Nous avons comparé les taux de variation de l’expression de l’ARNm et de la protéine des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 aux taux de variation du cholestérol libre et estérifié au cours de la spermatogenèse chez les souris normales durant le développement postnatal. Afin de mieux apprécier le niveau d’implication de chacun de ces récepteurs, nous avons examiné comment la suppression du gène d’une enzyme comme la lypase hormono-sensible (HSL) ou de celui d’un transporteur de cholestérol comme SR-BI, CD36 ou NPC1 était compensée et comment cette suppression affectait le taux de cholestérol libre et estérifié dans chacun des deux compartiments cellulaires du testicule. Nous avons dans un premier temps mis au point une nouvelle technique d’isolation des testicules en fraction enrichie en tissu interstitiel (ITf) et en tubules séminifères (STf) qui a l’avantage de mieux préserver l’intégrité des formes phosphorylées et glycosylées des protéines comparée aux techniques préexistantes. Les résultats de nos analyses ont montré que l’expression de SR-BI et CD36 étaient maximales dans les ITf au moment où les souris ont complété leur maturité sexuelle et où le niveau de synthèse de la testostérone était maximal. Dans les tubules séminifères, l’expression maximale de SR-BI et le taux le plus élevé de cholestérol estérifié étaient mesurés de façon concomitante à 35 jours après la naissance, au moment où la première vague de l’activité spermatogénétique était complétée. L’expression de l’ABCA1 était maximale au moment où le taux de cholestérol était élevé et minimale au moment où le taux de cholestérol était le plus bas, alors que le niveau d’expression de CD36 était maximal chez l’adulte au moment où le taux de spermiation était le plus élevé. L’expression de SR-BII variait peu dans les deux compartiments cellulaires durant le développement. La suppression génétique de la HSL et de NPC1, qui cause une infertilité chez les souris mâles, était accompagnée d’une accumulation de cholestérol libre et estérifié dans les tubules séminifères. Par contre, la suppression génétique de SR-BI et CD36, qui ne causent pas d’infertilité chez les souris mâles était sans impact significatif sur le taux de cholestérol intratubulaire. Nous avons montré que l’invalidation génétique d’un transporteur sélectif ou d’une enzyme du métabolisme du cholestérol était accompagnée d’un ensemble de mécanismes de compensation visant à maintenir le taux de cholestérol libre aux niveaux semblables à ceux mesurés dans les fractions tissulaires de souris normales. Ensemble, nos résultats ont montré que l’expression des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 variait en fonction de la spermatogenèse et du taux intratesticulaire du cholestérol suggérant leur contribution au maintien de l’homéostasie du cholestérol intratesticulaire.

Caractérisation et régulation du métabolisme des acides gras dans l’hypothalamus

Un déséquilibre de la balance énergétique constitue la principale cause du développement des pathologies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2. Au sein du cerveau, l’hypothalamus joue un rôle primordial dans le contrôle de la prise alimentaire et du métabolisme périphérique via le système nerveux autonome. Ce contrôle, repose sur l’existence de différentes populations neuronales au sein de l’hypothalamus médio-basal (MBH), neurones à neuropeptide Y (NPY)/Agouti-related peptide (AgRP), et neurones a proopiomelanocortine (POMC), dont l’activité est directement modulée par les variations des taux circulants des nutriments tels que le glucose et les acides gras (FA). Alors que les mécanismes de détection et le métabolisme intracellulaire du glucose ont été largement étudiés, l’implication du métabolisme intracellulaire des FA dans leurs effets centraux, est très peu comprise. De plus, on ignore si le glucose, module le métabolisme intracellulaire des acides gras à longue chaine (LCFA) dans le MBH. Le but de notre première étude est, de déterminer l'impact du glucose sur le métabolisme des LCFA, le rôle de l’AMP-activated protein kinase (AMPK), kinase détectrice du statut énergétique cellulaire, et d'établir s’il y a des changements dans le métabolisme des LCFA en fonction de leur structure, du type cellulaire et de la région cérébrale. Nos résultats montrent que le glucose inhibe l'oxydation du palmitate via l’AMPK dans les neurones et les astrocytes primaires hypothalamiques, in vitro, ainsi que dans les explants du MBH, ex vivo, mais pas dans les astrocytes et les explants corticaux. De plus, le glucose augmente l'estérification du palmitate et non de l’oléate dans les neurones et les explants du MBH, mais pas dans les astrocytes hypothalamiques. Ces résultats décrivent le devenir métabolique de différents LCFA dans le MBH, ainsi que, la régulation AMPK - dépendante de leur métabolisme par le glucose dans les astrocytes et les neurones, et démontrent pour la première fois que le métabolisme du glucose et des LCFA est couplé spécifiquement dans les noyaux du MBH, dont le rôle est critique pour le contrôle de l'équilibre énergétique. Le deuxième volet de cette thèse s’est intéressé à déterminer les mécanismes intracellulaires impliqués dans le rôle de la protéine de liaison ACBP dans le métabolisme central des FA. Nous avons démontré que le métabolisme de l’oléate et non celui du palmitate est dépendant de la protéine ACBP, dans les astrocytes hypothalamiques ainsi que dans les explants du MBH. Ainsi, nos résultats démontrent qu’ACBP, protéine identifiée originellement au niveau central, comme un modulateur allostérique des récepteurs GABA, agit comme un régulateur du métabolisme intracellulaire des FA. Ces résultats ouvrent de nouvelles pistes de recherche liées à la régulation du métabolisme des acides gras au niveau central, ainsi que, la nouvelle fonction de la protéine ACBP dans la régulation du métabolisme des FA au niveau du système nerveux central. Ceci aiderait à identifier des cibles moléculaires pouvant contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques de pathologies telles que l’obésité et le diabète de type 2.

Modulation du métabolisme du glucose astrocytaire par les cytokines pro-inflammatoires et le peptide beta-amyloïde. A la recherche d'une composante gliale aux processus neurodégénératifs

Résumé large public: Une altération localisée du métabolisme du glucose, le substrat énergétique préférentiellement utilisé dans le cerveau, est un trait caractéristique précoce de la maladie d'Alzheimer (MA). Il est maintenant largement admis que le beta-amyloïde, la neuroinflammation et le stress oxydatif participent au développement de la MA. Cependant les mécanismes cellulaires de la pathogenèse restent à identifier. Le métabolisme cérébral a ceci de remarquable qu'il repose sur la coopération entre deux types cellulaires, ainsi les astrocytes et les neurones constituent une unité métabolique. Les astrocytes sont notamment responsables de fournir aux neurones des substrats énergétiques, ainsi que des précurseurs du glutathion pour la défense contre le stress oxydatif. Ces fonctions astrocytaires sont essentielles au bon fonctionnement et à la survie neuronale; par conséquent, une altération de ces fonctions astrocytaires pourrait participer au développement de certaines maladies cérébrales. Le but de ce travail est, dans un premier temps, d'explorer les effets de médiateurs de la neuroinflammation (les cytokines pro-inflammatoires) et du peptide beta-amyloïde sur le métabolisme des astrocytes corticaux, en se focalisant sur les éléments en lien avec le métabolisme énergétique et le stress oxydatif. Puis, dans un second temps, de caractériser les conséquences pour les neurones des modifications du métabolisme astrocytaire induites par ces substances. Les résultats obtenus ici montrent que les cytokines pro-inflammatoires et le beta-amyloïde induisent une profonde altération du métabolisme astrocytaire, selon deux profils distincts. Les cytokines pro-inflammatoires, particulièrement en combinaison, agissent comme « découpleurs » du métabolisme énergétique du glucose, en diminuant l'apport potentiel de substrats énergétiques aux neurones. En plus de son effet propre, le peptide beta-amyloïde potentialise les effets des cytokines pro-inflammatoires. Or, dans le cerveau de patients atteints de la MA, les astrocytes sont exposés simultanément à ces deux types de substances. Les deux types de substances ont un effet ambivalent en termes de stress oxydatif. Ils induisent à la fois une augmentation de la libération de glutathion (potentiellement protecteur pour les neurones voisins) et la production d'espèces réactives de l'oxygène (potentiellement toxiques). Etant donné l'importance de la coopération entre astrocytes et neurones, ces modulations du métabolisme astrocytaire pourraient donc avoir un retentissement majeur sur les cellules environnantes, et en particulier sur la fonction et la survie neuronale. Résumé Les astrocytes et les neurones constituent une unité métabolique. Les astrocytes sont notamment responsables de fournir aux neurones des substrats énergétiques, tels que le lactate, ainsi que des précurseurs du glutathion pour la défense contre le stress oxydatif. Une altération localisée du métabolisme du glucose, le substrat énergétique préférentiellement utilisé dans le cerveau, est un trait caractéristique, précoce, de la maladie d'Alzheimer (MA). Il est maintenant largement admis que le beta-amyloïde, la neuroinflammation et le stress oxydatif participent au développement de la MA. Cependant, les mécanismes cellulaires de la pathogenèse restent à identifier. Le but de ce travail est d'explorer les effets des cytokines pro-inflammatoires (Il-1 ß et TNFα) et du beta-amyloïde (Aß) sur le métabolisme du glucose des astrocytes corticaux en culture primaire ainsi que de caractériser les conséquences, pour la viabilité des neurones voisins, des modifications du métabolisme astrocytaire induites par ces substances. Les résultats obtenus montrent que les cytokines pro-inflammatoires et le beta-amyloïde induisent une profonde altération du métabolisme astrocytaire, selon deux profils distincts. Les cytokines pro-inflammatoires, particulièrement en combinaison, agissent comme « découpleurs » du métabolisme glycolytique astrocytaire. Après 48 heures, le traitement avec TNFα et Il-lß cause une augmentation de la capture de glucose et de son métabolisme dans la voie des pentoses phosphates et dans le cycle de Krebs. A l'inverse, il cause une diminution de la libération de lactate et des stocks cellulaires de glycogène. En combinaison avec les cytokines tel qu'in vivo dans les cerveaux de patients atteints de MA, le peptide betaamyloïde potentialise les effets décrits ci-dessus. Isolément, le Aß cause une augmentation coordonnée de la capture de glucose et de toutes les voies de son métabolisme (libération de lactate, glycogenèse, voie des pentoses phosphate et cycle de Krebs). Les traitements altèrent peu les taux de glutathion intracellulaires, par contre ils augmentent massivement la libération de glutathion dans le milieu extracellulaire. A l'inverse, les deux types de traitements augmentent la production intracellulaire d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). De plus, les cytokines pro-inflammatoires en combinaison augmentent massivement la production des ROS dans l'espace extracellulaire. Afin de caractériser l'impact de ces altérations métaboliques sur la viabilité des neurones environnants, un modèle de co-culture et des milieux conditionnés astrocytaires ont été utilisés. Les résultats montrent qu'en l'absence d'une source exogène d'antioxydants, la présence d'astrocytes favorise la viabilité neuronale ainsi que leur défense contre le stress oxydatif. Cette propriété n'est cependant pas modulée par les différents traitements. D'autre part, la présence d'astrocytes, et non de milieu conditionné, protège les neurones contre l'excitotoxicité due au glutamate. Les astrocytes prétraités (aussi bien avec le beta-amyloïde qu'avec les cytokines pro-inflammatoires) perdent cette propriété. Cet élément suggère que la perturbation du métabolisme astrocytaire causé par les cytokines pro-inflammatoires ou le beta-amyloïde pourrait participer à l'atteinte de la viabilité neuronale associée à certaines pathologies neurodégénératives.

Modélisation toxicocinétique du benzo(a)pyrène et 3-hydroxybenzo(a)pyrène pour l’interprétation des données de surveillance biologique de l’exposition chez les travailleurs

De nombreux travailleurs sont exposés aux hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP). Le benzo(a)pyrène (BaP) fait partie de ce groupe de polluants. Cette substance a été classée cancérogène reconnu chez l’humain. Pour évaluer l'exposition aux HAP cancérogènes, plusieurs chercheurs ont proposé d’utiliser la mesure du 3-hydroxybenzo(a)pyrène (3-OHBaP) dans l’urine des travailleurs exposés. Dans le cadre du présent projet, deux approches de modélisation ont été développées et appliquées pour permettre une meilleure compréhension de la toxicocinétique du BaP et son biomarqueur d’intérêt actuel, le 3-OHBaP, et pour aider à interpréter les résultats de surveillance biologique. Un modèle toxicocinétique à plusieurs compartiments a été développé sur la base des données préalablement obtenues sur le rat par notre groupe. Selon le modèle, le BaP injecté par voie intraveineuse est rapidement distribué du sang vers les tissus (t½ ≈ 4 h), avec une affinité particulière pour les poumons et les composantes lipidiques des tissus. Le BaP est ensuite distribué vers la peau et le foie. Au foie, le BaP est promptement métabolisé et le 3-OHBaP est formé avec une demi-vie de ≈ 3 h. Le métabolisme pulmonaire du BaP a également été pris en compte, mais sa contribution à la cinétique globale du BaP a été jugée négligeable. Une fois formé, le 3-OHBaP est distribué vers les différents organes presque aussi rapidement que la molécule mère (t½ ≈ 2 h). Le profil temporel du 3-OHBaP dans le rein montre une accumulation transitoire en raison de la différence observée entre le taux d’entrée (t½ = 28 min) et le taux de sortie (t½ = 4,5 h). La clairance totale de 3-OHBaP du corps est principalement gouvernée par le taux de transfert de la bile vers le tractus gastro-intestinal (t½ ≈ 4 h). Le modèle toxicocinétique à plusieurs compartiments a réussi à simuler un ensemble indépendant de profils urinaires publiés sur le 3-OHBaP. Ce modèle toxicocinétique à compartiments s'est avéré utile pour la determination des facteurs biologiques déterminants de la cinétique du BaP et du 3-OHBaP. Par la suite, un modèle pharmacocinétique à base physiologique (PCBP) reproduisant le devenir du BaP et du 3-OHBaP chez le rat a été construit. Les organes (ou tissus) représentés comme des compartiments ont été choisis en fonction de données expérimentales obtenues in vivo chez le rat. Les coefficients de partition, les coefficients de perméabilité, les taux de métabolisation, les paramètres d'excrétion, les fractions absorbées et les taux d'absorption pour différentes voies d’exposition ont été obtenus directement à partir des profils sanguins, tissulaires, urinaires et fécaux du BaP et du 3-OHBaP. Les valeurs de ces derniers paramètres ont été calculées par des procédures Monte-Carlo. Des analyses de sensibilité ont ensuite été réalisées pour s’assurer de la stabilité du modèle et pour établir les paramètres les plus sensibles de la cinétique globale. Cette modélisation a permis d’identifier les facteurs déterminants de la cinétique: 1) la sensibilité élevée des paramètres de la métabolisation hépatique du BaP et du 3-OHBaP ainsi que du taux d'élimination; 2) la forte distribution du BaP dans les poumons par rapport à d'autres tissus; 3) la distribution considérable du BaP dans les tissus adipeux et le foie; 4) la forte distribution du 3-OHBaP dans les reins; 5) le transfert limité du BaP par la diffusion tissulaire dans les poumons; 6) le transfert limité du 3-OHBaP par la diffusion tissulaire dans les poumons, les tissus adipeux et les reins; 7) la recirculation entéro-hépatique significative du 3-OHBaP. Suite à des analyses de qualité des ajustements des équations du modèle aux données observées, les probabilités que les simulations reproduisent les données expérimentales par pur hasard se sont avérées toujours inférieures à 10% pour les quatre voies d’exposition : intraveineuse, orale, cutanée et respiratoire. Nous avons extrapolé les modèles cinétiques du rat à l’humain afin de se doter d’un outil permettant de reconstituer les doses absorbées chez des travailleurs exposés dans diverses industries à partir de mesures de l'évolution temporelle du 3-OHBaP dans leur urine. Les résultats de ces modélisations ont ensuite été comparés à ceux de simulations obtenues avec un modèle toxicocinétique à compartiment unique pour vérifier l’utilité comparative d’un modèle simple et complexe. Les deux types de modèle ont ainsi été construits à partir de profils sanguins, tissulaires, urinaires et fécaux du BaP et du 3-OHBaP sur des rats exposés. Ces données ont été obtenues in vivo par voie intraveineuse, cutanée, respiratoire et orale. Ensuite, les modèles ont été extrapolés à l’humain en tenant compte des déterminants biologiques essentiels des différences cinétiques entre le rat et l’humain. Les résultats ont montré que l'inhalation n'était pas la principale voie d'exposition pour plusieurs travailleurs étudiés. Les valeurs de concentrations de BaP dans l’air utilisées afin de simuler les profils d’excrétion urinaire chez les travailleurs étaient différentes des valeurs de concentrations de BaP mesurées dans l’air. Une exposition au BaP par voie cutanée semblait mieux prédire les profils temporels observés. Finalement, les deux types de modélisation se sont avérés utiles pour reproduire et pour interpréter les données disponibles chez des travailleurs.

Unusual astrocyte reactivity caused by the food mycotoxin ochratoxin A in aggregating rat brain cell cultures.

Ochratoxin A (OTA), a mycotoxin and widespread food contaminant, is known for its patent nephrotoxicity and potential neurotoxicity. Previous observations in vitro showed that in the CNS, glial cells were particularly sensitive to OTA. In the search for the molecular mechanisms underlying OTA neurotoxicity, we investigated the relationship between OTA toxicity and glial reactivity, in serum-free aggregating brain cell cultures. Using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction to analyze changes in gene expression, we found that in astrocytes, non cytotoxic concentrations of OTA down-regulated glial fibrillary acidic protein, while it up-regulated vimentin and the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma expression. OTA also up-regulated the inducible nitric oxide synthase and the heme oxygenase-1. These OTA-induced alterations in gene expression were more pronounced in cultures at an advanced stage of maturation. The natural peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand, 15-deoxy-delta(12,14) prostaglandin J2, and the cyclic AMP analog, bromo cyclic AMP, significantly attenuated the strong induction of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and inducible nitric oxide synthase, while they partially reversed the inhibitory effect of OTA on glial fibrillary acidic protein. The present results show that OTA affects the cytoskeletal integrity of astrocytes as well as the expression of genes pertaining to the brain inflammatory response system, and suggest that a relationship exists between the inflammatory events and the cytoskeletal changes induced by OTA. Furthermore, these results suggest that, by inducing an atypical glial reactivity, OTA may severely affect the neuroprotective capacity of glial cells.

Métabolisme énergétique de la femme enceinte [Energy metabolism in the pregnant woman].

The maternal and foetal anabolic phase characterizing pregnancy requires energy storage and hence a state of positive energy balance. Dietary surveys, however, have shown an increase in energy intake during pregnancy of small magnitude only. Furthermore, indirect calorimetry measurements indicate an elevation of basal or resting energy expenditure (EE), particularly during the 3rd trimester of pregnancy. These results are confirmed by measurements performed in a respiration chamber which showed that the rate of 24 hours EE of pregnant women is significantly more elevated in the 3rd trimester than in the nonpregnant state; the latter is explained by a rise of basal EE and to a smaller extent by an increase in energy cost of moving around as a result of the greater body weight. In contrast, when the results are expressed per unit body weight, the difference in 24 hours EE observed during pregnancy disappeared. It seems that energy sparing mechanisms-which are still largely unknown-may come into play during this period: postprandial thermogenesis appears to be blunted during pregnancy. This indicates an increase in net efficiency of food energy utilization. The degree of adaptation of physical activity-which has not been previously investigated-remains a research topic of great interest for the future.

Cerebral Lactate Metabolism After Traumatic Brain Injury.

Cerebral energy dysfunction has emerged as an important determinant of prognosis following traumatic brain injury (TBI). A number of studies using cerebral microdialysis, positron emission tomography, and jugular bulb oximetry to explore cerebral metabolism in patients with TBI have demonstrated a critical decrease in the availability of the main energy substrate of brain cells (i.e., glucose). Energy dysfunction induces adaptations of cerebral metabolism that include the utilization of alternative energy resources that the brain constitutively has, such as lactate. Two decades of experimental and human investigations have convincingly shown that lactate stands as a major actor of cerebral metabolism. Glutamate-induced activation of glycolysis stimulates lactate production from glucose in astrocytes, with subsequent lactate transfer to neurons (astrocyte-neuron lactate shuttle). Lactate is not only used as an extra energy substrate but also acts as a signaling molecule and regulator of systemic and brain glucose use in the cerebral circulation. In animal models of brain injury (e.g., TBI, stroke), supplementation with exogenous lactate exerts significant neuroprotection. Here, we summarize the main clinical studies showing the pivotal role of lactate and cerebral lactate metabolism after TBI. We also review pilot interventional studies that examined exogenous lactate supplementation in patients with TBI and found hypertonic lactate infusions had several beneficial properties on the injured brain, including decrease of brain edema, improvement of neuroenergetics via a "cerebral glucose-sparing effect," and increase of cerebral blood flow. Hypertonic lactate represents a promising area of therapeutic investigation; however, larger studies are needed to further examine mechanisms of action and impact on outcome.

Régulation de l'activité transcriptionnelle de PPARgamma via l'activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a : potentiel anti-athérosclérotique

Les sécrétines peptidiques de l’hormone de croissance (GHRPs) constituent une classe de peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance (GH). Cette activité est médiée par leur liaison à un récepteur couplé aux protéines G : le récepteur des sécrétines de l’hormone de croissance (GHS-R1a), identifié subséquemment comme le récepteur de la ghréline. La ghréline est un peptide de 28 acides aminés sécrété principalement par les cellules de la muqueuse de l’estomac, qui exerce de nombreux effets périphériques indépendamment de la sécrétion de l’hormone de croissance. Les effets indépendants de la sécrétion de GH incluent, entre autres, des actions sur le contrôle de la prise de nourriture, le métabolisme énergétique, la fonction cardiaque, le système immunitaire et la prolifération cellulaire. L’étude de la distribution périphérique des sites de liaison des GHRPs nous a permis d’identifier un second site, le CD36, un récepteur scavenger exprimé dans plusieurs tissus dont le myocarde, l’endothélium de la microvasculature et les monocytes/macrophages. Le CD36 exprimé à la surface du macrophage joue un rôle clé dans l’initiation du développement de l’athérosclérose par la liaison et l’internalisation des lipoprotéines de faible densité oxydées (LDLox) dans l’espace sous-endothélial de l’artère. L’hexaréline, un analogue GHRP, a été développé comme agent thérapeutique pour stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance par l’hypophyse. Sa propriété de liaison aux récepteurs GHS-R1a et CD36 situés en périphérie et particulièrement sa capacité d’interférer avec la liaison des LDLox par le CD36 nous ont incité à évaluer la capacité de l’hexaréline à moduler le métabolisme lipidique du macrophage. L’objectif principal de ce projet a été de déterminer les effets de l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a, par l’hexaréline et la ghréline, le ligand endogène du GHS-R1a, sur la physiologie du macrophage et de déterminer son potentiel anti-athérosclérotique. Les résultats montrent premièrement que l’hexaréline et la ghréline augmentent l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1, impliqués dans le transport inverse du cholestérol, via un mécanisme contrôlé par le récepteur nucléaire PPARγ. La régulation de l’activité transcriptionnelle de PPARγ par l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a se fait indépendamment de la présence du domaine de liaison du ligand (LBD) de PPARγ et est conséquente de changements dans l’état de phosphorylation de PPARγ. Une étude plus approfondie de la signalisation résultant de la liaison de la ghréline sur le GHS-R1a révèle que PPARγ est activé par un mécanisme de concertation entre les voies de signalisation Gαq/PI3-K/Akt et Fyn/Dok-1/ERK au niveau du macrophage. Le rôle de PPARγ dans la régulation du métabolisme lipidique par l’hexaréline a été démontré par l’utilisation de macrophages de souris hétérozygotes pour le gène de Ppar gamma, qui présentent une forte diminution de l’activation des gènes de la cascade métabolique PPARγ-LXRα-transporteurs ABC en réponse à l’hexaréline. L’injection quotidienne d’hexaréline à un modèle de souris prédisposées au développement de l’athérosclérose, les souris déficientes en apoE sous une diète riche en cholestérol et en lipides, se traduit également en une diminution significative de la présence de lésions athérosclérotiques correspondant à une augmentation de l’expression des gènes cibles de PPARγ et LXRα dans les macrophages péritonéaux provenant des animaux traités à l’hexaréline. L’ensemble des résultats obtenus dans cette thèse identifie certains nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de PPARγ et du métabolisme du cholestérol dans le macrophage via les récepteurs CD36 et GHS-R1a. Ils pourraient servir de cibles thérapeutiques dans une perspective de traitement des maladies cardiovasculaires.