Integração de pAN7-1 no genoma de Magnaporthe grisea mediada por enzima de restrição

Visando explorar a mutagênese insercional em Magnaporthe grisea, foram avaliadas a transformação dos protoplastos obtidos após adequação do protocolo e a eficiência da integração de pAN7-1 no genoma do ascomiceto na presença da enzima de restrição Hind III. Os protoplastos de M. grisea I-22 foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando o vetor linearizado com Hind III foi usado para transformar o fungo na presença de Hind III, a eficiência de transformação foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da enzima. No geral, a melhor concentração de Hind III foi 5 unidades/reação de transformação. Tal concentração promoveu a produção média de 332 transformantes/µg de pAN7-1/10(7) protoplastos. A presença do gene de seleção hph no genoma de 18 indivíduos resistentes à higromicina foi confirmada por PCR.

Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA) pode diferenciar Fusarium solani f. sp. phaseoli de F. solani f. sp. glycines

Métodos moleculares têm sido utilizados para caracterizar a diversidade entre isolados de Fusarium spp. patogênicos e não patogênicos a uma cultura e, para determinar relações genéticas entre formae speciales. Testes de patogenicidade realizados em soja (Glycine max) e feijoeiro (Phaseolus vulgaris) com 17 isolados de Fusarium solani não demonstraram especificidade de hospedeiros. Utilizou-se a técnica ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) para analisar a região ITS1 - 5,8S rDNA - ITS2, amplificada com os primers ITS5 e ITS4. Os produtos amplificados foram digeridos com as enzimas de restrição Hae III e Msp I. Os padrões de bandas gerados pela digestão com a enzima Hae III permitiram diferenciar três grupos entre os isolados de F. solani, sendo um grupo específico para isolados de F. solani f. sp. phaseoli com 100% de similaridade entre os 11 isolados. Entre os isolados de F. solani f. sp glycines foram observados dois padrões distintos de restrição. A técnica de ARDRA utilizando a enzima Hae III apresenta, portanto, potencial para utilização como um marcador para diferenciação entre as formae specialesphaseoli e glycines, dentro do complexo F. solani.

Bioecologia e caracterização molecular de Bulinus globosus de Angola

Parasitologia médica

Estrogen receptor dependent genetic and epigenetic factors of tamoxifen resistance

Resumo: A decisão da terapêutica hormonal no tratamento do cancro da mama baseiase na determinação do receptor de estrogénio alfa por imunohistoquímica (IHC). Contudo, a presença deste receptor não prediz a resposta em todas as situações, em parte devido a limitações do método IHC. Investigámos se a expressão dos genes ESR1 e ESR2, bem como a metilação dos respectivos promotores, pode estar relacionada com a evolução desfavorável de uma proporção de doentes tratados com tamoxifeno assim como com a perda dos receptores de estrogénio alfa (ERα) e beta (ERß). Amostras de 211 doentes com cancro da mama diagnosticado entre 1988 e 2004, fixadas em formalina e preservadas em parafina, foram utilizadas para a determinação por IHC da presença dos receptores ERα e ERß. O mRNA total do gene ESR1 e os níveis específicos do transcrito derivado do promotor C (ESR1_C), bem como dos transcritos ESR2_ß1, ESR2_ß2/cx, and ESR2_ß5 foram avaliados por Real-time PCR. Os promotores A e C do gene ESR1 e os promotores 0K e 0N do gene ESR2 foram investigados por análise de metilação dos dinucleotidos CpG usando bisulfite-PCR para análise com enzimas de restrição, ou para methylation specific PCR. Atendendo aos resultados promissores relacionados com a metilação do promotor do gene ESR1, complementamos o estudo com um método quantitativo por matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) suportado pelo software Epityper para a medição da metilação nos promotores A e C. Fez-se a avaliação da estabilidade do mRNA nas linhas celulares de cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231 tratadas com actinomicina D. Baixos níveis do transcrito ESR1_C associaram-se a uma melhor sobrevivência global (p = 0.017). Níveis elevados do transcrito ESR1_C associaram-se a uma resposta inferior ao tamoxifeno (HR = 2.48; CI 95% 1.24-4.99), um efeito mais pronunciado em doentes com tumores de fenótipo ERα/PgR duplamente positivo (HR = 3.41; CI 95% 1.45-8.04). A isoforma ESR1_C mostrou ter uma semi-vida prolongada, bem como uma estrutura secundária da região 5’UTR muito mais relaxada em comparação com a isoforma ESR1_A. A análise por Western-blot mostrou que ao nível da 21 proteína, a selectividade de promotores é indistinguivel. Não se detectou qualquer correlação entre os níveis das isoformas do gene ESR2 ou entre a metilação dos promotores do gene ESR2, e a detecção da proteína ERß. A metilação do promotor C do gene ESR1, e não do promotor A, foi responsável pela perda do receptor ERα. Estes resultados sugerem que os níveis do transcrito ESR1_C sejam usados como um novo potencial marcador para o prognóstico e predição de resposta ao tratamento com tamoxifeno em doentes com cancro da mama. Abstract: The decision of endocrine breast cancer treatment relies on ERα IHC-based assessment. However, ER positivity does not predict response in all cases in part due to IHC methodological limitations. We investigated whether ESR1 and ESR2 gene expression and respective promoter methylation may be related to non-favorable outcome of a proportion of tamoxifen treated patients as well as to ERα and ERß loss. Formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer samples from 211 patients diagnosed between 1988 and 2004 were submitted to IHC-based ERα and ERß protein determination. ESR1 whole mRNA and promoter C specific transcript levels, as well as ESR2_ß1, ESR2_ß2/cx, and ESR2_ß5 transcripts were assessed by real-time PCR. ESR1 promoters A and C, and ESR2 promoters 0N and 0K were investigated by CpG methylation analysis using bisulfite-PCR for restriction analysis, or methylation specific PCR. Due to the promising results related to ESR1 promoter methylation, we have used a quantification method by matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF MS) together with Epityper software to measure methylation at promoters A and C. mRNA stability was assessed in actinomycin D treated MCF-7 and MDA-MB-231 cells. ERα protein was quantified using transiently transfected breast cancer cells. Low ESR1_C transcript levels were associated with better overall survival (p = 0.017). High levels of ESR1_C transcript were associated with non-favorable response in tamoxifen treated patients (HR = 2.48; CI 95% 1.24-4.99), an effect that was more pronounced in patients with ERα/PgR double-positive tumors (HR = 3.41; CI 95% 1.45-8.04). The ESR1_C isoform had a prolonged mRNA half-life and a more relaxed 5’UTR structure compared to ESR1_A isoform. Western-blot analysis showed that at protein level, the promoter selectivity is undistinguishable. There was no correlation between levels of ESR2 isoforms or ESR2 promoter methylation and ERß protein staining. ESR1 promoter C CpG methylation and not promoter A was responsible for ERα loss. We propose ESR1_C levels as a putative novel marker for breast cancer prognosis and prediction of tamoxifen response.

Resistência à sulfadoxina-pirimetamina em Maputo, Moçambique: presença de mutações nos genes dhfr e dhps do Plasmodium falciparum

Foram analisadas a freqüência e distribuição de mutações nos genes dihidrofolato redutase e dihidropteroato sintetase do Plasmodium falciparum, usando a metodologia de reação em cadeia da polimerase e polimorfismos de hidrólise por enzimas de restrição, em amostras de sangue infectado proveniente de crianças moçambicanas, residentes em Maputo. A análise foi feita antes e 7 dias após o tratamento com sulfadoxina-pirimetamina (S/P). Os resultados mostraram a ocorrência de mutações pontuais nos genes estudados e a presença de combinações de três alelos em dhfr (51Ile, 59Arg e 108Asn) e do quintúplo mutante (dhfr 51Ile, 59Arg, 108Asn e dhps 437Gly, 540Glu), ambas situações associadas à falha terapêutica no sétimo dia após tratamento com S/P. Esses achados mostram a importância de se estudar a resistência à S/P em Moçambique, e como os marcadores moleculares de resistência aos antimaláricos podem fornecer dados importantes para a política nacional de controlo da malária.

Introducing resistance genes against ToMV, TYLCV and TSWV infections in two tomato varieties (Muchamiel and De la Pera)

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas

Avaliação da biodiversidade de rizóbios simbiontes do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) em Santa Catarina

Os solos brasileiros, em geral, apresentam uma população abundante de rizóbios capazes de nodular e fixar N2 em simbiose com o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.); contudo, a diversidade dessas bactérias ainda é pouco conhecida. Este estudo teve por objetivo conhecer a biodiversidade de microssimbiontes do feijoeiro em Santa Catarina e, para isso, foram obtidos 117 isolados de nódulos de plantas coletadas em campo, em 23 áreas do extremo oeste, do meio oeste e do planalto sul catarinense. Com base nos atributos morfofisiológicos, os isolados foram classificados em nove grupos. Pela análise dos perfis de DNA após a amplificação (PCR) com o "primer" BOX, que codifica regiões conservadas e repetidas do genoma, 107 perfis distintos foram agrupados em um nível final de similaridade de apenas 26,9 %. Os perfis obtidos pela amplificação do gene 16S ribossômico - referência na taxonomia atual de procariotos - seguida pela digestão com três enzimas de restrição (técnica de RFLP-PCR), resultaram em seis agrupamentos principais e cinco bactérias isoladas. As populações consistiram de 17,1 % de Rhizobium tropici, 35,9 % de R. etli, 32,5 % de R. leguminosarum, 1,7 % de R. giardinii e 12,8 % com perfis distintos das espécies descritas de rizóbios de feijoeiro. R. tropici predominou em solos ácidos do meio oeste e do planalto sul, R. leguminosarum não foi detectado no extremo oeste e R. etli ocorreu nas três regiões, essas duas últimas espécies em solos menos ácidos. Os resultados enfatizam a diversidade genética elevada de rizóbios, inter e intra-específica, nos solos catarinenses, inclusive com a indicação de novas espécies.

Caracterização genética de rizóbios nativos dos tabuleiros costeiros eficientes em culturas do guandu e caupi

O objetivo deste trabalho foi caracterizar geneticamente sete estirpes de rizóbios nativos dos tabuleiros costeiros de Sergipe com alta eficiência de fixação biológica do N2 em associação com guandu (Cajanus cajan) e caupi (Vigna unguiculata). A amplificação do DNA pela técnica de PCR (polymerase chain reaction) com o oligonucleotídeo específico BOX indicou um grau elevado de diversidade genética, uma vez que todas as estirpes apresentaram perfis únicos de DNA. A análise por BOX-PCR revelou, ainda, que essa metodologia é eficiente para diferenciar estirpes, mas não para a diferenciação de espécies de rizóbio. Pela técnica do RFLP (restriction fragment length polymorphism) da região do DNA que codifica o gene 16S rRNA e da região intergênica entre os genes 16S e 23S rRNA, com cinco enzimas de restrição, bem como pelo seqüenciamento parcial da região do 16S rRNA, foi possível classificar as estirpes nos gêneros Bradyrhizobium e Rhizobium. Houve coerência entre as análises envolvendo a região do 16S rRNA, mas o agrupamento com uma das estirpes diferiu pela análise do espaço intergênico. Os resultados obtidos com a estirpe R11 indicam variabilidade genética elevada em relação às espécies de rizóbios descritas, inclusive diferindo em diversas bases da região do 16S rRNA, e podem indicar uma nova espécie.

Identificação e caracterização de genes vip e cry coleóptero‑específicos em isolados de Bacillus thuringiensis

O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar os genes cry3, vip1, vip2 e vip1/vip2 em uma coleção de 1.078 isolados de Bacillus thuringiensis potencialmente tóxicos para larvas de coleópteros. Foram utilizados pares de oligonucleotídeos iniciadores gerais obtidos a partir de regiões conservadas dos genes e do alinhamento de sequências consenso. Posteriormente, os isolados positivos foram caracterizados por meio da técnica de PCR‑RFLP, tendo-se utilizado enzimas de restrição específicas, para identificar novas subclasses de genes nos isolados. Cento e cinquenta e um isolados foram positivos para os genes avaliados, com maior frequência para o gene vip1/vip2 (139 isolados). Pela técnica de PCR‑RFLP, foram observados 14 perfis polimórficos, o que indica a presença de diferentes alelos e, consequentemente, de distintas subclasses desses genes.

Endonuclease com incompatibilidade heteroduplex para detectar mutação e variações genéticas de inibidores da tripsina em soja

O objetivo deste trabalho foi avaliar a variação genética do inibidor de tripsina em variedades cultivadas (Glycine max) e silvestres (Glycine soja) de soja. Foram avaliadas as variações genéticas do inibidor de tripsina Kunitz, representado pela proteína 21-kDa (KTI), e do inibidor de tripsina-quimotripsina Bowman-Birk (BBI), em variedades de soja cultivadas (G. max) e selvagens (G. soja). Ensaios de clivagem foram feitos com endonuclease de incompatibilidade heteroduplex, para a detectar mutações no gene de KTI, com uma única nuclease específica de cadeia simples, obtida a partir de extractos de aipo (CEL I). As variedades de soja estudadas apresentaram baixo nível de variação genética em KTI e BBI. A análise por PCR -RFLP dividiu o BBI-A em A1 e A2 e mostrou que o Tib do KTI é o tipo dominante. A digestão com enzimas de restrição não foi capaz de detectar diferenças entre os tipos de ti-null e outros alelos Ti, enquanto o ensaio com endonucleases com incompatibilidade heteroduplex com CEL I pôde detectar o tipo ti-null. O método de digestão com CEL I fornece uma ferramenta genética simples e útil para a análise de SNP. O método apresentado pode ser utilizado como ferramenta para a triagem rápida e útil de genótipos desejáveis em futuros programas de melhoramento de soja.

Desenvolvimento de marcadores moleculares para análogos a genes de resistência em Arachis spp. silvestres

O maior grupo de genes de resistência de plantas já clonados codifica para proteínas com um sítio de ligação a nucleotídios (NBS) na região N-terminal, e um domínio rico em repetições de leucina (LRR) na região C-terminal. Genes desta classe conferem resistência a diversos patógenos incluindo vírus, bactérias, fungos e nematóides. Para diferentes espécies do gênero Arachis, primers de "polymerase chain reaction" (PCR) degenerados foram construídos para a região NBS, e o produto de tradução putativo indicou similaridade com proteínas de resistência conhecidas sendo denominados análogos a genes de resistência (RGAs). Doze destes RGAs foram utilizados para o desenvolvimento de marcadores moleculares baseados em seus padrões de hibridização com DNA de Arachis spp. digerido com enzimas de restrição. Inicialmente, avaliou-se o polimorfismo de cada RGA como sonda nos parentais de uma população de mapeamento, contrastantes quanto à resistência as manchas foliares e nematóides das galhas, e no híbrido F1. Os RGAs, mesmo isolados de espécies diferentes do gênero Arachis apresentaram homologia com o DNA das espécies testadas, além de apresentarem múltiplas cópias e alto polimorfismo na progênie F2. Todas estas características tornam estes RGAs marcadores moleculares altamente informativos, sendo que alguns apresentaram segregação em "clusters" na F2, indicando que seus locos estão ligados. Estes marcadores serão incluídos em um mapa genético de Arachis spp., o que será de grande utilidade para os programas de melhoramento do amendoim (Arachis hypogaea) cultivado.

Identidade molecular dos fitoplasmas associados aos enfezamentos do tomateiro e da berinjela com base na análise do gene 16S rDNA

Doenças de hortaliças de ocorrência no território brasileiro e em outras áreas do mundo têm sido associadas a diversos fitoplasmas. Na região de Piracicaba-SP e Bragança Paulista-SP, em plantas de tomate e berinjela foram observados sintomas típicos de enfezamento caracterizados por porte reduzido, clorose foliar, superbrotamento de ramos, desenvolvimento anormal do cálice, encurtamento de entre-nós, redução no tamanho de folhas, flores e frutos. Através de duplo PCR, utilizando os iniciadores R16 mF1/mR2 e R16 F2n/R2, fragmentos de DNA de 1,2 kb foram amplificados de amostras sintomáticas, demonstrando a presença de fitoplasma nos tecidos das plantas. O uso de iniciadores específicos demonstrou que estes fitoplasmas eram afiliados ao grupo 16SrIII. Análises de RFLP, usando as enzimas de restrição AluI, HpaII, KpnI, MboI, MseI e RsaI confirmaram que os fitoplasmas detectados eram representantes do grupo 16SrIII. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados em Escherichia coli, sequenciados e comparados, por homologia de seqüência, entre si e com outros fitoplasmas do grupo 16SrIII. Um índice de similaridade de seqüência acima de 95% foi encontrado quando seqüências dos fitoplasmas detectados em tomate e berinjela foram comparadas com aquelas de outros representantes do grupo 16SrIII. Um índice de 98-99% foi obtido quando seqüências dos fitoplasmas encontrados em tomate e berinjela foram comparadas entre si. Estes resultados evidenciaram que o enfezamento do tomateiro e da berinjela podem estar associados a um mesmo fitoplasma, com base na análise de seqüências do gene do 16S rDNA.

Candidatus Phytoplasma brasiliense associado ao superbrotamento do hibisco (Hibiscus rosa-sinensis L.) no Estado de São Paulo

Plantas de hibisco com superbrotamento e definhamento seguido de morte têm sido observadas nos municípios de São Paulo, Campinas e Piracicaba. Como os sintomas são sugestivos daqueles induzidos por fitoplasmas, o presente trabalho buscou identificar o possível fitoplasma associado com a doença. Assim, 14 plantas sintomáticas de hibisco foram coletadas em Piracicaba (SP) e submetidas ao PCR duplo com os primers P1/Tint-R16F2n/R2 e ao exame em microscópio eletrônico de transmissão. A identificação foi realizada por análise de RFLP com as enzimas de restrição BfaI, DraI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MseI, RsaI e TaqI. Testes de transmissão foram conduzidos com enxertia de ramos e uso de Cuscuta subinclusa. Os resultados de nested-PCR revelaram a presença consistente de fitoplasmas em todas as plantas sintomáticas e foram confirmados pela observação de corpúsculos pleomórficos no floema, através da microscopia eletrônica. A análise de RFLP mostrou que o fitoplasma encontrado em hibisco pertence ao grupo 16SrXV, o mesmo grupo do Candidatus Phytoplasma brasiliense. O fitoplasma foi transmitido de planta doente para sadia, tanto pela enxertia como pela C. subinclusa, demonstrando ser o agente do superbrotamento do hibisco.

Variabilidade genética entre isolados de Colletotrichum gossypii do algodoeiro

O algodoeiro é atacado por Colletotrichum gossypii (CG) e C. gossypii var. cephalosporioides (CGC). Ambos os patógenos são transmitidos pela semente e sua distinção morfológica é extremamente difícil e inconsistente. Tentativas foram feitas no presente trabalho para verificar a variabilidade genética entre CG e CGC através de RAPD-PCR, ERIC- e REP-PCR e PCR-RFLP da região ITS rDNA. Foram utilizados 53 isolados coletados de sementes e folhas de plantas de diferentes cultivares nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso, Minas Gerais, e Paraiba, entre 1999 e 2003. Baseado em testes de patogenicidade, vinte e um isolados foram classificados como CG e 32 como CGC. Os resultados obtidos por RAPD-PCR, utilizando-se oito primers, revelaram dois grupos distintos sendo que o primeiro foi formado por 94% dos isolados de sementes e o segundo por 95% dos isolados de folhas. Na análise de ERIC- e REP-PCR, resultados semelhantes a RAPD foram obtidos, sendo que o primeiro grupo foi formado por 93% dos isolados provenientes das sementes e o segundo por 78% dos isolados provenientes das folhas. Quando o produto de amplificação da região ITS rDNA foi digerido com oito enzimas de restrição, um perfil de bandas semelhante para todos os isolados foi obtido. Resultados de RAPD, ERIC- e REP-PCR demonstraram que existem diferenças genéticas entre os isolados provenientes das sementes e aqueles provenientes de parte aérea, e esses dois grupos foram claramente distintos. Estudos futuros devem ser realizados utilizando outras técnicas moleculares para a obtenção de marcadores capazes de distinguir entre isolados de CG e CGC.

Extração de DNA genômico de tecidos foliares maduros de espécies nativas do cerrado

Grandes quantidades de contaminantes na amostra de DNA dificultam a obtenção de DNA genômico de qualidade durante a extração. A presença de polissacarídeos, fenóis e outros compostos secundários representa o principal problema com o procedimento de isolamento do DNA e sua aplicação subsequente, por inibir a atividade das enzimas Taq DNA polimera-se e enzimas de restrição. Neste estudo, descreveu-se um procedimento modificado baseado no hexadecyltrimethylammonium (CTAB), rendendo DNA genômico satisfatório para técnicas de manipulação subsequente, como reações de PCR e digestão com enzima de restrição. Nesse protocolo foram utilizadas diferentes concentrações de β-mercaptoetanol no tampão de extração (0,0; 0,2; 10; 15; 25; e 50 uL de β-mercaptoetanol/mL do tampão de extração: 100 mM de Tris-HCl, pH 8; 20 mM de EDTA; 1,4 mM de NaCl; 2% de CTAB; 1% de PVP), cujo procedimento foi aplicado no caso de folhas maduras e testado em Annona crassiflora (arati-cum), Eugenia dysenterica (cagaita), Anacardium humilis (caju-do-campo), Hancornia speciosa (mangaba) e Caryocar brasiliense (pequi). O protocolo foi eficiente no isolamento de DNA livre de polissacarídeos e polifenóis, com rendimento do DNA com alto peso molecu-lar, utilizando-se concentrações a partir de 1% de β-mercaptoetanol no tampão de extração. O DNA isolado por esse método mostrou alta pureza, de acordo com as análises de digestão por restrição e amplificação por PCR.