Análise de inosina-5'-monofosfato (5'-IMP) e seus derivados em diferentes músculos de bovinos, suínos e ovinos

As concentrações de inosina-5'-monofosfato e seus derivados (adenosina monofosfato, hipoxantina e inosina) nos músculos Psoas major, Latissimus dorsi, Tensor fascia e Extensor carpi radialis de bovinos, suínos e ovinos foram determinadas através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). A Análise de Variância (ANOVA) dos dados mostraram que as concentrações de 5'-IMP e seus derivados foram significativamente diferentes entre as três espécies (p < 0,001). A maior concentração de 5'-IMP foi detectada nos músculos de ovinos (média de 108,2 mg/100g) seguida pelos de suínos (média de 97 mg/100g) e pelos de bovinos (média de 69,3 mg/100g). Houve variações significativas nas concentrações no músculo, entre os animais nas espécies bovina (p < 0,01) e ovina (p < 0,05), porém não entre os da espécie suína (p > 0,05). Não houve diferenças significativas entre os tipos de músculo em bovinos e ovinos (p > 0,05), mas em suínos (p < 0,01) observou-se variação significativa.

Inosina extracelular como intermediária na silnalização do TNF-alfa em células de sertóli em cultura

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.

Tratamentos de pré-resfriamento e resfriamento sobre a qualidade de carne de peito de frango

O total de 402 frangos foi processado em abatedouro comercial e submetido a seis tratamentos de resfriamento. Inicialmente as carcaças foram pré-resfriadas (PR) por imersão em água e gelo, seguido de resfriamento (R) a -35°C e estocagem a 4°C por 20 horas. Os tratamentos foram: a (0°C/30min, -35°C/3h e 15min), b (10°C/30min, 0°C/30min, -35°C/2h e 45 min), c (10°C/30min, -35°C/3h e 15min), d (20°C/30min, 0°C/30min, -35°C/2h e 45min), e (20°C/30min, -35°C/3h e 15min) e F (20°C/30min, 0°C/3h e 15min). Temperaturas baixas utilizadas após a evisceração aceleraram a instalação do rigor em músculos pectoralis major (PM). Aos 45min post mortem carcaças sem PR (A) ou PR a 10°C (B) tiveram músculo PM com menor (P<0,001) pH (5,75 e 5,81) do que carcaças PR a 20°C (D) (5,95). Às 4h p.m, nos tratamentos A e B as médias de valor R* foram (P<0,05) mais elevadas (1,51 e 1,44) que o no tratamento D (1,32). O teor de luminosidade foi influenciado (P<0,001) pelas temperaturas de R (nos tratamentos A, B e C as médias foram de 48,2; 47,7 e 47,6 e nos tratamentos D e E de 45,5 e 45,7, respectivamente). Os teores de luminosidade mais elevados coincidiram com tratamentos com rápida glicólise post mortem. A perda de peso por cozimento e a força de cisalhamento não revelaram efeito dos tratamentos. * razão entre as absorbâncias de 250nm e 260nm, que avalia a quantidade de monofosfato de inosina (IMP) para trifosfato de adenosina (ATP)

Alterações bioquímicas post-mortem de matrinxã Brycon cephalus (Günther, 1869) procedente da piscicultura, mantido em gelo

No presente trabalho, foram estudadas as alterações bioquímicas post-mortem que ocorreram em matrinxã Brycon cephalus (Günther, 1869) procedente da piscicultura e mantido em gelo em Manaus - AM. Foi determinado o tempo de estocagem em gelo por meio das avaliações sensoriais físicas e gustativas, das análises de pH, Nitrogênio das Bases Voláteis Totais (N-BVT) e bacteriológicas durante 29 dias. Foram determinados os índices de rigor-mortis, as concentrações de ATP e seus produtos de degradações e o valor K. De acordo com a composição química, o peixe foi classificado como "semi-gordo". Os peixes entraram em rigor-mortis aos 75 minutos após a morte por hipotermia, tendo permanecido durante 10 dias. As avaliações sensoriais (físicas e gustativas) mostraram que os peixes apresentaram condição de consumo até 26 dias. As análises de ATP e de seus produtos de degradação mostraram que a referida espécie foi considerada formadora de inosina (HxR), nas condições de experimento. O valor K mostrou que os exemplares de matrinxãs permaneceram "muito frescos" até 16 dias de estocagem em gelo, concordante com a avaliação sensorial gustativa.

Identificação das características cinéticas, expressão e localização das ecto-nucleotidases em cultura de astrócitos e linhagens de gliomas

Nucleotídeos extracelulares são envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Astrócitos são a maior fonte de nucleotídeos extracelulares da adenina no cérebro e também importantes alvos para as ações desses nucleotídeos via receptores purinérgicos P2. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ecto-nucleotidases, que incluem membros da família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase), ecto-5’-nucleotidase (ecto- 5’N) e ecto-adenosina deaminase (ADA). Culturas de astrócitos preparadas de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos foram capazes de rapidamente converter ATP extracelular a ADP, que foi então hidrolizado a AMP. Os nucleosídeos tri-fosfatados foram hidrolisados preferencialmente aos difosfatados em todas as estruturas cerebrais. A análise cinética sugere que varias ecto-nucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Análises preliminares de mRNA por PCR indicaram que astrócitos expressam múltiplos membros da família das NTPDases (NTPDase1 a NTPDase3 e NTPDase5/6). Por RT-PCR quantitativo (Real-time PCR), nós identificamos a NTPDase2 (CD39L1) como a NTPDase predominante expressa por astrócitos de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos. Astrócitos do cerebelo apresentaram um padrão diferente para a hidrólise do AMP, com uma atividade específica 7 vezes maior, quando comparada com astrócitos de hipocampo e córtex. Uma maior expressão da ecto-5’N por RT-PCR foi identificada nessa estrutura. Não houve acúmulo de adenosina extracelular em todas as estruturas estudadas, indicando a presença de uma alta atividade ecto-adenosina deaminase em astrócitos. Dipiridamol aumentou significativamente os níveis de inosina no meio extracelular de astrócitos de hipocampo e córtex, mas não em astrócitos de cerebelo. Essas diferenças observadas podem indicar heterogeneidade funcional dos nucleotídeos no cérebro. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos como indicadoras da invasividade e agressividade dos gliomas malignos, nós avaliamos a degradação dos nucleotídeos extracelulares em cinco linhagens de gliomas diferentes e comparamos com astrócitos. Todas as linhagens de gliomas examinadas apresentaram baixas razões de hidrólise quando comparadas com astrócitos. Resultados preliminares sugerem que a falta de expressão da NTPDase1 e 2 possam ser responsáveis pela baixa hidrólise de ATP nas linhagens de gliomas. Considerando que o ATP é reconhecido como um fator mitogênico que induz a proliferação em células de gliomas, a substancial diminuição na hidrólise de ATP e ADP observadas em gliomas, sugere que alterações na via das ecto-nucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna desse tipo de tumor.

Quercetina : efeitos sobre parâmetros proliferativos e sobre a ecto-5'-nucleotidase em linhagem de glioma humano U138MG

Gliomas são os mais comuns e devastadores tumores primários do sistema nervoso central. Os nucleotídeos da adenina são moléculas sinalizadoras no meio extracelular, envolvidas em importantes condições fisiológicas e patológicas. O ATP, neurotransmissor excitatório, e a adenosina, neuromoduladora, entre outros efeitos, podem induzir proliferação celular em linhagens de gliomas. Os eventos induzidos pelos nucleotídeos extracelulares são controlados pela ação das E-NTPDases, que hidrolisam o ATP até adenosina extracelularmente. Recentes estudos epidemiológicos têm sugerido que os flavonóides derivados da dieta, em particular a quercetina, apresentam um papel benéfico em prevenir ou inibir a tumorigênese. Assim, primeiramente nós avaliamos o efeito antiproliferativo da quercetina em linhagem de glioma humano U138MG. O estudo demonstrou que este flavonóide induziu em cultura de gliomas: (1) diminuição da proliferação e da viabilidade celular; (2) morte celular via necrose e apoptose; (3) parada no ciclo celular na fase G2 e (4) diminuição do índice mitótico. Além disso, nós demonstramos que a quercetina, enquanto promoveu regressão tumoral, protegeu culturas organotípicas hipocampais do dano isquêmico. Em conjunto, esses dados sugerem que a quercetina exibe efeitos antiproliferativos direcionados para as células tumorais e reduzida citotoxicidade para células normais, características altamente desejáveis na quimioterapia. Dados do nosso laboratório demonstram que o metabolismo extracelular das purinas encontra-se alterado em linhagens de gliomas com relação a culturas de astrócitos, sugerindo que mudanças no sistema purinérgico podem ser uma característica dos gliomas que potencialmente podem contribuir para o seu fenótipo de malignidade. Assim, o passo seguinte desse trabalho foi investigar o perfil de secreção dos derivados da adenina, o metabolismo extracelular do AMP e a ação da quercetina sobre o sistema purinérgico. As culturas de glioma apresentaram secreção de ATP, o qual foi detectado em maiores níveis com relação as outras moléculas avaliadas, ADP, AMP, adenosina e inosina. O AMP extracelular foi eficientemente metabolizado pelos gliomas, demonstrando uma ecto-5’-NT/CD73 muito ativa. Adicionalmente, quercetina interagiu com o sistema purinérgico, inibindo não-competitivamente a atividade da ecto-5’-NT/CD73 e modulando negativamente a sua expressão. Nós sugerimos que a inibição da atividade da ecto-5’-NT/CD73 pode resultar em um decréscimo na disponibilidade de adenosina extracelular, uma promotora tumoral. Tal efeito pode estar correlacionado com a inibição da proliferação promovida pela quercetina nessa linhagem de glioma. Nossos dados sugerem que a quercetina pode ter uma função importante na inibição da proliferação dos gliomas, atuando em diferentes vias de sinalização, incluindo o sistema purinérgico. Assim, esse estudo abre novas perspectivas para as potenciais aplicações dos flavonóides na prevenção e tratamento de tumores cerebrais.

Síntese de pró-fármaco recíproco derivado do ácido micofenólico

O transplante de órgãos é um processo em que se transferem tecidos e/ou órgãos sólidos de um doador vivo ou cadavérico para um hospedeiro. A resposta imune aos aloantígenos, antígenos de um membro da mesma espécie, do doador, caracteriza o processo de rejeição de órgãos. As reações de hipersensibilidade são causadas por respostas imunes controladas inadequadamente, como na formação de complexos antígeno-anticorpo circulantes no Lúpus Eritematoso Sistêmico, ou direcionadas ao tecido do paciente, por resposta de anticorpos, como na Febre Reumática Aguda, e por resposta linfocitária, como na Esclerose Múltipla. A terapia farmacológica para transplantes de órgãos e para reações de hipersensibilidade se baseia na utilização de fármacos imunossupressores, como a prednisona, ciclosporina, anticorpos monoclonais, ácido micofenólico e azatioprina. A talidomida, fármaco com propriedades inibidoras da produção de Fator de Necrose Tumoral Alfa em monócitos, atua como imunossupressor e anti-inflamatório, com atividade de interesse para o tratamento destas condições. Nesse contexto, foi sintetizada, purificada e caracterizada a estrutura química de um novo pró-fármaco planejado para atuar com mecanismo duplo de ação a saber: inibição da inosina 5’-monofosfato desidrogenase e da produção do fator de necrose tumoral alfa.

Síntese e avaliação farmacológica de pró-fármacos derivados do ácido micofenólico úteis na prevenção e no tratamento da rejeição de transplantes

Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas - FCFAR