The development of an immobilized enzyme reactor containing glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi: the effect of species' specific differences on the immobilization

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) plays an important role in the life cycle of the Trypanosoma cruzi, and an immobilized enzyme reactor (IMER) has been developed for use in the on-line screening for GAPDH inhibitors. An IMER containing human GAPDH has been previously reported; however, these conditions produced a T. cruzi GAPDH-IMER with poor activity and stability. The factors affecting the stability of the human and T. cruzi GAPDHs in the immobilization process and the influence of pH and buffer type on the stability and activity of the IMERs have been investigated. The resulting T. cruzi GAPDH-IMER was coupled to an analytical octyl column, which was used to achieve chromatographic separation of NAD+ from NADH. The production of NADH stimulated by D-glyceraldehyde-3-phosphate was used to investigate the activity and kinetic parameters of the immobilized T. cruzi GAPDH. The Michaelis-Menten constant (K-m) values determined for D-glyceraldehyde-3-phosphate and NAD(+) were K-m = 0.5 +/- 0.05 mM and 0.648 +/- 0.08 mM, respectively, which were consistent with the values obtained using the non-immobilized enzyme.

Germinação de sementes de azedinha (Oxalis hirsutissima), espécie medicinal de Mato Grosso, Brasil

Sementes de azedinha (Oxalis hirsutissima Mart. & Zuc.) apresentam um baixo percentual de germinação, dificultando a propagação dessa espécie medicinal, tão utilizada pelas populações tradicionais da região contra as inflamações oculares. Sementes coletadas de uma população nativa em Poconé, no Estado de Mato Grosso, foram submetidas a dois ensaios de quebra de dormência. No primeiro foram usados 12 tratamentos: pré-embebição em água por 24, 36, 48, 69 e 96 horas, imersão em acetona por 10 e 40 minutos, imersão em ácido clorídrico por 10 e 40 segundos, imersão em álcool etílico 96° por 10 e 40 segundos, e sem pré-tratamento. No segundo ensaio foram usados 14 tratamentos: imersão em água quente (70 ºC) por 20, 40, 60 e 300 segundos; em água muito quente (85 ºC) por 20, 40, 120 e 300 segundos, em água fervendo (100 °C) por 10, 20,40, 120 e 300 segundos, e sem pré-tratamento. A imersão em ácido clorídrico por 40 segundos diferiu estatisticamente dos demais, e mesmo assim a porcentagem de germinação foi baixa (47%). A imersão em água quente (70 ºC) por 300 segundos e em água muito quente (85 ºC) por 40 segundos mostraram os melhores resultados, com 89 e 92% de germinação, respectivamente. A água fervendo (100 ºC) por 300 segundos reduziu a percentagem de germinação a 4%.

Métodos para superação da dormência e biometria de frutos e sementes de Parkia nitida Miquel. (Leguminosae - Mimosoideae)

Foram realizadas avaliações biométricas em frutos e sementes de Parkia nitida e estudado o efeito dos tratamentos escarificação mecânica sem (T2) e com (T3) aplicação do fungicida Benomyl; imersão em Η2Ο a 80°C (T4) e a 100°C (T5); imersão em H2SO4 durante 10 (T6), 20 (T7), 40 (T8) e 80 (T9) minutos, na superação da dormência das sementes. Foram totalizadas as sementes germinadas aos 10, 20, 30 e 40 dias após a semeadura. O ensaio foi instalado com quatro repetições de 50 sementes, semeadas em substrato de vermiculita. O número de frutos/inflorescência variou de um a oito. O comprimento e largura dos frutos e o número de sementes/fruto variaram de 36,0 a 80,0 cm, de 4,6 a 6,5 cm e de 17 a 37 sementes, respectivamente. O comprimento, a largura e a espessura das sementes variaram de 16,1 a 24,0 mm, de 8,1 a 14,0 mm e de 5,1 a 9,0 mm, respectivamente. Houve interação significativa entre métodos para superação da dormência e dias decorridos após a semeadura na germinação das sementes. As análises de regressão mostraram significância para os tratamentos T2, T3, T4, T6 e T8. O T4 proporcionou apenas 10,0% de germinação; entretanto os tratamentos T2 e T3 tiveram efeito satisfatório, com 50,0% e 72,5% de germinação, respectivamente. Os tratamentos com H2SO4 estiveram entre os mais eficientes, com 80,0%, 82,5%, 80,5% e 74,5%, durante 10, 20, 40 e 80 minutos de imersão, respectivamente. As percentagens de germinação para o T1 (testemunha) e T5 foram inferiores a 2,5%. Concluiu-se que sementes de P. nitida apresentam dormência devido à impermeabilidade do tegumento à água; é necessária a escarificação das sementes para se obter elevada percentagem de germinação; tratamentos com H2SO4, por 20 minutos, e escarificação mecânica + fungicida constituem-se métodos eficientes para superação da dormência.

Characterization of glutaraldehyde-immobilized chymotrypsin and an in-situ immobilized enzyme reactor using capillary electrophoresis-based peptide mapping

La digestion enzymatique des protéines est une méthode de base pour les études protéomiques ainsi que pour le séquençage en mode « bottom-up ». Les enzymes sont ajoutées soit en solution (phase homogène), soit directement sur le gel polyacrylamide selon la méthode déjà utilisée pour l’isolation de la protéine. Les enzymes protéolytiques immobilisées, c’est-à-dire insolubles, offrent plusieurs avantages tels que la réutilisation de l’enzyme, un rapport élevé d’enzyme-sur-substrat, et une intégration facile avec les systèmes fluidiques. Dans cette étude, la chymotrypsine (CT) a été immobilisée par réticulation avec le glutaraldehyde (GA), ce qui crée des particules insolubles. L’efficacité d’immobilisation, déterminée par spectrophotométrie d’absorbance, était de 96% de la masse totale de la CT ajouté. Plusieurs différentes conditions d’immobilisation (i.e., réticulation) tels que la composition/pH du tampon et la masse de CT durant la réticulation ainsi que les différentes conditions d’entreposage tels que la température, durée et humidité pour les particules GA-CT ont été évaluées par comparaison des cartes peptidiques en électrophorèse capillaire (CE) des protéines standards digérées par les particules. Les particules de GA-CT ont été utilisés pour digérer la BSA comme exemple d’une protéine repliée large qui requit une dénaturation préalable à la digestion, et pour digérer la caséine marquée avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme exemple d’un substrat dérivé afin de vérifier l’activité enzymatique du GA-CT dans la présence des groupements fluorescents liés au substrat. La cartographie peptidique des digestions par les particules GA-CT a été réalisée par CE avec la détection par absorbance ultraviolet (UV) ou fluorescence induite par laser. La caséine-FITC a été, en effet, digérée par GA-CT au même degré que par la CT libre (i.e., soluble). Un microréacteur enzymatique (IMER) a été fabriqué par immobilisation de la CT dans un capillaire de silice fondu du diamètre interne de 250 µm prétraité avec du 3-aminopropyltriéthoxysilane afin de fonctionnaliser la paroi interne avec les groupements amines. Le GA a été réagit avec les groupements amine puis la CT a été immobilisée par réticulation avec le GA. Les IMERs à base de GA-CT étaient préparé à l’aide d’un système CE automatisé puis utilisé pour digérer la BSA, la myoglobine, un peptide ayant 9 résidus et un dipeptide comme exemples des substrats ayant taille large, moyenne et petite, respectivement. La comparaison des cartes peptidiques des digestats obtenues par CE-UV ou CE-spectrométrie de masse nous permettent d’étudier les conditions d’immobilisation en fonction de la composition et le pH du tampon et le temps de réaction de la réticulation. Une étude par microscopie de fluorescence, un outil utilisé pour examiner l’étendue et les endroits d’immobilisation GA-CT dans l’IMER, ont montré que l’immobilisation a eu lieu majoritairement sur la paroi et que la réticulation ne s’est étendue pas si loin au centre du capillaire qu’anticipée.

Solução de uma classe de equações diferenciais parciais em espaços de Niko'skii através do método de Galerkin

Neste trabalho apresenta-se uma solu c~ao para um problema abstrato de Cauchy. Basicamente, d a-se uma formula c~ao abstrata para certos tipos de equa c~oes diferenciais parciais n~ao lineares de evolu c~ao em espa cos de Nikol'skii, tais espa cos possuem boas propriedades de regularidade e resultados de imers~ao compacta, num certo sentido s~ao intermedi arios entre os espa cos de Holder e os espa cos de Sobolev. Aplicando o m etodo de Galerkin, prova-se resultados de exist^encia global de solu c~oes fracas, como tamb em a exist^encia de solu c~oes fracas com a propriedade de reprodu c~ao. E impondo mais hip oteses sobre os operadores envolvidos demonstra-se unicidade de solu c~oes fracas.