Les rôles distincts des isoformes de myosine II non-musculaire dans des processus cellulaires impliquant le cytosquelette d'actine.

Le complexe actomyosine, formé de l’association de la myosine II avec les filaments d’actine, stabilise le cytosquelette d’actine et génère la contraction cellulaire nécessaire à plusieurs processus comme la motilité et l’apoptose dans les cellules non-musculaires. La myosine II est un hexamère formé d’une paire de chaînes lourdes (MHCs) et de deux paires de chaînes légères MLC20 et MLC17. La régulation de l’activité de la myosine II, c'est-à-dire son interaction avec les filaments d’actine, est directement liée à l’état de phosphorylation des MLC20, mais il reste beaucoup à découvrir sur l’implication des MHCs. Il existe trois isoformes de MHCs de myosine II, MHCIIA, MHCIIB et MHCIIC qui possèdent des fonctions à la fois communes et distinctes. Notre but est de mettre en évidence les différences de fonction entre les isoformes de myosine II, au niveau structurale, dans la stabilisation du cytosquelette d’actine, et au niveau de leur activité contractile, dans la génération des forces de tension. Nous nous sommes intéressés au rôle des isoformes des MHCs dans l’activité du complexe actomyosine qui est sollicité durant le processus de contraction cellulaire de l’apoptose. Dans quatre lignées cellulaires différentes, le traitement conjoint au TNFα et à la cycloheximide causait la contraction et le rétrécissement des cellules suivi de leur détachement du support de culture. Par Western blot, nous avons confirmé que la phosphorylation des MLC20 est augmentée suite au clivage de ROCK1 par la caspase-3, permettant ainsi l’interaction entre la myosine II et les filaments d’actine et par conséquent, la contraction des cellules apoptotiques. Cette contraction est bloquée par l’inhibition des caspases et de ROCK1. MHCIIA est dégradée suite à l’activation de la caspase-3 alors que MHCIIB n’est pas affectée. En utilisant une lignée cellulaire déficiente en MHCIIB, ou MHCIIB (-/-), nous avons observé que la contraction et le détachement cellulaires durant l’induction de l’apoptose se produisaient moins rapidement que dans la lignée de type sauvage (Wt) ce qui suggère que l’isoforme B est impliquée dans la contraction des cellules apoptotiques. Parallèlement, la kinase atypique PKCζ, qui phosphoryle MHCIIB et non MHCIIA, est activée durant l’apoptose. PKCζ joue un rôle important puisque son inhibition bloque la contraction des cellules apoptotiques. Par la suite, nous nous sommes intéressés à la modulation de la morphologie cellulaire par la myosine II. Les fibroblastes MHCIIB (-/-), présentent un large lamellipode dont la formation semble dû uniquement à l’absence de l’isoforme MHCIIB, alors que les fibroblastes Wt ont une morphologie cellulaire étoilée. La formation du lamellipode dans les fibroblastes MHCIIB (-/-) est caractérisée par l’association de la cortactine avec la membrane plasmique. L’observation en microscopie confocale nous indique que MHCIIA interagit avec la cortactine dans les fibroblastes Wt mais très peu dans les fibroblastes MHCIIB (-/-). Le bFGF active la voie des MAP kinases dans les fibroblastes Wt et MHCIIB (-/-) et induit des extensions cellulaires aberrantes dans les fibroblastes MHCIIB (-/-). Nos résultats montrent que l’implication de l’isoforme B de la myosine II dans la modulation de la morphologie cellulaire. L’ensemble de nos résultats participe à distinguer la fonction structurale et contractile de chacune des isoformes de myosine II dans la physiologie cellulaire.

A proteome-wide strategy reveals a novel mechanism of control of cell cycle progression through modulation of cyclin mRNA stability

La quantité de données générée dans le cadre d'étude à grande échelle du réseau d'interaction protéine-protéine dépasse notre capacité à les analyser et à comprendre leur sens; d'une part, par leur complexité et leur volume, et d'un autre part, par la qualité du jeu de donnée produit qui semble bondé de faux positifs et de faux négatifs. Cette dissertation décrit une nouvelle méthode de criblage des interactions physique entre protéines à haut débit chez Saccharomyces cerevisiae, la complémentation de fragments protéiques (PCA). Cette approche est accomplie dans des cellules intactes dans les conditions natives des protéines; sous leur promoteur endogène et dans le respect des contextes de modifications post-traductionnelles et de localisations subcellulaires. Une application biologique de cette méthode a permis de démontrer la capacité de ce système rapporteur à répondre aux questions d'adaptation cellulaire à des stress, comme la famine en nutriments et un traitement à une drogue. Dans le premier chapitre de cette dissertation, nous avons présenté un criblage des paires d'interactions entre les protéines résultant des quelques 6000 cadres de lecture de Saccharomyces cerevisiae. Nous avons identifié 2770 interactions entre 1124 protéines. Nous avons estimé la qualité de notre criblage en le comparant à d'autres banques d'interaction. Nous avons réalisé que la majorité de nos interactions sont nouvelles, alors que le chevauchement avec les données des autres méthodes est large. Nous avons pris cette opportunité pour caractériser les facteurs déterminants dans la détection d'une interaction par PCA. Nous avons remarqué que notre approche est sous une contrainte stérique provenant de la nécessité des fragments rapporteurs à pouvoir se rejoindre dans l'espace cellulaire afin de récupérer l'activité observable de la sonde d'interaction. L'intégration de nos résultats aux connaissances des dynamiques de régulations génétiques et des modifications protéiques nous dirigera vers une meilleure compréhension des processus cellulaires complexes orchestrés aux niveaux moléculaires et structuraux dans les cellules vivantes. Nous avons appliqué notre méthode aux réarrangements dynamiques opérant durant l'adaptation de la cellule à des stress, comme la famine en nutriments et le traitement à une drogue. Cette investigation fait le détail de notre second chapitre. Nous avons déterminé de cette manière que l'équilibre entre les formes phosphorylées et déphosphorylées de l'arginine méthyltransférase de Saccharomyces cerevisiae, Hmt1, régulait du même coup sont assemblage en hexamère et son activité enzymatique. L'activité d'Hmt1 a directement un impact dans la progression du cycle cellulaire durant un stress, stabilisant les transcrits de CLB2 et permettant la synthèse de Cln3p. Nous avons utilisé notre criblage afin de déterminer les régulateurs de la phosphorylation d'Hmt1 dans un contexte de traitement à la rapamycin, un inhibiteur de la kinase cible de la rapamycin (TOR). Nous avons identifié la sous-unité catalytique de la phosphatase PP2a, Pph22, activé par l'inhibition de la kinase TOR et la kinase Dbf2, activé durant l'entrée en mitose de la cellule, comme la phosphatase et la kinase responsable de la modification d'Hmt1 et de ses fonctions de régulations dans le cycle cellulaire. Cette approche peut être généralisée afin d'identifier et de lier mécanistiquement les gènes, incluant ceux n'ayant aucune fonction connue, à tout processus cellulaire, comme les mécanismes régulant l'ARNm.

Assemblage moléculaire régi par la formation de bifluorènes : vers la formation de réseaux organiques covalents retenus par des liaisons carbone-carbone

Les réseaux organiques covalents (COFs) sont des réseaux bidimensionnels et tridimensionnels assemblés seulement par des atomes légers, c’est-à-dire de la première et deuxième rangée du tableau périodique. Ceux-ci ont montré des propriétés de porosité pouvant être exploitées dans le stockage, dans la catalyse et dans la séparation moléculaire. La plupart de ces matériaux ont été obtenus par une réaction finale de condensation, ce qui nuit à leurs cristallisations, donc à l’homogénéité et à la caractérisation détaillée de ces matériaux. Les p-xylylènes de Thiele et Tschitschibabin sont des molécules qui ont suscité l’intérêt pour leurs structures et leurs propriétés magnétiques. Subséquemment, Wittig a démontré que le remplacement des fragments diphénylméthylène par des fragments fluorénylidène sur le p-xylylène de Thiele donne des molécules pouvant s’oligomériser pour former un tétramère. Dans notre étude, nous avons examiné l’assemblage de dérivés fluorénylidène dans le but d’obtenir un COF. Tout d’abord, un dérivé linéaire similaire à ce que Wittig a obtenu a été synthétisé afin de vérifier l’assemblage à partir d’un cœur spirobifluorényle. Ces molécules se sont assemblées en tétramère, comme prévu, et en hexamère. Ces deux résultats ont pu être rationalisés par une étude à l’état solide par diffraction des rayons-X. L’empilement tridimensionnel a également été étudié pour ces deux molécules. Subséquemment, des dérivés tétraédriques ont été synthétisés afin d’étudier leurs assemblages. Un premier dérivé est resté sous sa forme quinoïdale et ne s’est pas assemblé, alors qu’un second dérivé a mené à un dimère partiellement assemblé. La structure de ce dernier suggère la formation d’un polymère linéaire pour ce composé dans le cas où il aurait été possible de l’assembler complètement.

Caractérisation des structures de septines hautement organisées chez la drosophile et leur interaction avec le cytosquelette d’actine

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives.

Caractérisation des structures de septines hautement organisées chez la drosophile et leur interaction avec le cytosquelette d’actine

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives.