Recommandations suisses pour le traitement de l'herpès génital et de l'herpès du nouveau-né [Swiss recommendations for the management of gential herpers and herpes simplex virus infection of the neonate]

Genital herpes is being recognised as a medical problem of increasing importance. Diagnosis and management are complex. The present recommendations have been established by a multidisciplinary panel of specialists and endorsed by all Swiss medical societies involved in the medical care of such patients. The aim is to improve the care of affected patients, to reduce horizontal and vertical transmission and to diminish the psychosocial burden.

Étude de la sortie du virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) hors du noyau

Le virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorité de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptômes délétères dont les plus communs sont les lésions orofaciales usuellement appelées feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus sérieux comme la cécité ou des troubles neurologiques. Le virus réside de façon permanente dans le corps de son hôte. Malgré l’existence de nombreux traitements pour atténuer les symptômes causés par HSV 1, aucun médicament ne peut éliminer le virus. Dans le but d’améliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible l’étude du transport du virus dans la cellule hôte. Ce projet aura permis la collecte d’informations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires où il séjourne. Les différentes expérimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a été choisi parmi les meilleurs papiers par les éditeurs de « Journal of Virology » ainsi qu’un 4e article qui a été soumis. Premièrement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a été mis sur pied, via l’isolation de noyaux issus de cellules infectées. Nous avons démontré que tout comme dans les cellules entières, les capsides s’évadent des noyaux isolés dans l’essai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nucléaire interne, puis en s’accumulant sous forme de capsides enveloppées entre les deux membranes nucléaires pour finalement être relâchées dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppée. Ces observations appuient le modèle de transport de dé-enveloppement/ré-enveloppement. Deuxièmement, dans le but d’identifier des joueurs clefs viraux impliqués dans la sortie nucléaire du virus, les protéines virales associées aux capsides relâchées par le noyau ont été examinées. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un génome d’ADN, une capside, le tégument et une enveloppe. Le tégument est un ensemble de protéines virales qui sont ajoutées séquentiellement sur la particule virale. La séquence d’ajout des téguments de même que les sites intracellulaires où a lieu la tégumentation sont l’objet d’intenses recherches. L’essai in vitro a été utilisé pour étudier cette tégumentation. Les données recueillies suggèrent un processus séquentiel qui implique l’acquisition des protéines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relâchées par le noyau. Troisièmement, pour obtenir davantage d’informations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hôte, la sortie de HSV 1 du réseau trans golgien (TGN) a aussi été étudiée. L’étude a révélé l’implication de la protéine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour réguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumière l’utilisation d’une machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN n’est donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour différentes voies de transport intracellulaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les données amassées concernant le virus HSV 1 pourraient aussi être appliquées à d’autres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les découvertes issues de ce projet apportent également de nouveaux détails au niveau du transport intracellulaire.

Études des mécanismes d’induction de l’immunosuppression par le virus Herpès Humain 6

HHV-6 is a ubiquitous human herpesvirus. Most individuals become infected at the age of 2 years. Primary infection by the virus causes a self-limiting febrile illness called exanthem subitum or roseola. In adults, primary infection may cause mononucleosis-like illnesses. The infection usually remains latent in healthy individuals, but often reactivates in immunocompromised individuals, for example, transplant patients and AIDS patients. The virus has also been associated with cancers and lymphoproliferative disorders. The virus encodes two proteins that interact with p53. However, little is known concerning the impact of the virus on cell cycle progression in human cells. The investigations reported in the thesis were focused on this issue. We show here that that HHV-6 infection delays the cell cycle progression in human T cell line HSB-2, as well as in primary human T cells and causes their accumulation in S and G2/M phase. By degrading the viral DNA in the virus-infected cells, we show that the infected cells accumulate in the G2/M and not in the S phase. We observed an increase in the kinase activity of cdc2 in virus-infected cells despite lower levels of its catalytic partners, cyclin A and cyclin B. We show here that the viral early antigen p41 associates with, and increases the kinase activity of, CDK1. Our studies have shown that there is a drastic reduction of p21 protein, despite the virus-induced stabilization and activation of p53 suggesting that p53 may be transcriptionally inactivated in the virus-infected cells. This decrease of p21 in infected cells was partially restored by proteasome inhibitors. These results suggest that HHV-6 causes perturbations in the normal progression of cell cycle in human T cells. Autophagy is a physiological cell process during which old cellular constituents and long-lived proteins in cells are degraded. This process is regulated in a cell cycle-dependent manner. We show here that infection with HHV-6 induces autophagy in HSB-2 cells. This was shown by the induction of LC-3 II as well as by the appearance of autophagic vacuoles in the virus-infected cells. However, we found that the virus inhibits fusion between autophagic vacuoles and lysosomes formed in infected cells, thus evading the autophagic response of infected host cells. Finally we tried to investigate replication of the virus in human cells in the absence of P53; a tumor suppressor gene which is also known as "the guardian of the genome ". During these investigations, we found that that inhibition of p53 gene expression mediated by siRNA as well as its inhibition by pharmacological inhibitors leads to massive cell death in human T cell line HSB-2 that carries a wild-type p53. We show that this death also occurs in another cell line CEM, which carries a transcriptionally mutated p53. Interestingly, the cell death could be prevented by pharmacological inhibitors of autophagy and necroptosis. Taken together, our results provide important novel insights concerning the impact of HHV-6 on cell cycle regulation and autophagy as well as of basal level p53 in cell survival.

Caractérisation de la migration du virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) par protéomique

Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1), agent étiologique des feux sauvages, possède une structure multicouche comprenant une capside icosaédrale qui protège le génome viral d’ADN, une couche protéique très structurée appelée tégument et une enveloppe lipidique dérivant de la cellule hôte et parsemée de glycoprotéines virales. Tous ces constituants sont acquis séquentiellement à partir du noyau, du cytoplasme et du réseau trans-golgien. Cette structure multicouche confère à HSV-1 un potentiel considérable pour incorporer des protéines virales et cellulaires. Toutefois, l’ensemble des protéines qui composent ce virus n’a pas encore été élucidé. De plus, malgré son rôle critique à différentes étapes de l’infection, le tégument demeure encore mal défini et ce, tant dans sa composition que dans la séquence d’addition des protéines qui le composent. Toutes ces incertitudes quant aux mécanismes impliqués dans la morphogenèse du virus nous amènent à l’objectif de ce projet, soit la caractérisation du processus de maturation d’HSV-1. Le premier article présenté dans cette thèse et publié dans Journal of Virology s’attarde à la caractérisation protéique des virus extracellulaires matures. Grâce à l’élaboration d’un protocole d’isolation et de purification de ces virions, une étude protéomique a pu être effectuée. Celle-ci nous a permis de réaliser une cartographie de la composition globale en protéines virales des virus matures (8 protéines de la capside, 23 protéines du tégument et 13 glycoprotéines) qui a fait la page couverture de Journal of Virology. De plus, l’incorporation potentielle de 49 protéines cellulaires différentes a été révélée. Lors de cette étude protéomique, nous avons aussi relevé la présence de nouveaux composants du virion dont UL7, UL23, ICP0 et ICP4. Le deuxième article publié dans Journal of General Virology focalise sur ces protéines via une analyse biochimique afin de mieux comprendre les interactions et la dynamique du tégument. Ces résultats nous révèlent que, contrairement aux protéines ICP0 et ICP4, UL7 et UL23 peuvent être relâchées de la capside en présence de sels et que les cystéines libres jouent un rôle dans cette relâche. De plus, cet article met en évidence la présence d’ICP0 et d’ICP4 sur les capsides nucléaires suggérant une acquisition possible du tégument au noyau. La complexité du processus de morphogenèse du virus ainsi que la mise en évidence d’acquisition de protéines du tégument au noyau nous ont incités à poursuivre nos recherches sur la composition du virus à un stade précoce de son cycle viral. Les capsides C matures, prémisses des virus extracellulaires, ont donc été isolées et purifiées grâce à un protocole innovateur basé sur le tri par cytométrie en flux. L’analyse préliminaire de ces capsides par protéomique a permis d’identifier 28 protéines virales et 39 protéines cellulaires. Les données recueilles, comparées à celles obtenues avec les virus extracellulaires, suggèrent clairement un processus séquentiel d’acquisition des protéines du tégument débutant dans le noyau, site d’assemblage des capsides. Finalement, tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation d’HSV-1 via l’utilisation de techniques variées et innovatrices, telles que la protéomique et la cytométrie en flux, pouvant être appliquées à d’autres virus mais aussi permettre le développement de meilleurs traitements pour vaincre l’HSV-1.

Predation of herps by spiders (Araneae) in the Brazilian Cerrado.

Two events of predation of herps by spiders in the Brazilian Cerrado are reported here. A lizard Micrablepharus atticolus (Sauria: Gymnophthalmidae) was found being preyed upon by Lycosa erythrognatha (Araneae: Lycosidae) and a frog Physalaemus cuvieri (Anura: Leiuperidae) was seen being preyed upon by Ancylometes sp. (Araneae: Ctenidae).

Étude des fonctions anti-apoptotique et de chaperon moléculaire de la sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase du virus de l'herpès simplex de type-2

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude des fonctions anti-apoptotique et de chaperon moléculaire de la sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase du virus de l'herpès simplex de type-2

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Implicações imunobiológicas da infecção a herpesvirus em tumores malignos : pesquisa e análise quantitativa de herpesvirus humanos no astrocitoma pilocítico

RESUMO: As infecções virais podem contribuir para o desenvolvimento do cancro, estando vários tumores malignos associados aos Herpesvirus (HHV). O vírus de Epstein-Barr (EBV) e o Herpesvirus 8, dois Herpesvirus, foram reconhecidos como agentes etiológicos de várias neoplasias. O astrocitoma pilocítico do cerebelo é um dos tumores cerebrais mais frequentes na criança, adolescentes e jovens adultos e a proliferação astrocitária ocorre geralmente após vários tipos de agressão, nomeadamente a infecção viral. Para investigar esta eventual interligação, estudámos 35 astrocitomas pilocíticos, pesquisando a presença dos 8 Herpesvirus. Neste estudo, foram utilizadas 10 amostras de biópsias do cerebelo de doentes que faleceram por doenças não relacionadas com infecção ou patologia tumoral. A maioria dos astrocitomas (33) eram tumores de baixa malignidade. As amostras foram analisadas por PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitativa em tempo real (qPCR), com amplificação do gene da DNA polimerase viral. Treze astrocitomas e 7 controles revelaram pequenas quantidades de DNA viral (1-100 cópias/100ng DNA) de todos os Herpesvirus, com excepção do HHV6 A e B que estava ausente nas amostras. O EBV foi identificado em 9 dos 35 astrocitomas (26%) e em 7 dos 10 controles (70%) estando muito mais presente nos controles. As amostras positivas para o EBV foram também analisadas por imunohistoquímica, não tendo sido imunoreactivas para os anticorpos utilizados. A PCR com CODEHOP (consensus-degenerated hybrid oligonucleotide primers) foi utilizada para investigar a presença de um eventual Herpesvirus novo nestas amostras. Não foi identificada nenhuma sequência indicativa de um novo HHV por este método. 24. Em conclusão, os dados apontam para a presença de Herpesvirus, com particular relevância para o EBV, em tecido de cerebelo normal e em tumores cerebrais, embora em níveis demasiado baixos para poderem ser responsabilizados pela indução tumoral. A presença de sequências de DNA de Herpesvirus, nomeadamente do EBV, no Sistema Nervoso Central vem enriquecer a discussão sobre o significado da infecção viral na oncogénese humana, particularmente na neuro-oncogénese. ABSTRACT: Viral infections can contribute to the development of human cancer. Several human malignancies are linked with Human Herpesviruses (HHVs). Epstein-Barr virus and HHV8, two hHerpesvirus, have been recognized as etiologic agents of several neoplasms. Pilocytic astrocytoma of the cerebellum is one of the most common brain tumour in children, adolescents and young adults and astrocytary proliferation generally occurs after several types of injury, namely viral infection. To further explore this association, we have searched the tissue from 35 pilocytic astrocytoma, for all the 8 HHV. In this study, ten brain biopsies (cerebellum) from patients who died of unrelated diseases were used as controls. Most of the astrocytomas (33) were of low grade malignity. Samples were assessed by Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (q PCR) amplification of viral DNA polymerase gene. Thirteen astrocytoma and 7 controls showed low viral DNA levels (1-100 copies/100ng DNA) for all HHVs, with the exception of HHV6 that was absent. EBV was identified in 9 of the 35 astrocytoma (26 %) and in 7 of the 10 controls (70%) being more present in controls. EBV positive samples were also assessed by Immunohistochemistry (IHC) but none showed immunoreactivity for the antibodies used. PCR with consensus-degenerated hybrid oligonucleotide primers (CODEHOP) were also used to look for novel HHVs in these samples and no sequence indicative of a new HHV was detected. 26 Altogether the data indicate the presence of HHVs, with relevance for EBV in normal cerebellum tissue and also in brain tumours but at too low levels to be considered responsible for tumour induction. The presence of HHV DNA sequences, particularly EBV, in the studied brain tumours and control samples, further enriches the discussion about the relevance of viral infection in human oncogenesis, particularly neuro-oncogenesis.RÉSUMÉ: Les infections virales peuvent contribuer au développement du cancer. Les vírus de type Herpès sont associés à plusieurs néoplasies. Il est par exemple établi que les vírus Epstein-Barr et « human Herpesvirus 8 » (HHV-8) sont responsables de plusieurs tumeurs malignes. L´astrocytome pilocitique du cervelet est l’une des tumeurs les plus fréquentes chez les enfants, adolescents et adultes jeunes. En général la prolifération des astrocytes se produit en réponse à une agression. Posant l’hypothèse d’une agression d’origine virale, nous avons recherché la présence des 8 vírus Herpès dans les tissus de 35 astrocytomes. Dans cette étude, 10 échantillons de biopsie de cervelet de patients décédés suite à d’autres pathologies, ont été utilisés comme contrôles. La majorité des astrocytomes étaient de très basse malignité. Les échantillons ont été étudiés par PCR quantitative en temps réel, en amplifiant le gène de l’ADN-polymérase virale. Treize astrocytomes sur 35 (37%) et 7 contrôles sur 10 (70%) ont été trouvés positifs pour tous les HHV sauf l´HHV6, toujours avec un nombre de copies de polymérase virale bas (< 100 copies/100 ng d’ADN). Notamment l’EBV a été identifié 7 fois dans les contrôles (70%) et 9 fois dans les astrocytomes (26%). Les échantillons positifs pour l`EBV ont aussi été étudiés par immuno-histochimie. Aucun signal n’a été observé avec les anticorps utilisés. Enfin, une technique de PCR avec oligonucléotides dégénérés (CODEHOP ou consensus degenerated hybrid oligonucleotide primers) a été utilisée pour rechercher la présence d´un éventuel nouveau vírus Herpès dans les échantillons d’astrocytome. Aucun nouveau vírus n’a été identifié. 28 En résumé, nous avons établi la présence de vírus Herpès, en particulier l´EBV, dans le cervelet normal et dans les tumeurs du cerveau. Les quantités d’ADN viral retrouvées sont faibles et ne permettent pas d’attribuer à ces vírus la responsabilité de l’induction des tumeurs. Cependant, la présence d’ADN de vírus Herpès dans le cerveau sain ou pathologique vient enrichir la discussion sur le signification de l´infection virale dans les processus d´oncogenèse en général, et dans la neuroonco-genèse en particulier.

Development of novel immunotherapies against bladder cancer

Le cancer de la vessie est le deuxième cancer urologique le plus fréquent dans le monde. La plupart des patients (75%) sont initialement diagnostiqués avec un cancer non musculo- invasif. Après résection trans-urétrale, ie traitement standard pour ce type de lésion chez les patients présentant un risque important de récidive/progression consiste en une série d'instillations intravésicales du Bacille de Calmette-Guerin (i.e. le vaccin BCG). Cependant cette "BCG thérapie" est associée à des effets secondaires non négligeables et s'avère inefficace dans 30% des cas, des limitations donc importantes qui soulignent la nécessité de développer des stratégies thérapeutiques alternatives. L'utilisation d'antigènes associés aux tumeurs (TAA) comme vaccin, combinée à une application locale d'immunostimulants sur le site tumoral, est une approche prometteuse en vue de maximiser les réponses immunitaires anti-tumorales localement. Nous montrons que la bactérie vivante atténuée Ty21a, issue du vaccin Vivotif® contre la fièvre typhoïde, peut être utilisée comme immunostimulant intravésical (IVES), mais ce uniquement dans le cas où la bactérie est en phase exponentielle de croissance (Vivotif exp). En effet, l'instillation IVES de Vivotif exp à la suite d'une vaccination par un TAA, un antigène mineur d'histocompatibilité mâle H-Y (Uty), permet d'augmenter de 15 fois le nombre de cellules T CD8 totales et spécifiques de l'antigène dans la vessie. Le recrutement des cellules T est TLR4-dépendent, ce qui suggère un rôle des lipopolysaccharides du Vivotif exp. Par ailleurs, en comparaison avec le contenu bactérien de la capsule de Vivotif, les bactéries en phase exponentielle de croissance permettent également une augmentation préférentielle des chemokines C5/C5a, CXCL1, CXCL2 et CXCL5 dans la vessie, mais pas du nombre de cellules T exprimant les récepteurs apparentés (C5aR et CXCR2). De plus, combiner la vaccination Uty avec le Vivotif exp en IVES permet d'améliorer la survie des souris présentant une tumeur orthotopique de la vessie exprimant l'antigène Uty (lignée tumorale murine MB49). Puisque pour certains cancers, aucun TAA - du moins exprimé à tous les stades tumoraux - n'est identifié, il est nécessaire de développer d'autres approches non vaccinales. Dans une deuxième partie de ce travail de thèse, nous avons donc investigué deux stratégies permettant d'induire une destruction des cellules tumorales, la thérapie génique par gène de suicide, d'une part, et la thérapie photodynamique dans le proche infrarouge (NIR-PDT), d'autre part. Pour appliquer ces thérapies, nous avons utilisé comme vecteur sûr et non toxique une forme non réplicative du virus du « Human Papillomavirus » (HPV) capable de "pseudo-infecter" préférentiellement les souris présentant des tumeurs vésicales (MB49). L'utilisation de pseudovirions (PsV) HPV portant comme gène suicide la thymidine kinase, une enzyme du virus de l'herpès simplex, suivi d'un traitement par la prodrogue Ganciclovir, permet de tuer 90% des cellules MB49 in-vitro ainsi que de ralentir significativement le développement des tumeurs vésicales in-vivo. Par ailleurs, l'emploi de particules pseudo- virales HPV couplées à la phtalocyanine IR700, un pigment photosensible présentant un pouvoir cytotoxique une fois activé, permet de tuer, après application d'une lumière dans le proche infrarouge, quasi 100% des cellules MB49 in-vitro et, plus important, de régresser des tumeurs in-vivo. De façon générale, ce travail de thèse présente des approches thérapeutiques innovantes et prometteuses pour le traitement des patients avec un cancer non musculo-invasif de la vessie. -- Bladder cancer is the second most common urological malignancy in the world. At initial diagnosis, non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) accounts for 75% of bladder cancer. The standard of care of NMIBC consists of intravesical (IVES) treatments with Bacillus- Calmette-Guerin (BCG) following transurethral resections of the lesions. However, repeated BCG treatments are associated with significant side effects and treatment failure may occur in 30% of the cases, underlying the necessity of alternative therapeutic strategies. The use of tumor-associated antigens (TAA) as vaccines followed by the local application of immunostimulants where the tumor resides is a promising approach to increase anti-tumor immune responses locally. We show that live attenuated Ty21a bacteria used from the vivotif® vaccine against typhoid fever can efficiently be used as IVES immunostimulant, only if bacteria are grown to exponential phase (Vivotif exp). In this condition, IVES immunostimulation after TAA vaccination with a minor histocompatibility male antigen HY (Uty) resulted in more than 15-fold increase of both vaccine-specific and total CD8-T cells in the bladder. T cell recruitment was mediated by TLR-4 suggesting that it was mainly mediated by lipopolysaccharides of Vivotif exp. In addition, these bacteria, as compared to the bacterial content of the vivotif capsule preferentially increased C5/C5a, CXCL1, CXCL2 and CXCL5 chemokines, but not the numbers of T cells expressing the cognate receptors (C5aR and CXCR2). Combination of IVES Vivotif exp with Uty vaccination improved survival of mice with pre-established orthotopic Uty-expressing MB49 murine bladder tumors, as compared to vaccination alone. As known TAA are not identified in all cancers, or not expressed in all stages of the tumor, we further investigated two potent approaches able of initiating tumor-cell destruction, suicide-gene therapy and near-infrared (NIR) photodynamic therapy (PDT). Towards a safe and non-toxic application of these therapies, we used Human Papillomavirus (HPV) replication-defective vectors that were able to preferentially pseudo-infect MB49-tumor bearing mice. HPV pseudovirions (PsV) carrying the Herpex-Simplex virus thymidine kinase suicide-gene followed by treatment with the prodrug Ganciclovir resulted in 90% of MB49 cell-death in-vitro and was able to significantly reduce bladder tumor growth in-vivo. Furthermore, HPV virus-like particles coupled to a NIR phtalocyanine dye, IR700 in combination with specific NIR light led to almost 100% of MB49 cell-death in-vitro and more interestingly, to bladder tumors shrinkage in-vivo. Overall, in this thesis, we offer promising therapeutic approaches for application in NMIBC patients.

Élaboration d’un anticorps chimère anti-gp350 comme traitement prophylactique éventuel des syndromes lymphoprolifératifs B chez les greffés

Le virus Epstein-Barr (VEB) est fortement associé au développement de syndromes lymphoprolifératifs (SLP) en greffe pédiatrique. Ce virus a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer leur prolifération incontrôlée chez l’hôte immunodéprimé. Plusieurs études démontrent que le cycle lytique du virus jouerait un rôle primordial dans la genèse des SLP en produisant des particules virales pouvant infecter les cellules B adjacentes. Chez un individu immunodéprimé, ces cellules B nouvellement infectées peuvent donner naissance à une expansion lymphocytaire. Le projet présenté dans ce mémoire fait partie d’un programme de recherche visant à élucider le rôle de l’infection productive par le VEB dans le développement des SLP. L’objectif précis de ce projet est de développer un anticorps monoclonal chimère contre la glycoprotéine gp350 du VEB dans le but de neutraliser le virus et d’ainsi prévenir son entrée dans les cellules B. Notre laboratoire a construit une version chimère de l’anticorps monoclonal murin 72A1, lequel se lie à la gp350 et bloque l’infection. Les premiers essais ont révélé la présence de chaînes non fonctionnelles (aberrantes) dans l’hybridome produisant l’anticorps 72A1. La construction de la chaîne légère authentique est maintenant complète alors que celle de la chaîne lourde est toujours en cours. Le processus de caractérisation de l’anticorps chimère inclura des essais de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Dans cette optique, une lignée cellulaire exprimant de façon stable la gp350 a été établie. Notre anticorps chimère anti-gp350 pourrait éventuellement être utilisé comme thérapie préventive chez les greffés présentant un risque élevé de SLP en empêchant l’infection des cellules B adjacentes.

La protéine majeure de la capside de l’HSV-1 est ubiquitinée

Le virus de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1) est le pathogène humain responsable des lésions herpétiques labiales, plus communément appelé « feux sauvages ». Annuellement, il est responsable de plusieurs cas d’encéphalites et d’infections de l’appareil visuel qui sont la principale cause de cécité en Amérique du Nord. Bien qu’il existe quelques traitements antiviraux, aucun vaccin ou médicament ne permet de prévenir ou de guérir les infections causées par ce virus. Aujourd’hui, les infections produites par l’HSV-1 sont présentes partout sur la planète. Récemment, une étude en protéomique effectuée sur les virus matures extracellulaires a permis d’identifier la présence d’ubiquitines libres et d’enzymes reliées à la machinerie d’ubiquitination dans le virus. De plus, le virus exploite cette machinerie au cours de l’infection. Il est connu que certaines protéines virales sont ubiquitinées durant une infection et que le virus imite même certaines enzymes d’ubiquitination. Nous avons donc entrepris des recherches afin d’identifier des protéines virales ubiquitinées qui pourraient être présentes dans les virus matures ainsi que leurs rôles potentiels. La protéine majeure de la capside, VP5, un constituant très important du virus, a été identifiée. Nos recherches nous ont permis de caractériser le type d’ubiquitination, une monoubiquitination sur les lysines K810 et/ou K1275 de VP5. Le rôle que pourrait jouer l’ubiquitination de VP5 dans le cycle de réplication virale et dans les virus matures n’est toutefois pas encore connu.

Étude des voies d’apprêtement des antigènes viraux menant à la présentation antigénique par les CMH de classe I

Le contrôle immunitaire des infections virales est effectué, en grande partie, par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Pour y parvenir, les lymphocytes T CD8+ doivent être en mesure de reconnaître les cellules infectées et de les éliminer. Cette reconnaissance des cellules infectées s’effectue par l’interaction du récepteur T (TCR) des lymphocytes T CD8+ et des peptides viraux associés au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules hôtes. Cette interaction constitue l’élément déclencheur permettant l’élimination de la cellule infectée. On comprend donc toute l’importance des mécanismes cellulaires menant à la génération des peptides antigéniques à partir des protéines virales produites au cours d’une infection. La vision traditionnelle de cet apprêtement protéique menant à la présentation d’antigènes par les molécules du CMH propose deux voies cataboliques distinctes. En effet, il est largement admis que les antigènes endogènes sont apprêtés par la voie dite ‘‘classique’’ de présentation antigénique par les CMH de classe I. Cette voie implique la dégradation des antigènes intracellulaires par le protéasome dans le cytoplasme, le transport des peptides résultant de cette dégradation à l’intérieur du réticulum endoplasmique, leur chargement sur les molécules du CMH de classe I et finalement le transport des complexes peptide-CMH à la surface de la cellule où ils pourront activer les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde voie impliquant des antigènes exogènes, le dogme veut que ceux-ci soient apprêtés par les protéases du compartiment endovacuolaire. Les peptides ainsi générés sont directement chargés sur les molécules de CMH de classe II à l’intérieur de ce compartiment. Par la suite, des mécanismes de recyclage vésiculaire assurent le transport des complexes peptide-CMH de classe II à la surface de la cellule afin de stimuler les lymphocytes T CD4+. Cependant, cette stricte ségrégation des voies d’apprêtement antigénique a été durement éprouvée par la capacité des cellules présentatrices d’antigènes à effectuer l’apprêtement d’antigènes exogènes et permettre leur présentation sur des molécules de CMH de classe I. De plus, l’identification récente de peptides d’origine intracellulaire associés à des molécules de CMH de classe II a clairement indiqué la présence d’interactions entre les deux voies d’apprêtement antigénique permettant de transgresser le dogme préalablement établi. L’objectif du travail présenté ici était de caractériser les voies d’apprêtement antigénique menant à la présentation d’antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I lors d’une infection par le virus de l’Herpès simplex de type I (HSV-1). Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons une nouvelle voie d’apprêtement antigénique résultant de la formation d’autophagosomes dans les cellules infectées. Cette nouvelle voie permet le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire dégradatif dans la phase tardive de l’infection par le virus HSV-1. Cette mise en branle d’une seconde voie d’apprêtement antigénique permet d’augmenter le niveau de présentation de la glycoprotéine B (gB) virale utilisée comme modèle dans cette étude. De plus, nos résultats décrivent la formation d’une nouvelle forme d’autophagosomes dérivés de l’enveloppe nucléaire en réponse à l’infection par le virus HSV-1. Ces nouveaux autophagosomes permettent le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire lytique, action également assurée par les autophagosomes dits classiques. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous utilisons l’infection par le virus HSV-1 et la production de la gB qui en résulte pour étudier le trafic membranaire permettant le transfert de la gB vers un compartiment vacuolaire dégradatif. Nos résultats mettent en valeur l’importance du réticulum endoplasmique, et des compartiments autophagiques qui en dérivent, dans ces mécanismes de transfert antigénique permettant d’amplifier la présentation antigénique de la protéine virale gB sur des CMH de classe I via une voie vacuolaire. L’ensemble de nos résultats démontrent également une étroite collaboration entre la voie classique de présentation antigénique par les CMH de classe I et la voie vacuolaire soulignant, encore une fois, la présence d’interaction entre les deux voies.

Contribution de la Glycoprotéine M dans la Sortie de HSV-1

Le Virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) est un agent infectieux qui cause l’herpès chez une grande proportion de la population mondiale. L’herpès est généralement considéré comme une maladie bénigne dont la forme la plus commune est l'herpès labial (communément appelé « bouton de fièvre »), mais elle peut se révéler très sérieuse et causer la cécité et l’encéphalite, voir létale dans certain cas. Le virus persiste toute la vie dans le corps de son hôte. Jusqu'à présent, aucun traitement ne peut éliminer le virus et aucun vaccin n’a été prouvé efficace pour contrôler l’infection herpétique. HSV-1 est un virus avec un génome d’ADN bicaténaire contenu dans une capside icosaèdrale entourée d’une enveloppe lipidique. Treize glycoprotéines virales se trouvent dans cette enveloppe et sont connues ou supposées jouer des rôles distincts dans différentes étapes du cycle de réplication viral, incluant l'attachement, l'entrée, l’assemblage, et la propagation des virus. La glycoprotéine M (gM) qui figure parmi ces glycoprotéines d’enveloppe, est la seule glycoprotéine non essentielle mais est conservée dans toute la famille herpesviridae. Récemment, l’homologue de gM dans le Pseudorabies virus (PRV), un autre herpesvirus, a été impliqué dans la phase finale de l’assemblage (i.e. l’enveloppement cytoplasmique) au niveau du réseau trans-Golgi (TGN) en reconnaissant spécifiquement des protéines tégumentaires et d’autres glycoprotéines d’enveloppe ([1]). Toutefois, il a été proposé que cette hypothèse ne s’applique pas pour le HSV-1 ([2]). De plus, contrairement à la localisation au TGN dans les cellules transfectées, HSV-1 gM se localise dans la membrane nucléaire et sur les virions périnucléaires durant une infection. L’objectif du projet présenté ici était d’éclaircir la relation de la localisation et la fonction de HSV-1 gM dans le contexte d’une infection. Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons tout abord un mécanisme spécifique de ciblage nucléaire de HSV-1 gM. En phase précoce d’une infection, gM est ciblée à la membrane nucléaire d'une manière virus ii dépendante. Cela se produit avant la réorganisation du TGN normalement induite par l’infection et avant que gM n’entre dans la voie de sécrétion. Ce ciblage nucléaire actif et spécifique de gM ne semble pas dépendre des plusieurs des partenaires d’interaction proposés dans la littérature. Ces données suggèrent que la forme nucléaire de gM pourrait avoir un nouveau rôle indépendant de l’enveloppement final dans le cytoplasme. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons concentré nos efforts sur le rôle de gM dans l’assemblage du virus en phase tardive de l’infection et en identifiant un domaine critique de gM. Nos résultats mettent en valeur l’importance du domaine carboxyl-terminal cytoplasmique de gM dans le transport de gM du réticulum endoplasmique (RE) à l’appareil de Golgi, dans l’enveloppement cytoplasmique et la propagation intercellulaire du virus. Ainsi, l’export du RE de gM a été complètement compromis dans les cellules transfectées exprimant un mutant de gM dépourvu de sa région C-terminale. La délétion la queue cytoplasmique de gM cause une réduction légère du titre viral et de la taille des plaques. L'analyse de ces mutants par microscopie électronique a démontré une accumulation des nucléocapsides sans enveloppe dans le cytoplasme par rapport aux virus de type sauvage. Étrangement, ce phénotype était apparent dans les cellules BHK mais absent dans les cellules 143B, suggérant que la fonction de gM dépende du type cellulaire. Finalement, le criblage de partenaires d’interaction du domaine C-terminal de gM identifiés par le système de double-hybride nous a permis de proposer plusieurs candidats susceptibles de réguler la fonction de gM dans la morphogénèse et la propagation de virus.