Identification et caractérisation d'un domaine de transactivation dans l’hélicase E1 des papillomavirus humains

Les papillomavirus sont des virus à ADN qui infectent la peau et les muqueuses. Ils causent des verrues et peuvent aussi mener au développement de cancers, dont le cancer du col de l’utérus. La réplication de leur génome nécessite deux protéines virales : l’hélicase E1 et le facteur de transcription E2, qui recrute E1 à l’origine de réplication virale. Pour faciliter l’étude de la réplication du génome viral, un essai quantitatif et à haut débit basé sur l’expression de la luciférase a été développé. Parallèlement, un domaine de transactivation a été identifié dans la région régulatrice N-terminale de la protéine E1. La caractérisation de ce domaine a montré que son intégrité est importante pour la réplication de l’ADN. Cette étude suggère que le domaine de transactivation de E1 est une région protéique intrinsèquement désordonnée qui permet la régulation de la réplication du génome viral par son interaction avec diverses protéines.

Identification du rôle et des modifications post-traductionnelles modulant l’export nucléaire de l’hélicase virale E1 au cours du cycle de réplication du virus du papillome humain

Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau.

Caractérisation de la fonction de la protéine cellulaire p80/UAF1 dans la réplication du génome du virus du papillome humain

Le virus du papillome humain (VPH) est l’agent étiologique du cancer du col utérin, ainsi que d’autre néoplasies anogénitales et des voies aérodigestives supérieures. La réplication de son génome d’ADN double brin est assurée par les protéines virales E1 et E2, de concert avec la machinerie cellulaire de réplication. E1 assure le déroulement de l’ADN en aval de la fourche de réplication, grâce à son activité hélicase, et orchestre la duplication du génome viral. Nos travaux antérieurs ont démontré que le domaine N-terminal de E1 contient un motif de liaison à la protéine cellulaire p80/UAF1 qui est hautement conservé chez tous les VPH anogénitaux. L’intégrité de ce motif est essentielle au maintien de l’épisome viral. Les travaux présentés dans cette thèse ont d’abord déterminé que le motif de liaison à UAF1 n’est pas requis pour l’assemblage du pré-réplisome viral, mais important pour la réplication subséquente de l’ADN du VPH. Nous avons constaté qu’en présence de E1 et E2, UAF1 est relocalisé dans des foyers nucléaires typiques de sites de réplication du virus et qu’en outre, UAF1 s’associe physiquement à l’origine de réplication du VPH. Nous avons aussi déterminé que l’inhibition du recrutement de UAF1 par la surexpression d’un peptide dérivé de E1 (N40) contenant le motif de liaison à UAF1 réduit la réplication de l’ADN viral. Cette observation soutient le modèle selon lequel UAF1 est relocalisé par E1 au réplisome pour promouvoir la réplication de l’ADN viral. UAF1 est une protéine à domaine WD40 n’encodant aucune activité enzymatique et présumée exploiter des interactions protéine-protéine pour accomplir sa fonction. Nous avons donc investigué les protéines associées à UAF1 dans des cellules du col utérin et avons détecté des interactions avec les enzymes de déubiquitination USP1, USP12 et USP46, ainsi qu’avec la phosphatase PHLPP1. Nous avons établi que E1 forme un complexe ternaire avec UAF1 et n’importe laquelle des USP associés : USP1, USP12 ou USP46. Ces USP sont relocalisés au noyau par E1 et s’associent à l’ADN viral. De plus, l’activité enzymatique des USP est essentielle à la réplication optimale du génome viral. Au contraire, PHLPP1 ne forme pas de complexe avec E1, puisque leurs interactions respectives avec UAF1 sont mutuellement exclusives. PHLPP1 contient un peptide de liaison à UAF1 homologue à celui de E1. Ce peptide dérivé de PHLPP1 (P1) interagit avec le complexe UAF1-USP et, similairement au peptide N40, antagonise l’interaction E1-UAF1. Incidemment, la surexpression du peptide P1 inhibe la réplication de l’ADN viral. La génération de protéines chimériques entre P1 et des variants de E1 (E1Δ) défectifs pour l’interaction avec UAF1 restaure la capacité de E1Δ à interagir avec UAF1 et USP46, ainsi qu’à relocaliser UAF1 dans les foyers nucléaires contenant E1 et E2. Ce recrutement artificiel de UAF1 et des USP promeut la réplication de l’ADN viral, un phénotype dépendant de l’activité déubiquitinase du complexe. Globalement, nos travaux suggèrent que la protéine E1 du VPH interagit avec UAF1 afin de recruter au réplisome un complexe de déubiquitination dont l’activité est importante pour la réplication de l’ADN viral.

Identification des partenaires protéiques de l'hélicase virale E1 du virus du papillome humain : caractérisation d'une nouvelle interaction avec la protéine à domaines WD p80

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Identification des partenaires protéiques de l'hélicase virale E1 du virus du papillome humain : caractérisation d'une nouvelle interaction avec la protéine à domaines WD p80

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A spoofing detection method for civilian L1 GPS and the E1-B Galileo Safety of Life service

This paper describes an effective method for signal-authentication and spoofing detection for civilian GNSS receivers using the GPS L1 C/A and the Galileo E1-B Safety of Life service. The paper discusses various spoofing attack profiles and how the proposed method is able to detect these attacks. This method is relatively low-cost and can be suitable for numerous mass-market applications. This paper is the subject of a pending patent.

The heparan sulfate proteoglycan (HSPG) glypican-3 mediates commitment of MC3T3-E1 cells toward osteogenesis

Heparan sulfate (HS) sugar chains attached to core proteoglycans (PGs) termed HSPGs mediate an extensive range of cell-extracellular matrix (ECM) and growth factor interactions based upon their sulfation patterns. When compared with non-osteogenic (maintenance media) culture conditions, under established osteogenic culture conditions, MC3T3-E1 cells characteristically increase their osteogenic gene expression profile and switch their dominant fibroblast growth factor receptor (FGFR) from FGFR1 (0.5-fold decrease) to FGFR3 (1.5-fold increase). The change in FGFR expression profile of the osteogenic-committed cultures was reflected by their inability to sustain an FGF-2 stimulus, but respond to BMP-2 at day 14 of culture. The osteogenic cultures decreased their chondroitin and dermatan sulfate PGs (biglycan, decorin, and versican), but increased levels of the HS core protein gene expression, in particular glypican-3. Commitment and progress through osteogenesis is accompanied by changes in FGFR expression, decreased GAG initiation but increased N- and O-sulfation and reduced remodeling of the ECM (decreased heparanase expression) resulting in the production of homogenous (21 kDa) HS chain. With the HSPG glypican-3 expression strongly upregulated in these processes, siRNA was used to knockdown this gene to examine the effect on osteogenic commitment. Reduced glypican-3 abrogated the expression of Runx2, and thus differentiation. The reintroduction of this HSPG into Runx2-null cells allowed osteogenesis to proceed. These results demonstrate the dependence of osteogenesis on specific HS chains, in particular those associated with glypican-3.

The use of a synthetic prostaglandin e1 analogue (misoprostol) as an adjunct to pancreatic enzyme replacement in cystic fibrosis

Eleven cystic fibrosis children (mean age, 9.6 years) were chosen at random to participate in a study to observe the effects of concurrently stimulating gastric/duodenal bicarbonate secretion and inhibiting gastric acid secretion, using a methylated prostaglandin E1 analogue in patients with pancreatic insufficiency and taking pancreatic enzymes. Percentage fat absorption in 3-day stool collections were calculated before and after commencing therapy with misoprostol, 400 μg/day in divided doses. We found a significant reduction in fat output (14.7 ± 11.7 versus 7.5 ± 3.5 g/day, p < 0.05) in the study group as a whole and a significant reduction in steatorrhoeic level as a percentage of fat intake in all of the patients with abnormal base-line collections (23.1% versus 9.2% p < 0.002). We conclude that misoprostol should be considered in cystic fibrosis patients with steatorrhoea as a means of improving nutrient absorption. © 1988 Informa UK Ltd All rights reserved: reproduction in whole or part not permitted.

The use of a synthetic prostaglandin-E1 analog (misoprostol) as an adjunct to pancreatic-enzyme replacement in cystic-fibrosis

Eleven cystic fibrosis children (mean age, 9.6 years) were chosen at random to participate in a study to observe the effects of concurrently stimulating gastric/duodenal bicarbonate secretion and inhibiting gastric acid secretion, using a methylated prostaglandin E1 analogue in patients with pancreatic insufficiency and taking pancreatic enzymes. Percentage fat absorption in 3-day stool collections were calculated before and after commencing therapy with misoprostol, 400 μg/day in divided doses. We found a significant reduction in fat output (14.7 ± 11.7 versus 7.5 ± 3.5 g/day, p < 0.05) in the study group as a whole and a significant reduction in steatorrhoeic level as a percentage of fat intake in all of the patients with abnormal base-line collections (23.1% versus 9.2%, p < 0.002). We conclude that misoprostol should be considered in cystic fibrosis patients with steatorrhoea as a means of improving nutrient absorption.

MC3T3-E1 Osteoblasts Adhesion to Micropatterned Surfaces

细胞在材料表面的黏附对细胞的增殖和分化起重要作用。格式化表面提供了对细胞在基底的空间分布和动附进行控制的方法。利用微制作形成的格式模板,分别以微接触转印法和微流道法形成格式化表面,使MC3T3-E1成骨细胞以一定的格式黏附于表面上。在微接触转印法形成的含二氯二甲基硅烷(DMS)的疏水区域和不含DMS的亲水区域相间隔的表面,细胞优先在亲水区域黏附。在微流道法形成的胶原和白蛋白格式化表面,细胞优先黏附于含胶原区域。结果还表明微格式化表面可以用于研究表面的物理化学性质对细胞的黏附等功能的影响。

MC3T3-E1成骨细胞在微格式化表面的黏附

细胞在材料表面的黏附对细胞的增殖和分化起重要作用。格式化表面提供了对细胞在基底的空间分布和黏附进行控制的方法。本文利用微制作形成的格式模板，分别以微接触转印法和微流道法形成格式化表面，使MC3T3-E1成骨细胞以一定的格式黏附于表面上。在微接触转印法形成的含二氯二甲基硅烷（DMS）的疏水区域和不含DMS的亲水区域相间隔的表面。细胞优先在亲水区域黏附。在微流道法形成的胶原和白蛋白格式化表面，细胞优先黏附于含胶原区域。结果还表明微格式化表面可以用于研究表面的物理化学性质对细胞的黏附等功能的影响。

Comparative analysis of astaxanthin and its esters in the mutant E1 of Haematococcus pluvialis and other green algae by HPLC with a C30 column

A gradient reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) method using a C30 column was developed for the simultaneous determination of astaxanthin, astaxanthin monoesters and astaxanthin diesters in the green algae Chlorococcum sp., Chlorella zofingiensis, Haematococcus pluvialis and the mutant E1, which was obtained from the mutagenesis of H. pluvialis by exposure to UV-irradiation and ethyl methanesulphonate (EMS) with subsequent screening using nicotine. The results showed that the contents of total astaxanthins including free astaxanthin and astaxanthin esters ranged from 1.4 to 30.9 mg/g dry biomass in these green algae. The lower total astaxanthin levels (< 2 mg/g dry biomass) were detected in the green algae Chlorococcum sp. and C. zofingiensis. The higher total astaxanthin levels (> 16 mg/g dry biomass) were found in the green alga H. pluvialis and its mutant E1. It is notable that the mutant E1 is found to have considerably higher amounts of total astaxanthin (30.9 mg/g) as compared to the wild strain of H. pluvialis (16.1 mg/g). This indicates that UV-irradiation and EMS compound mutagenesis with subsequent screening using nicotine is an effective method for breeding of a high-producing astaxanthin strain of H. pluvialis. In addition, the green alga C. zofingiensis had a remarkably higher percentage of astaxanthin diesters (76.3% of total astaxanthins) and a remarkably lower percentage of astaxanthin monoesters (18.0% of total astaxanthins) in comparison with H. pluvialis (35.5% for diesters and 60.9% for monoesters), the mutant E1 (49.1% and 48.1%) and Chlorococcum sp. (18.0% and 58.6%).