Intrinsic pH-Sensitivity of Cells in the Retrotrapezoid Nucleus: Possible Role of Glia in Respiratory Drive

An increase in carbon dioxide (CO2) and protons (H+) are the primary signals for breathing. Cells that sense changes in CO2/H+ levels and increase breathing accordingly are located in a region of the caudal medulla oblongata called the retrotrapezoid nucleus (RTN). Specifically, select RTN neurons are intrinsically pH sensitive and send excitatory projections to the respiratory rhythm generator to drive breathing. Glial cells in the RTN are thought to contribute to this respiratory drive, possibly by releasing ATP in response to increases in CO2/H+ levels. However, pH sensitivity of RTN glial cells has yet to be determined. Therefore, the goal of my thesis is to determine if acutely dissociated RTN cells can respond to changes in pH in isolation. To make this determination I used ratiometric fluorescent microscopy to measure intracellular calcium in dissociated RTN cells during changes in bath pH. I found that a small percentage of RTN cells (16%) respond to bath acidification from pH 7.3 to pH 6.9 with an increase in fluorescence indicating an increase in intracellular calcium. Preliminary electrophysiological findings suggest that responsive cells are unable to make action potentials, thus suggesting their identity to be glia. These results indicate that a subset of pH sensitive cells in the RTN are intrinsically pH sensitive and that glia cells may possibly play a role in central chemoreception.

Cells with neuronal characteristics differentiate and persist for one year in rat optic nerve explants cultures.

Evidence concerning the presence or absence of common neuronglia lineages in the postnatal mammalian central nervous system is still a matter of speculation. We address this problem using optic nerve explants, which show an extremely long survival in culture. Morphological, immunocytochemical and immunochemical methods were applied. The results obtained from in vitro tissue were compared with optic nerves (ONs) and whole-brain samples from animals of different ages. Newborn rat ONs represented the starting material of our tissue culture; they are composed of unmyelinated axons, astrocytes and progenitor cells but devoid of neuronal cell bodies. At this age, Western blots of ONs were positively stained by neurofilament and synapsin I specific antibodies. These bands increased in intensity during postnatal in situ development. In explant cultures, the glia cells reach a stage of functional differentiation and they maintain, together with undifferentiated cells, a complex histotypic organization. After 6 days in vitro, neurofilaments and synapsin I could not be detected on immunoblots, indicating that 1) axonal degeneration was completed, and 2) neuronal somata were absent at the time. Surprisingly, after about 4-5 weeks in culture, a new cell type appeared, which showed characteristics typical of neurons. After 406 days in vitro, neurofilaments and synapsin I were unequivocally detectable on Western blots. Furthermore, both immunocytochemical staining and light and electron microscopic examinations corroborated the presence of this earlier-observed cell type. These in vitro results clearly show the high developmental plasticity of ON progenitor cells, even late in development. The existence of a common neuron-glia precursor, which never gives rise to neurons in situ, is suggested.

Do glial cells control pain?

Management of chronic pain is a real challenge, and current treatments focusing on blocking neurotransmission in the pain pathway have only resulted in limited success. Activation of glia cells has been widely implicated in neuroinflammation in the central nervous system, leading to neruodegeneration in many disease conditions such as Alzheimer's and multiple sclerosis. The inflammatory mediators released by activated glial cells, such as tumor necrosis factor-α and interleukin-1β can not only cause neurodegeneration in these disease conditions, but also cause abnormal pain by acting on spinal cord dorsal horn neurons in injury conditions. Pain can also be potentiated by growth factors such as BDNF and bFGF that are produced by glia to protect neurons. Thus, glia cells can powerfully control pain when they are activated to produce various pain mediators. We will review accumulating evidence supporting an important role of microglia cells in the spinal cord for pain control under injury conditions (e.g. nerve injury). We will also discuss possible signaling mechanisms in particular MAP kinase pathways that are critical for glia control of pain. Investigating signaling mechanisms in microglia may lead to more effective management of devastating chronic pain.

Role of glast-positive glial cells during photoreceptor development

Purpose: Taking advantage of two transgenic lines, glast.DsRed and crx.gfp, that express fluorescent proteins in glial and photoreceptor cells respectively, we investigate the role of glast-positive glial cells (GPCs) in the survival/differentiation/proliferation of age-matched photoreceptor cells. Methods: Primary retinal cells were isolated from newborn transgenic mouse retina (glast.dsRed::crx.gfp) at postnatal day (P0/P1) and propagated in defined medium containing epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor 2 (bFGF). By flow-sorting another population of pure GPCs was isolated. Both populations were expanded and analyzed for the presence of specific retinal cell markers. Notably, the primary cell culture collected from the transgenic line glast.dsRed::crx.gfp showed a conspicuous presence of immature photoreceptors growing on top of GPCs. In order to reveal the role of such cells in the survival/differentiation/proliferation of photoreceptors we set up in vitro cultures of retina-derived cells that allowed long-term time-lapse recordings charting every cell division, death and differentiation event. To assess the regenerative potential of GPCs we challenged them with compounds mimicking retinal degeneration (NMU, NMDA, Zaprinast). Mass spectrometry (MS), immunostainings and other molecular approaches were performed to reveal adhesion molecules involved in the relationship between glial cells and photoreceptors. Results: Both primary cell lines were highly homogenous, with an elongated morphology and the majority expressed Müller glia markers (MG) such as glast, blbp, glt-1, vimentin, glutamine synthetase (GS), GFAP, cd44, mash1 and markers of reactive Müller glia such as nestin, pax6. Conversely, none of them were found positive for retinal neuron markers like tuj1, otx2, recoverin. Primary cultures of GPCs show the incapability of glial cells to give rise to photoreceptors in both wild type or degenerative environment. Furthermore, primary cultures of pure GPCs challenged with different compounds did not highlight the production of new glial cell-derived photoreceptors. Adhesion molecules involved in the contact between photoreceptors and glial cells are still under investigation. Conclusions: Primary glia cells do not give rise to photoreceptor cells in wt and degenerative conditions at least in vitro. The roles of glial cells seem to be more linked to the maintenance/proliferation of photoreceptor cells.

Glial cells of the central nervous system of Bothrops jararaca (Reptilia, Ofidae): an ultrastructural study

Abstract Although ultrastructural characteristics of mature neuroglia in the central nervous system (CNS) are very well described in mammals, much less is known in reptiles, especially serpents. In this context, two specimens of Bothrops jararaca were euthanized for morphological analysis of CNS glial cells. Samples from telencephalon, mesencephalon and spinal cord were collected and processed for light and transmission electron microscopy investigation. Astrocytes, oligodendrocytes, microglial cells and ependymal cells, as well as myelin sheaths, presented similar ultrastructural features to those already observed in mammals and tended to maintain their general aspect all over the distinct CNS regions observed. Morphological similarities between reptilian and mammalian glia are probably linked to their evolutionary conservation throughout vertebrate phylogeny.

Sôbre a patogenia da Grangrena gasona

Since von Hibler gas grangrene has been considered a local infection with systemic symptoms. When we consider some of the symptoms of gas gangrene, those of the central nervous system are in evidence beeing similar to those observed in tetanus and botulism. It is likely therefore that gas gangrene intoxication and the disease caused by it are of neurotoxic nature. With Almeida Cardoso and Araujo Costa we were able to demonstrate lesions in the central nervous system of animals wich had been intoxicated during a short period of time as well in those with intoxication of longer duration. In acute intoxication, after intracreneal inoculation, severe alterations were seen within 20 to 30 minutes in the cells of the spinal cord, specially in motor cells and also in some cells of the posterior cord and spinal bulb. The changes consisted in chromatolysis and picnosis and were more marked in animals intoxicated with Clostridium histolyticum and Cl. perfringens toxines. Myelin sheet was unchanged. in delayed intoxication with greater and repeated dosis lesions of the central nervous system (brain, protuberance, medula ablongate and medula spinal) were observed. They consisted in hyperemia, perivascular hemorrages in white and grey substances, oedema, accumulation of glia cells with enlarged and hyperchromatic nuclei, fragmentation of the myelin sheet and balooning degeneration of the described by Spielmeyer. Such changes were found in the swollen and hemorragic zones and were generally similar to those found in the acute type of Spielmeyer 9acute swelling and liquefation). Other changes found sometimes were agglutination of Nissl's bodies, sinous appearence of the dendritic endings, shruncken cells of Spielmeyer and neuronophagy around "ghost" cells. In short the changes...

Interferon-gamma is a critical modulator of CB(2) cannabinoid receptor signaling during neuropathic pain

Nerve injuries often lead to neuropathic pain syndrome. The mechanisms contributing to this syndrome involve local inflammatory responses, activation of glia cells, and changes in the plasticity of neuronal nociceptive pathways. Cannabinoid CB(2) receptors contribute to the local containment of neuropathic pain by modulating glial activation in response to nerve injury. Thus, neuropathic pain spreads in mice lacking CB(2) receptors beyond the site of nerve injury. To further investigate the mechanisms leading to the enhanced manifestation of neuropathic pain, we have established expression profiles of spinal cord tissues from wild-type and CB(2)-deficient mice after nerve injury. An enhanced interferon-gamma (IFN-gamma) response was revealed in the absence of CB(2) signaling. Immunofluorescence stainings demonstrated an IFN-gamma production by astrocytes and neurons ispilateral to the nerve injury in wild-type animals. In contrast, CB(2)-deficient mice showed neuronal and astrocytic IFN-gamma immunoreactivity also in the contralateral region, thus matching the pattern of nociceptive hypersensitivity in these animals. Experiments in BV-2 microglia cells revealed that transcriptional changes induced by IFN-gamma in two key elements for neuropathic pain development, iNOS (inducible nitric oxide synthase) and CCR2, are modulated by CB(2) receptor signaling. The most direct support for a functional involvement of IFN-gamma as a mediator of CB(2) signaling was obtained with a double knock-out mouse strain deficient in CB(2) receptors and IFN-gamma. These animals no longer show the enhanced manifestations of neuropathic pain observed in CB(2) knock-outs. These data clearly demonstrate that the CB(2) receptor-mediated control of neuropathic pain is IFN-gamma dependent.

Étude du rôle de Pax6 dans la gliogenèse

Les astrocytes sont des cellules gliales présentes dans le système nerveux central, qui exercent de nombreuses fonctions physiologiques essentielles et sont impliquées dans la réponse aux lésions et dans plusieurs pathologies du cerveau. Les astrocytes sont générés par les cellules de la glie radiale, les précurseurs communs de la plupart des cellules neuronales et gliales du cerveau, après le début de la production des neurones. Le passage de la neurogenèse à la gliogenèse est le résultat de mécanismes moléculaires complexes induits par des signaux intrinsèques et extrinsèques responsables du changement de propriété des précurseurs et de leur spécification. Le gène Pax6 code pour un facteur de transcription hautement conservé, impliqué dans plusieurs aspects du développement du système nerveux central, tels que la régionalisation et la neurogenèse. Il est exprimé à partir des stades les plus précoces dans les cellules neuroépithéliales (les cellules souches neurales) et dans la glie radiale, dérivant de la différenciation de ces cellules. L’objectif de cette étude est d’analyser le rôle de Pax6 dans la différenciation et dans le développement des astrocytes. À travers l’utilisation d’un modèle murin mutant nul pour Pax6, nous avons obtenu des résultats suggérant que la suppression de ce gène cause l'augmentation de la prolifération et de la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches neurales embryonnaires. In vitro, les cellules mutantes prolifèrent de façon aberrante et sous-expriment les gènes p57Kip2, p16Ink4a, p19Arf et p21Cip1, qui inhibent la progression du le cycle cellulaire. De plus, Pax6 promeut la différenciation astrocytaire des cellules souches neurales embryonnaires et est requis pour la différenciation des astrocytes dans la moëlle épinière. Les mutants nuls pour Pax6 meurent après la naissance à cause de graves défauts développementaux dus aux fonctions essentielles de ce gène dans le développement embryonnaire de plusieurs organes. En utilisant un modèle murin conditionnel basé sur le système CRE/ loxP (hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox) qui présente l’inactivation de Pax6 dans les cellules de la glie radiale, viable après la naissance, nous avons montré que Pax6 est impliqué dans la maturation et dans le développement post-natal des astrocytes. Le cortex cérébral des souris mutantes conditionnelles ne présente pas d’astrocytes matures à l’âge de 16 jours et une très faible quantité d’astrocytes immatures à l’âge de trois mois, suggérant que Pax6 promeut la différenciation et la maturation des astrocytes. De plus, Pax6 semble jouer un rôle même dans le processus de différenciation et de maturation de cellules gliales rétiniennes. L’étude des gènes et des mécanismes moléculaires impliqués dans la génération des astrocytes est crucial pour mieux comprendre le rôle physiologique et les altérations pathologiques des ces cellules.

Caractérisation moléculaire du rôle de Lhx2 dans le développement de l'oeil et du cerveau

Le développement du système nerveux central (SNC) chez les vertébrés est un processus d'une extrême complexité qui nécessite une orchestration moléculaire très précise. Certains gènes exprimés très tôt lors du développement embryonnaire sont d'une importance capitale pour la formation du SNC. Parmi ces gènes, on retrouve le facteur de transcription à Lim homéodomaine Lhx2. Les embryons de souris mutants pour Lhx2 (Lhx2-/-) souffre d'une hypoplasie du cortex cérébral, sont anophtalmiques et ont un foie de volume réduit. Ces embryons mutants meurent in utero au jour embryonnaire 16 (e16) dû à une déficience en érythrocytes matures. L'objectif principal de cette thèse est de caractériser le rôle moléculaire de Lhx2 dans le développement des yeux et du cortex cérébral. Lhx2 fait partie des facteurs de transcription à homéodomaine exprimé dans la portion antérieure de la plaque neurale avec Rx, Pax6, Six3. Le développement de l'oeil débute par une évagination bilatérale de cette région. Nous démontrons que l'expression de Lhx2 est cruciale pour les premières étapes de la formation de l'oeil. En effet, en absence de Lhx2, l'expression de Rx, Six3 et Pax6 est retardée dans la plaque neurale antérieure. Au stade de la formation de la vésicule optique, l'absence de Lhx2 empêche l'activation de Six6 (un facteur de transcription également essentiel au développement de l'œil). Nous démontrons que Lhx2 et Pax6 coopèrent en s'associant au promoteur de Six6 afin de promouvoir sa trans-activation. Donc, Lhx2 est un gène essentiel pour la détermination de l'identité rétinienne au niveau de la plaque neurale. Plus tard, il collabore avec Pax6 pour établir l'identité rétinienne définitive et promouvoir la prolifération cellulaire. De plus, Lhx2 est fortement exprimé dans le télencéphale, région qui donnera naissance au cortex cérébral. L'absence de Lhx2 entraîne une diminution de la prolifération des cellules progénitrices neurales dans cette région à e12.5. Nous démontrons qu'en absence de Lhx2, les cellules progénitrices neurales (cellules de glie radiale) se différencient prématurément en cellules progénitrices intermédiaires et en neurones post-mitotiques. Ces phénotypes sont corrélés à une baisse d'activité de la voie Notch. En absence de Lhx2, DNER (un ligand atypique de la voie Notch) est fortement surexprimé dans le télencéphale. De plus, Lhx2 et des co-répresseurs s'associent à la chromatine de la région promotrice de DNER. Nous concluons que Lhx2 permet l'activation de la voie Notch dans le cortex cérébral en développement en inhibant la transcription de DNER, qui est un inhibiteur de la voie Notch dans ce contexte particulier. Lhx2 permet ainsi la maintenance et la prolifération des cellules progénitrices neurales.

Effects of environmental complexity on neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus

Introduction. Postnatal neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus, can be modulated by numerous determinants, such as hormones, transmitters and stress. Among the factors positively interfering with neurogenesis, the complexity of the environment appears to play a particularly striking role. Adult mice reared in an enriched environment produce more neurons and exhibit better performance in hippocampus-specific learning tasks. While the effects of complex environments on hippocampal neurogenesis are well documented, there is a lack of information on the effects of living under socio-sensory deprivation conditions. Due to the immaturity of rats and mice at birth, studies dealing with the effects of environmental enrichment on hippocampal neurogenesis were carried out in adult animals, i.e. during a period of relatively low rate of neurogenesis. The impact of environment is likely to be more dramatic during the first postnatal weeks, because at this time granule cell production is remarkably higher than at later phases of development. The aim of the present research was to clarify whether and to what extent isolated or enriched rearing conditions affect hippocampal neurogenesis during the early postnatal period, a time window characterized by a high rate of precursor proliferation and to elucidate the mechanisms underlying these effects. The experimental model chosen for this research was the guinea pig, a precocious rodent, which, at 4-5 days of age can be independent from maternal care. Experimental design. Animals were assigned to a standard (control), an isolated, or an enriched environment a few days after birth (P5-P6). On P14-P17 animals received one daily bromodeoxyuridine (BrdU) injection, to label dividing cells, and were sacrificed either on P18, to evaluate cell proliferation or on P45, to evaluate cell survival and differentiation. Methods. Brain sections were processed for BrdU immunhistochemistry, to quantify the new born and surviving cells. The phenotype of the surviving cells was examined by means of confocal microscopy and immunofluorescent double-labeling for BrdU and either a marker of neurons (NeuN) or a marker of astrocytes (GFAP). Apoptotic cell death was examined with the TUNEL method. Serial sections were processed for immunohistochemistry for i) vimentin, a marker of radial glial cells, ii) BDNF (brain-derived neurotrofic factor), a neurotrophin involved in neuron proliferation/survival, iii) PSA-NCAM (the polysialylated form of the neural cell adhesion molecule), a molecule associated with neuronal migration. Total granule cell number in the dentate gyrus was evaluated by stereological methods, in Nissl-stained sections. Results. Effects of isolation. In P18 isolated animals we found a reduced cell proliferation (-35%) compared to controls and a lower expression of BDNF. Though in absolute terms P45 isolated animals had less surviving cells than controls, they showed no differences in survival rate and phenotype percent distribution compared to controls. Evaluation of the absolute number of surviving cells of each phenotype showed that isolated animals had a reduced number of cells with neuronal phenotype than controls. Looking at the location of the new neurons, we found that while in control animals 76% of them had migrated to the granule cell layer, in isolated animals only 55% of the new neurons had reached this layer. Examination of radial glia cells of P18 and P45 animals by vimentin immunohistochemistry showed that in isolated animals radial glia cells were reduced in density and had less and shorter processes. Granule cell count revealed that isolated animals had less granule cells than controls (-32% at P18 and -42% at P45). Effects of enrichment. In P18 enriched animals there was an increase in cell proliferation (+26%) compared to controls and a higher expression of BDNF. Though in both groups there was a decline in the number of BrdU-positive cells by P45, enriched animals had more surviving cells (+63) and a higher survival rate than controls. No differences were found between control and enriched animals in phenotype percent distribution. Evaluation of the absolute number of cells of each phenotype showed that enriched animals had a larger number of cells of each phenotype than controls. Looking at the location of cells of each phenotype we found that enriched animals had more new neurons in the granule cell layer and more astrocytes and cells with undetermined phenotype in the hilus. Enriched animals had a higher expression of PSA-NCAM in the granule cell layer and hilus Vimentin immunohistochemistry showed that in enriched animals radial glia cells were more numerous and had more processes.. Granule cell count revealed that enriched animals had more granule cells than controls (+37% at P18 and +31% at P45). Discussion. Results show that isolation rearing reduces hippocampal cell proliferation but does not affect cell survival, while enriched rearing increases both cell proliferation and cell survival. Changes in the expression of BDNF are likely to contribute to he effects of environment on precursor cell proliferation. The reduction and increase in final number of granule neurons in isolated and enriched animals, respectively, are attributable to the effects of environment on cell proliferation and survival and not to changes in the differentiation program. As radial glia cells play a pivotal role in neuron guidance to the granule cell layer, the reduced number of radial glia cells in isolated animals and the increased number in enriched animals suggests that the size of radial glia population may change dynamically, in order to match changes in neuron production. The high PSA-NCAM expression in enriched animals may concur to favor the survival of the new neurons by facilitating their migration to the granule cell layer. Conclusions. By using a precocious rodent we could demonstrate that isolated/enriched rearing conditions, at a time window during which intense granule cell proliferation takes place, lead to a notable decrease/increase of total granule cell number. The time-course and magnitude of postnatal granule cell production in guinea pigs are more similar to the human and non-human primate condition than in rats and mice. Translation of current data to humans would imply that exposure of children to environments poor/rich of stimuli may have a notably large impact on dentate neurogenesis and, very likely, on hippocampus dependent memory functions.

Transgene Mausmodelle zur Untersuchung von Nervenzellwanderungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden transgene Mausmodelle hergestellt, die eine weitere Aufklärung der Rolle des Transkriptionsfaktors Pax6 bei der Wanderung von Nervenzellen ermöglichen, sowie ein Kultursystem zur Darstellung embryonaler Wanderungen außerhalb des Mutterleibs entwickelt.Bei der YAC-transgenen Mäuselinie PhPax6-taulacZ wird das Reportergen taulacZ unter der Kontrolle des Pax6-Promotors exprimiert. Dadurch ist dort, wo Pax6 im Zellkern vorliegt, der Rest der Zelle über seine gesamte Ausdehnung mit der vom taulacZ-Transgen kodierten tau-b-Galactosidase markiert. Das räumlich-zeitliche Expressionsmuster von Pax6 und dem Transgen taulacZ wurde detailliert untersucht. Dabei wurde eine hohe Übereinstimmung festgestellt. Basierend auf der Darstellung der Zellen in ihrer gesamten Ausdehnung, die durch das taulacZ-Transgen erstmals möglich ist, wurde eine Klassifizierung Pax6-positiver Zelltypen vorgenommen. Zunächst wird Pax6 in Neuroepithelzellen, später in radialen Gliazellen exprimiert.Mit der zweiten transgenen Mäuselinie, PhPax6-tTA, wurde ein Werkzeug hergestellt, das die gezielte und hoch spezifische Expression von beliebigen Transgenen in Pax6-exprimierenden Zellen ermöglicht. In Pax6-positive Zellen der Medulla wurde das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) eingeführt und das Wanderungsverhalten in vitro über mehrere Tage dargestellt. Erstmals können mit dieser Linie beliebige Expressionskonstrukte gezielt, hocheffizient und schnell in wandernde Neurone eingebracht werden, ohne störende Hinter-grundexpression in anderen Zellen.

Neuroglobin, Cytoglobin und Myoglobin in der Blindmaus Spalax ehrenbergi: Adaptation an „unterirdische Verhältnisse“

Hypoxie ist ein Zustand des Sauerstoffmangels, hervorgerufen durch fehlende Verfügbarkeit von Sauerstoff in der Umgebung eines Organismus oder durch pathologisch bedingte unzureichende Nutzbarkeit des Sauerstoffs von Geweben. Die Sensitivität gegenüber Hypoxie variiert enorm im Tierreich zwischen verschiedenen Phyla und Spezies. Die meisten Säugetiere sind nur unzureichend an niedrige Sauerstoffkonzentrationen angepasst, wohingegen einige unterirdisch lebende Säuger sehr resistent gegen Hypoxiestress sind. Um die molekulare Basis der Hypoxietoleranz zu bestimmen, wurden in der vorliegenden Arbeit Globine untersucht, die potenziell in der Lage sind, als respiratorische Proteine zur Hypoxietoleranz von Tieren beizutragen. Dazu wurde die Expression der Globine in der hypoxieresistenten, in Israel lebenden Blindmaus Spalax ehrenbergi mit der Genexpression in der hypoxiesensitiven Ratte (Rattus norvegicus) verglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden die erst vor wenigen Jahren entdeckten Globine Neuroglobin und Cytoglobin untersucht, deren exakte physiologische Rolle noch unklar ist, und mit Daten des viel detaillierter untersuchten Myoglobins verglichen. Beim Vergleich der Expression von Cytoglobin und Neuroglobin in Spalax versus Ratte fällt auf, dass Neuroglobin und Cytoglobin bereits unter normoxischen Bedingungen auf mRNA- und Proteinebene in der Blindmaus um einen Faktor von mindesten 2 bis 3 verstärkt exprimiert werden. Bei Myoglobin (als dem Kontrollgen mit bekannter Funktion) konnte auf mRNA-Ebene eine noch weitaus stärkere Expression in Spalax vs. Ratte gefunden werden. Das übergreifende Phänomen der verstärkten Genexpression von Globinen in Spalax kann im Sinne einer Präadaptation an das unterirdische, häufig hypoxische Leben der Blindmaus interpretiert werden. Einen weiteren Hinweis auf eine besondere, spezialisierte Funktion von Neuroglobin in Spalax geben immunhistochemische Daten, die zeigen, dass Neuroglobin im Gehirn von Spalax im Gegensatz zur Ratte nicht nur in Neuronen, sondern auch in Gliazellen exprimiert wird. Dies impliziert Änderungen des oxidativen Stoffwechsels im Nervensystem der hypoxietoleranten Spezies. Die zellulären Expressionsmuster von Cytoglobin erscheinen hingegen in beiden Säugerspezies weitgehend identisch. Es wurde der Frage nachgegangen, ob und wie experimentell induzierte Hypoxie die Genexpression der Globine verändert. Dabei zeigten sich für Neuroglobin und Cytoglobin unterschiedliche Expressionsmuster. Neuroglobin wird unter diversen Sauerstoffmangelbedingungen sowohl in der Ratte als auch in Spalax auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert. Ein ähnliches Regulationsverhalten wurde auch für Myoglobin beobachtet. Die verminderte Expression von Neuroglobin (und evtl. auch Myoglobin) unter Hypoxie ist mit einer gezielten Verringerung der Sauerstoff-Speicherkapazität in Abwesenheit von O2 zu erklären. Ein weiterer denkbarer Grund könnte auch die allgemeine Tendenz sein, unter Hypoxie aus Energiespargründen den Metabolismus herunter zu regulieren. Cytoglobin, das bei normalen Sauerstoffbedingungen nur im Gehirn von Spalax (nicht jedoch in Herz und Leber) ebenfalls um Faktor 2 bis 3 stärker exprimiert wird als in der Ratte, ist mit einiger Sicherheit ebenfalls von adaptivem Nutzen für die Anpassung von Spalax an niedrige Sauerstoffbedingungen, wenngleich seine Funktion unklar bleibt. Unter Hypoxie wird die Cytoglobin-mRNA sowohl in Spalax als auch in der Ratte hochreguliert. Es konnte in der vorliegenden Arbeit dargelegt werden, dass die Expression von Cygb höchstwahrscheinlich durch den Transkriptionsfaktor Hif-1 gesteuert wird, der die molekulare Hypoxieantwort vieler Tierarten zentral steuert. In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls die Expression von Ngb und Cygb im Gehirn des Hausschweins (Sus scrofa) untersucht. Diese Spezies diente in der Arbeit als weiterer hypoxiesensitiver Organismus sowie als biomedizinisch relevantes Modell für eine Operation an Säuglingen mit angeborenen Herzkrankheiten. Die Versuche haben gezeigt, dass die Gabe bestimmter Medikamente wie dem Immunsuppressivum FK506 zu einer erhöhten Ngb-Konzentration auf mRNA-Ebene führen kann, was potenziell im Zusammenhang mit beobachteten protektiven Effekten der Medikamentengabe während und nach der Herzoperation steht.

Analyse der Funktion von Dystroglycan im frühen sich entwickelnden ZNS mittels inhibierender Antikörper

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von Dystroglycan in jungen und späten Stadien des sich entwickelnden ZNS untersucht. Hierzu wurden Antikörper generiert, die fähig waren, in vivo die Interaktion zwischen a-und b-Dystroglycan zu stören. Die Antikörper oder Fab-Fragmente wurden in das Mesencephalon oder Auge lebender Hühnerembryonen injiziert, um aus den beobachteten Veränderungen die Funktion des DAG zu untersuchen. Die Fab-Fragmentinjektionen führten zu Hyperproliferation, verbunden mit morphologischen Veränderungen der Neuroepithelzellen und Zunahme der Anzahl postmitotischer Neuronen. Ebenso wurde die basale und apikale Polarität von Neuroepithelzellen beeinflusst. Auch die Axonorientierung der tectobulbären Axone wurde durch die Injektionen gestört. In älteren embryonalen Stadien kam es, durch Fab-Fragmentinjektionen in die Augen von Embryonen, zu strukturellen Veränderungen der Retina, verbunden mit einer breiteren Verteilung des DAG, wie auch der Synapsen innerhalb der OPL. Die retinalen Zelltypen, wie Müller-Gliazellen und Stäbchen-Bipolarzellen, waren abgerundet und hatten ihre typische Zellform verloren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Dystroglycan einen entscheidenden Einfluss auf die Proliferation, Migration, Polarität und Differenzierung der Neuroepithelzellen ausübt. Außerdem zeigen diese Daten, dass Dystroglycan nicht nur in der frühen embryonalen ZNS-Entwicklung eine maßgebliche Rolle spielt, sondern auch in späten Stadien. Die Ähnlichkeit der beobachteten Veränderungen nach Fab-Fragmentinjektionen legt nahe, dass einige Veränderungen im ZNS bestimmter Muskeldystrophieformen, durch Beeinflussung der Neuroepithelzellen im sich entwickelnden ZNS, verursacht werden.

Inhibierung des IL-17A vermittelten Blut-Hirnschrankenversagens in experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) und Mikrogliaaktivierung durch IL-17A

Experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) ist das Tiermodell für Multiple Sklerose (MS). Es ist bekannt, dass das proinflammatorische Zytokin IL-17A eine wichtige Rolle in MS und EAE spielt. Dieses wird hauptsächlich von einer Subpopulation der T-Helferzellen (Th17 Zellen) exprimiert. Es war bekannt, dass diese am Zusammenbruch der Blut-Hirnschranke (BHS) beteiligt sind. Der Integritätsverlust der BHS ist ein wichtiger und früher Aspekt in der Pathogenese von EAE und MS. Daraufhin können Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS) eindringen. Spezifische T-Zellen greifen das Myelin an und führen so zu einer Entzündungsreaktion, Demyelinisierung und axonalem Schaden. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass durch Hemmung des kontraktilen endothelialen Apparates das BHS Versagen vermindert werden kann und es dadurch zu einem milderen Verlauf der EAE Pathogenese kommt. Wird der Inhibitor der Myosinleichtkettenkinase ML-7 C57/bl6 Mäusen, bei denen EAE induziert wurde, intraperitoneal verabreicht, kommt es zu einem geringeren Phosphorylierungsgrad der leichten Kette des Myosins in Endothelzellen und folglich zu einem verringerten Schrankenversagen. Außerdem konnte ich zeigen, dass weniger reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gebildet werden. Folglich kommt es zu einer geringeren Infiltration von Immunzellen aus der Peripherie in das ZNS. Somit werden weniger Zytokine und auch Matrixmetalloproteinasen (MMP) ausgeschüttet, wodurch die Entzündungsreaktion weniger stark ausgeprägt ist. Außerdem werden weniger Mikrogliazellen aktiviert. Ich habe den Zusammenhang zwischen Mikrogliazellaktivierung und IL-17A näher untersucht. Dieses proinflammatorische Zytokin aktiviert Mikrogliazellen auch in vitro. Durch IL-17A Stimulation kommt es zur vermehrten ROS Bildung. Folglich kommt es zu einer vermehrten Proliferation und Migration, sowie einer erhöhten Zytokinproduktion. Außerdem konnte ich zeigen, dass der N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor an der Mikrogliaaktivierung beteiligt ist. Abhängig von IL-17A Stimulation kommt es zu einem Kalziumeinstrom über den NMDA-Rezeptor. Werden Inhibitoren des NMDA-Rezeptors eingesetzt, können IL-17A vermittelte Proliferation, Migration, Zytokin-und ROS-Produktion verhindert werden. Der NMDA-Rezeptor ist sehr gut in Neuronen erforscht, wohingegen bisher sehr wenig über seine Funktion in Gliazellen bekannt war. In dieser Arbeit ist es mir gelungen einen Zusammenhang zwischen IL-17A vermittelter Mikrogliaaktivierung und Kalziumeinstrom über den NMDA-Rezeptor herzustellen.

Untersuchungen zur Expression und Lokalisation der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Säugern

Die vorliegende Dissertation beinhaltet Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Nbg) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten. rnrnUm die Expression der Globine während der Entwicklung des Säugerhirns zu untersuchen, wurden die Hirne von Maus-Embryonen ab dem Fötalstadium MF10 bis zum Tag eins nach der Geburt (T1) mit Adulttieren verglichen. Quantifiziert wurde sowohl die mRNA- als auch die Protein-Expression. Beide Globine zeigten im Verlauf der Entwicklung einen stetigen Anstieg der mRNA-Expression, wobei Ngb zu Beginn in zehnfach höherer Konzentration vorlag und im zeitlichen Verlauf einen 130-fachen Anstieg zeigte. Cygb zeigte lediglich einen 16-fachen Anstieg bis zum Adultstadium. Auf Proteinebene konnte die Expressionszunahme beider Globine im Laufe der Entwicklung bestätigt werden. Weder in den hypoxieresistenten Frühembryonalstadien noch während der mit Sauerstoff-Stress verbundenen Geburt zeigte sich ein Expressionsmaximum. Dies spricht gegen eine Globin-Funktion in der Oxidanz-Abwehr. Eher ist zumindest Ngb mit der Reifung der Neurone und dem damit einhergehenden, gesteigerten oxidativen Stoffwechsel assoziiert.rnrnDes Weiteren sollte die zelluläre und intrazelluläre Lokalisation beider Globine anhand einer primären Zellkultur aus dem Hippocampus pränataler Ratten und in immortalen Zelllinien untersucht werden. Neuroglobin wurde dabei nur in Neuronen, nicht jedoch in Gliazellen nachgewiesen. Das Färbemuster war in allen Ngb-exprimierenden Zellen zytoplasmatisch. Cytoglobin wurde in der Primärkultur in den Neuronen jedoch ebenso in den mit anti-GFAP markierten Gliazellen beobachtet. In beiden Zellpopulationen war auch der Kern durch das CyGB-Antiserum markiert. rnEine genauere Untersuchung der intrazellulären Lokalisation sollte durch die Transfektion von Globin-pEGFP-Fusionsproteinen erfolgen. Nach Transfektion der Fusionskonstrukte wurde die GFP-Färbung bei beiden Globinen sowohl im Zytoplasma als auch im Kern beobachtet. Eine rein nukleäre Lokalisation, die insbesondere für Cygb von anderen Autoren postuliert wurde, konnte somit ausgeschlossen werden. rnrnIn primären Zellkulturen aus Cerebellum und Kortex, die mit Hilfe von Paraquat oxidativem Stress ausgesetzt wurden, wurde der Verlauf der Globin-mRNA-Expression mit dem unregulierten 18s rRNA-Referenzgen und mit den Antioxidanz-Enzymen Cu-Zn-SOD und Gpx verglichen. Neuroglobin zeigte einen Expressionsverlauf ähnlich dem der beiden Antioxidanz-Enzyme, jedoch liegt seine mRNA im Hirngewebe in hundertfach niedrigerer Menge als Cu-Zn-SOD und Gpx vor. Cytoglobin zeigte keine Veränderung der Expression. Eine Funktion der Globine im Sinne einer ROS-Abwehr kann aus den Befunden nicht abgeleitet werden. rnrnUntersuchungen von Tumor und Normalgewebe mittels eines cDNA-Cancer-Arrays zeigten, dass NGB in Tumoren verschiedenen Ursprungs nicht exprimiert wird, CyGB dagegen keine Änderung seiner Expression in Tumor versus Normalgewebe erfährt. Eine Induktion der beiden Globine z.B. durch Hypoxie in soliden Tumoren kann daher ausgeschlossen werden.rn