Uniparental DNA markers and forensic genetics in Finland

Over the years, a wide range of methods to verify identity have been developed. Molecular markers have been used for identification since the 1920s, commencing with blood types and culminating with the advent of DNA techniques in the 1980s. Identification is required by authorities in many occasions, e.g. in disputed paternity cases, identification of deceased, or crime investigation. To clarify maternal and paternal lineages, uniparental DNA markers in mtDNA and Y-chromosome can be utilized. These markers have several advantages: male specific Y-chromosome can be used to identify a male from a mixture of male and female cells, e.g. in rape cases. MtDNA is durable and has a high copy number, allowing analyses even from old or degraded samples. However, both markers are lineage-specific, not individualizing, and susceptible to genetic drift. Prior to the application of any DNA marker in forensic casework, it is of utmost importance to investigate its qualities and peculiarities in the target population. Earlier studies on the Finnish population have shown reduced variation in the Y-chromosome, but in mtDNA results have been ambiguous. The obtained results confirmed the low diversity in Y-chromosome in Finland. Detailed population analysis revealed large regional differences, and extremely reduced diversity especially in East Finland. Analysis of the qualities affecting Y-chromosomal short tandem repeat (Y-STR) variation and mutation frequencies, and search of new polymorphic markers resulted a set of Y-STRs with especially high diversity in Finland. Contrary to Y-chromosome, neither reduced diversity nor regional differences were found in mtDNA within Finland. In fact, mtDNA diversity was found similar to other European populations. The revealed peculiarities in the uniparental markers are a legacy of the Finnish population history. The obtained results challenge the traditional explanation which emphasizes relatively recent founder effects creating the observed east-west patterns. Uniparentally inherited markers, both mtDNA and Y-chromosome, are applicable for identification purposes in Finland. By adjusting the analysed Y marker set to meet the characteristics of Finnish population, Y-chromosomal diversity increases and the regional differentiation decreases, resulting increase in discrimination power and thus usefulness of Y-chromosomal analysis in forensic casework.

Latin-American Society Of Forensic Genetics (SLAGF) results of the Interlaboratory Quality Control Exercise 2010-2011

Latin-American Society of Forensic Genetics (SLAGF) Interlaboratory Quality Control Exercise (2010-2011) included the analysis of three bloodstain samples in FTA Classic Card (three persons, biologically unrelated) and one theoretical exercise. There were 56 participating laboratories from 13 Latin-American countries that belong to society, were reported 70 STRs, including autosomal and sex chromosome markers with consensus in 53 STRs with a rate in reporting errors of 2.3%. Fifty-six laboratories reported results in theoretical exercise with mistakes in calculation of IP for each marker. It is necessary to hold meetings to discuss the results of this exercise to reach conclusions and recommendations on all aspects of DNA forensics analysis and paternity test, to improve results and quality in the results of each laboratory. © 2011 Elsevier B.V.

Forensic identification of the guitarfish species Rhinobatos horkelli, R-percellens and Zapteryx brevirostris using multiplex-PCR

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Wildlife forensic DNA and lowland tapir (Tapirus terrestris) poaching

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

The GHEP-EMPOP collaboration on mtDNA population data-A new resource for forensic casework

Mitochondrial DNA (mtDNA) population data for forensic purposes are still scarce for some populations, which may limit the evaluation of forensic evidence especially when the rarity of a haplotype needs to be determined in a database search. In order to improve the collection of mtDNA lineages from the Iberian and South American subcontinents, we here report the results of a collaborative study involving nine laboratories from the Spanish and Portuguese Speaking Working Group of the International Society for Forensic Genetics (GHEP-ISFG) and EMPOP. The individual laboratories contributed population data that were generated throughout the past 10 years, but in the majority of cases have not been made available to the scientific community. A total of 1019 haplotypes from Iberia (Basque Country, 2 general Spanish populations, 2 North and 1 Central Portugal populations), and Latin America (3 populations from São Paulo) were collected, reviewed and harmonized according to defined EMPOP criteria. The majority of data ambiguities that were found during the reviewing process (41 in total) were transcription errors confirming that the documentation process is still the most error-prone stage in reporting mtDNA population data, especially when performed manually. This GHEP-EMPOP collaboration has significantly improved the quality of the individual mtDNA datasets and adds mtDNA population data as valuable resource to the EMPOP database (www.empop.org). (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.

Development and validation of a D-loop mtDNA SNP assay for the screening of specimens in forensic casework

Mitochondrial DNA (mtDNA) analysis is usually a last resort in routine forensic DNA casework. However, it has become a powerful tool for the analysis of highly degraded samples or samples containing too little or no nuclear DNA, such as old bones and hair shafts. The gold standard methodology still constitutes the direct sequencing of polymerase chain reaction (PCR) products or cloned amplicons from the HVS-1 and HVS-2 (hypervariable segment) control region segments. Identifications using mtDNA are time consuming, expensive and can be very complex, depending on the amount and nature of the material being tested. The main goal of this work is to develop a less labour-intensive and less expensive screening method for mtDNA analysis, in order to aid in the exclusion of non-matching samples and as a presumptive test prior to final confirmatory DNA sequencing. We have selected 14 highly discriminatory single nucleotide polymorphisms (SNPs) based on simulations performed by Salas and Amigo (2010) [1] to be typed using SNaPShotTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The assay was validated by typing more than 100 HVS-1/HVS-2 sequenced samples. No differences were observed between the SNP typing and DNA sequencing when results were compared, with the exception of allelic dropouts observed in a few haplotypes. Haplotype diversity simulations were performed using 172 mtDNA sequences representative of the Brazilian population and a score of 0.9794 was obtained when the 14 SNPs were used, showing that the theoretical prediction approach for the selection of highly discriminatory SNPs suggested by Salas and Amigo (2010) [1] was confirmed in the population studied. As the main goal of the work is to develop a screening assay to skip the sequencing of all samples in a particular case, a pair-wise comparison of the sequences was done using the selected SNPs. When both HVS-1/HVS-2 SNPs were used for simulations, at least two differences were observed in 93.2% of the comparisons performed. The assay was validated with casework samples. Results show that the method is straightforward and can be used for exclusionary purposes, saving time and laboratory resources. The assay confirms the theoretic prediction suggested by Salas and Amigo (2010) [1]. All forensic advantages, such as high sensitivity and power of discrimination, as also the disadvantages, such as the occurrence of allele dropouts, are discussed throughout the article. © 2013 Elsevier B.V.

Forensic DNA analysis : issues /

"NCJ-128567."

Utilização de sistema multiplex de marcadores do tipo INDELs em identificação humana por DNA

Os INDELs são polimorfismos de comprimento, gerados a partir de inserções e/ou deleções de um ou mais nucleotídeos. Os marcadores INDELs, que estão amplamente distribuídos pelo genoma e se caracterizam pela alta estabilidade devido à baixa taxa mutacional (10-9), podem ser analisados a partir da amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A facilidade de análise e a possibilidade de construção de sistemas multiplex capazes de gerar amplicons curtos (menores que 100 pb) tornam os INDELs uma importante ferramenta para identificação humana por DNA. Para avaliar a eficiência e validar a metodologia que emprega os polimorfismos de inserção/deleção na identificação humana, utilizamos o sistema Indel-plex ID, capaz de amplificar simultaneamente 38 loci INDELs bialélicos de cromossomos autossomos. Diferentes amostras biológicas (cabelo, saliva, sangue, sêmen e urina) foram genotipadas apresentando reprodutibilidade entre todas as tipagens. A concentração mínima de DNA necessária para amplificação dos 38 loci INDELs foi de 0,5 ng. Artefatos do tipo split peaks foram observados em algumas amostras. Os produtos da PCR foram purificados em resina Sephadex proporcionando melhores condições de análise, redução de artefatos e aumento na intensidade média de fluorescência dos alelos amplificados. A eficiência do sistema Indel-plex ID na amplificação de DNA degradado foi verificada durante as análises das amostras de DNA extraídas de restos mortais (ossos e dentes). Comparativamente ao sistema Identifiler, o Indel-plex ID, se mostrou mais eficiente em termos de número de loci genotipados e qualidade de amplificação. Nas investigações de vínculos genéticos realizadas com o sistema Indel-plex ID foi possível corroborar resultados anteriores obtidos pela análise de marcadores STR. Nas análises com amostras in vivo foram obtidos valores máximos de Probabilidades de Paternidade de 99,99998%. Para casos envolvendo supostos pais falecidos, o sistema Indel-plex ID reforçou resultados obtidos com o sistema Identifiler e Minifiler. A Probabilidade de Paternidade de 99,953%, obtida com o sistema Indel-plex ID, conjugada com a Probabilidade de Paternidade de 99,957%, obtida como o sistema Minifiler, possibilitou um índice final de 99,99998%. Os resultados evidenciaram que os loci INDELs do sistema Indel-plex ID são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco

Aplicação da metodologia de dissociação em alta resolução (HRM) para determinação de perfis genéticos com interesse forense

A genética forense tem grande importância na geração de provas em casos de violência sexual, paternidade criminal, identificação de cadáveres e investigação de evidências de locais de crime. A análise de STRs apresenta grande poder de discriminação, mas é uma metodologia multi-etapas, trabalhosa, cara e em muitos casos a análise genética é prejudicada pela baixa quantidade e qualidade das evidências coletadas. Este estudo teve como objetivo desenvolver e caracterizar uma metodologia de triagem de amostras forenses através da análise de perfis de dissociação em alta resolução (HRM) de regiões do DNA mitocondrial, o qual está presente em maior número de cópias e mais resistente a degradação. Para tanto, foram extraídos DNAs de 68 doadores. Estas amostras foram sequenciadas e analisadas por HRM para sete alvos no DNA mitocondrial. Também foram realizados ensaios para determinar a influência do método de extração, da concentração e nível de degradação do DNA no perfil de HRM obtido para uma amostra. Os resultados demonstraram a capacidade da técnica de excluir indivíduos com sequências diferentes da referência comparativa em cinco regiões amplificadas. Podem ser analisadas em conjunto, amostras de DNA com variação de concentração de até a ordem de 100 vezes e extraídas por diferentes metodologias. Condições de degradação de material genético não prejudicaram a obtenção de perfis de dissociação em alta resolução. A sensibilidade da técnica foi aprimorada com a análise de produtos de amplificação de tamanho reduzido. A fim de otimizar o ensaio foi testada a análise de HRM em reações de PCR duplex. Um dos pares de amplificação forneceu perfis de HRM compatíveis com resultados obtidos de reações com amplificação de apenas um dos alvos. Através da análise conjunta das cinco regiões, esta metodologia visa a identificação de indivíduos não relacionados com as referências comparativas, diminuindo o número de amostras a serem analisadas por STRs, reduzindo gastos e aumentando a eficiência da rotina de laboratórios de genética forense.

Caracterização da distribuição de alelos de loci STR do cromossomo Y com elevada taxa de mutação em uma amostra populacional do Rio de Janeiro

Marcadores genéticos presentes no cromossomo Y, como os microssatélites (Y-STRs) e polimorfismos de único nucleotídeo (Y-SNPs) são utilizados na caracterização de linhagens masculinas, visto que são transmitidos às gerações seguintes sem alterações, a menos que ocorram mutações (Singh et al., 2011; Mitchell & Hammer, 1996; Butler, 2009). Por isso, esses marcadores são amplamente empregados em diversas situações, destacando-se o uso constante dos Y-STRs na genética forense por apresentarem alta capacidade de discriminar linhagens. Recentemente, foram descritos 13 marcadores com taxas de mutação substancialmente superiores àquelas verificadas para loci STR do cromossomo Y, denominados Rapidly Mutating (RM) Y-STRs (Ballantyne et al., 2010; Kayser et al., 2012). Devido às taxas de mutação elevadas, os RM-YSTRs apresentam maior eficiência na discriminação entre indivíduos proximamente relacionados, pertencentes à mesma linhagem patrilínea. O presente trabalho buscou aprofundar o conhecimento acerca das características populacionais e mutacionais dos loci RM-YSTRs em amostra do Rio de Janeiro, contribuindo com estudos desta natureza na população brasileira. Realizou-se a análise de 13 loci do cromossomo Y em 258 indivíduos do sexo masculino, compondo 129 pares de pais e filhos, nascidos no estado do Rio de Janeiro. O DNA das amostras foi extraído, conforme os protocolos vigentes na rotina do LDD-UERJ. As sequências genéticas de interesse foram amplificadas pela técnica de reação em cadeira da polimerase (PCR) através da realização de três PCR multiplex, cujos produtos de amplificação foram separados por eletroforese em sequenciador automático ABI-3500 (Applied Biosystems). Para os pares pai/filho que apresentaram haplótipos mutados, empregou-se a técnica de sequenciamento para confirmação das mutações. Os loci RM-YSTR geraram um poder de discriminação de 1,0 na amostra analisada, o que significa que todos os 129 indivíduos da amostra populacional apresentaram haplótipos diferentes para tais marcadores, com frequências de 0,0077 e diversidade haplotípica igual a 1. Além disso, foram obtidos valores elevados de diversidade gênica para os 13 marcadores. A análise de distância genética e os resultados de AMOVA baseados nos valores de Fst demonstraram que os RM-YSTR não indicam subdivisão populacional e traços ancestrais comuns. Tais valores estão associados às elevadas taxas de mutação encontradas, cuja média foi de 2,11 x 10-2. Foi possível observar que os loci RM-YSTR são muito discriminativos na amostra miscigenada analisada, além de terem maior capacidade de diferenciar indivíduos do que outros conjuntos de marcadores normalmente usados em estudos populacionais e análises forenses. Sendo assim, é possível concluir que os marcadores RM-YSTR são promissores para discriminar indivíduos da mesma linhagem patrilínea, visto que devido às suas elevadas taxas mutacionais e poder de discriminação, são capazes de diferenciar indivíduos de maneira mais eficiente do que os outros conjuntos de STR. Porém, é necessário maior número de estudos para melhor caracterização destes loci em diferentes populações.

Identification of the shark species Rhizoprionodon lalandii and R-porosus (Elasmobranchii, Carcharhinidae) by multiplex PCR and PCR-RFLP techniques

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Results of the GEP-ISFG collaborative study on an X-STR Decaplex

A collaborative work was carried out by the Spanish and Portuguese ISFG Working Group with a PCR multiplex for X chromosome STRs. Markers were selected among those described as polymorphic in humans and that have been used by some laboratories in forensics. Primers and various technical methods were investigated with the aim of optimizing a multiplex for the 10 selected X-STRs. Primer mix stock solutions were sent to the laboratories that were asked to analyse two female bloodstains, taking as reference the genetic profiles from 9947A, 9948 and NA3657 samples. In this work, we report the results obtained by 30 GEP-ISFG laboratories, using this Decaplex, as well as alternative technical conditions that also produced good results. © 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Uso da farmacogenética cardiovascular na análise e prevenção de doenças cardiovasculares e classificação em haplogrupos pelo cromossomo Y e DNA mitocondrial

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

EGHEP-ISFG collaborative exercise on mixture profiles of autosomal STRs (GHEP-MIX01, GHEP-MIX02 and GHEP-MIX03): Results and evaluation

One of the main objectives of the Spanish and Portuguese-Speaking Group of the International Society for Forensic Genetics (GHEP-ISFG) is to promote and contribute to the development and dissemination of scientific knowledge in the area of forensic genetics. Due to this fact, GHEP-ISFG holds different working commissions that are set up to develop activities in scientific aspects of general interest. One of them, the Mixture Commission of GHEP-ISFG, has organized annually, since 2009, a collaborative exercise on analysis and interpretation of autosomal short tandem repeat (STR) mixture profiles. Until now, three exercises have been organized (GHEP-MIX01, GHEP-MIX02 and GHEP-MIX03), with 32, 24 and 17 participant laboratories respectively. The exercise aims to give a general vision by addressing, through the proposal of mock cases, aspects related to the edition of mixture profiles and the statistical treatment. The main conclusions obtained from these exercises may be summarized as follows. Firstly, the data show an increased tendency of the laboratories toward validation of DNA mixture profiles analysis following international recommendations (ISO/IEC 17025: 2005). Secondly, the majority of discrepancies are mainly encountered in stutters positions (53.4%, 96.0% and 74.9%, respectively for the three editions). On the other hand, the results submitted reveal the importance of performing duplicate analysis by using different kits in order to reduce errors as much as possible. Regarding the statistical aspect (GHEP-MIX02 and 03), all participants employed the likelihood ratio (LR) parameter to evaluate the statistical compatibility and the formulas employed were quite similar. When the hypotheses to evaluate the LR value were locked by the coordinators (GHEP-MIX02) the results revealed a minor number of discrepancies that were mainly due to clerical reasons. However, the GHEP-MIX03 exercise allowed the participants to freely come up with their own hypotheses to calculate the LR value. In this situation the laboratories reported several options to explain the mock cases proposed and therefore significant differences between the final LR values were obtained. Complete information concerning the background of the criminal case is a critical aspect in order to select the adequate hypotheses to calculate the LR value. Although this should be a task for the judicial court to decide, it is important for the expert to account for the different possibilities and scenarios, and also offer this expertise to the judge. In addition, continuing education in the analysis and interpretation of mixture DNA profiles may also be a priority for the vast majority of forensic laboratories. (C) 2014 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

Mitochondrial DNA control region diversity in a population from Espirito Santo state, Brazil

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)