Produção, purificação, clonagem e aplicação de enzimas líticas

Lytic enzymes such as beta-1,3 glucanases, proteases and chitinases are able to hydrolyse, respectively, beta-1,3 glucans, mannoproteins and chitin, as well as the cell walls of many yeast species. Lytic enzymes are useful in a great variety of applications including the preparation of protoplasts; the extraction of proteins, enzymes, pigments and functional carbohydrates; pre-treatment for the mechanical rupture of cells; degradation of residual yeast cell mass for the preparation of animal feed; analysis of the yeast cell wall structure and composition; study of the yeast cell wall synthesis and the control of pathogenic fungi. This review presents the most important aspects with respect to lytic enzymes, especially their production, purification, cloning and application.

Estudo da influência de diferentes parâmetros na produção de enzimas líticas

O presente trabalho visou o estudo do efeito de diferentes variáveis na produção de β-1,3 glucanases, proteases e de quitinases pela linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191, em meios de cultivo A, B e C, respectivamente. Foram realizados planejamentos fatoriais 2³, e os fatores estudados foram: pH inicial, temperatura e agitação dos frascos. No planejamento experimental para a produção de β-1,3 glucanase em meio de cultivo A foi verificada maior produção da enzima (0,64 U.mL-1) com pH inicial de 8,5 após 24 horas de fermentação a 33 ºC e 200 rpm. Os parâmetros pH, agitação dos frascos e interação entre todos os parâmetros foram estatisticamente significativos. No planejamento experimental para a produção de protease em meio de cultivo B foi verificada maior produção da enzima (4,25 U.mL-1) com pH inicial de 6,5 após 30 horas de fermentação a 20 ºC e 200 rpm. O pH foi o único parâmetro estatisticamente significativo. No planejamento experimental para a produção de quitinase em meio de cultivo C foi verificada maior produção da enzima (7,06 U.mL-1) com pH inicial de 5,5 após 72 horas de fermentação a 25 ºC e 200 rpm. Todos os parâmetros estudados e suas interações foram estatisticamente significativos. Os coeficientes de determinação, as análises de variância e os teste F demonstraram que os modelos de primeira ordem obtidos foram considerados estatisticamente significativos adotando um nível de confiança de 95%.

Produção de enzimas extracelulares por Crinipellis perniciosa

Isolados de Crinipellis perniciosa, obtidos a partir de cacaueiro (Theobromae cacao), cupuaçuzeiro (T. grandiflorum) e solanáceas silvestres foram testados quanto à capacidade de produzirem enzimas extracelulares que degradam celulose, amido, lipídios e lignina. A produção de todas as enzimas foi determinada em meios sólidos e representada por uma estimativa, baseada na intensidade de cor, ou pela avaliação do diâmetro dos halos formado nos meios. Foi detectada variabilidade entre os isolados na capacidade de produzir enzimas celulolíticas, amilases, lipases, polifenol-oxidases, peroxidases e esterases. Quanto às enzimas proteolíticas, todos os isolados apresentaram alto nível de atividade, não sendo observada diferença no comportamento entre eles. Por outro lado, nenhum dos isolados produziu pectinase, urease e fosfatase-ácida. Os papéis das enzimas líticas produzidas pelos isolados de C. perniciosa na patogênese e na produção de basidiomas são discutidos

Atividade de enzimas associadas ao estado de indução em mudas de cacaueiro expostas a dois actinomicetos residentes de filoplano

Dois antagonistas selecionados para o biocontrole da vassoura-de-bruxa do cacaueiro foram avaliados quanto à capacidade em ativar mecanismos de defesa de plantas contra patógenos. Para tanto, mudas seminais de cacaueiro "comum" foram cultivadas em casa-de-vegetação por 30 dias e expostas aos antagonistas aplicados a mudas de cacaueiro por atomização, individualmente e em associação. O primeiro par de folhas das mudas dos diferentes tratamentos foi coletado aos dois, quatro, 12 e 24 dias após a exposição aos antagonistas. Foi quantificada a atividade de peroxidases, polifenoloxidases, quitinases e beta-1,3-glucanases no material coletado. Observou-se um aumento na atividade de peroxidases e polifenoloxidases nos primeiros dias após a exposição das mudas, especialmente ao isolado Ac26. Não foi observado efeito aditivo ou sinergístico nas mudas expostas aos dois isolados simultaneamente.

Isolamento e regeneração de protoplastos de Magnaporthe grisea

Protoplastos são ferramentas biológicas importantes para pesquisas em fungos filamentosos, sendo empregados intensamente em transformação genética. O isolamento de protoplastos de Magnaporthe grisea foi facilitado com Novozym 234, contudo, este complexo enzimático encontra-se indisponível no mercado. Assim, objetivou-se comparar a eficiência de enzimas líticas disponíveis comercialmente na obtenção de protoplastos de M. grisea. Paralelamente, analisaram-se estabilizadores osmóticos, tempos de digestão e freqüência de regeneração. Maior produção de protoplastos foi obtida com o uso simultâneo de Lysing Enzymes e Cellulase Onozuka R-10. O uso de 10 ou 15 mg de cada complexo enzimático, em 3 mL de estabilizador osmótico, resultou em maior liberação de protoplastos. O melhor estabilizador osmótico foi MgSO4 1,2 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8, seguido por MgSO4 0,8 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8. O isolamento de protoplastos foi monitorado a cada 60 minutos, atingindo o máximo após incubação por 3 a 6 horas. No entanto, maior freqüência de regeneração (19,4%) foi registrada para protoplastos obtidos após 3 horas de hidrólise enzimática.

Imunoexpressão de fatores reguladores da osteoclastogênese na doença periodontal em humanos e sua relação com os parâmetros clínicos

Periodontal disease is an infection initiated by oral periodontal pathogens that trigger an immune response culminating in tissue destruction. This destruction is mediated by the host by inducing the production and activation of lytic enzymes, cytokines and the stimulation of osteoclastogenesis. The aim of this study was to compare the immunohistochemical expression of factors involved in bone resorption, RANKL (Ligand Receptor Activator of Nuclear Factor kappa B), OPG (Osteoprotegerin) and TNF-α (tumor necrosis factor alpha) between the gingival healthy, gingivitis and chronic periodontitis and correlate them with clinical parameters. The sample consisted of 83 cases and 12 clinically healthy gums, 42 gingivitis and 29 periodontitis, from 74 adolescent and adult patients with a mean age of 35 years, without systemic changes and non-smokers, predominantly female and race brown. There was no statistically significant difference for the expression of anti-RANKL (p = 0.581) and RANKL / OPG ratio (p = 0.334) when comparing the three conditions, but the anti-OPG and anti-TNF-α showed statistically significant between the types of injury (p = 0.001 and p <0.001, respectively), showing greatest expression in periodontitis. In cases of periodontitis, the variable clinical attachment loss (PIC) was statistically significant and positive correlation, respectively, with immunostaining of anti-RANKL (p = 0.002, p = 0.001 and r = 0.642), anti-OPG (p = 0.018, p = 0.014 and r = 0.451), anti-TNF-α (p = 0.032, p = 0.014 and r = 0.453) and the percentage ratio of RANKL / OPG (p = 0.018, p = 0.002 and r = 0.544). The tooth mobility (MB) showed a statistically significant difference only with immunohistochemical anti-RANKL (p = 0.026), and probing depth (PD) was positively correlated with anti-RANKL (p = 0.028 and r = 0.409), both in cases of periodontitis. Only in cases of gingivitis TNF-α was positively correlated with RANKL (p = 0.012 and r = 0.384) and the RANKL / OPG ratio (p = 0.027 and r = 0.341). Given these results, we conclude that the greatest expression of TNF-α in periodontitis demonstrates a relationship with the progression and severity of periodontal disease and the correlation between all antibodies and clinical attachment loss demonstrates their involvement in periodontal bone resorption

Resveratrol na apoptose e produção de superóxido em neutrófilos de cães

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Caracterização preliminar de bacteriocinas produzidas por seis cepas de bactérias láticas isoladas de produtos cárneos embalados a vácuo

No presente trabalho, foram estudadas as bacteriocinas produzidas por seis linhagens bacterianas: duas culturas Lactobacillus sake, duas de Lactobacillus curvatus, uma de Leuconostoc mesenteroides, uma de Leuconostoc sp 12. As atividades inibitórias foram quantificadas pelo método da diluição crítica, utilizando-se os indicadores Lactobacillus sake ATCC 15521 e Listeria monocytogenes. As bacteriocinas produzidas foram caracterizadas também quanto à sensibilidade a enzimas, faixa de temperatura na produção, termoestabilidade, estabilidade em diferentes pHs e modo de ação (bactericida ou bacteriostático) frente a Listeria monocytogenes. Nenhuma bacteriocina foi destruída pela pepsina, mas todas foram sensíveis à proteinase K, tripsina e alfa-amilase (exceto a bacteriocina produzida por Leuconostoc sp 12, que foi insensível a alfa-amilase). Lactobacillus sake 1, Leuconostoc mesenteroides 11 e Lactobacillus sake 16 apresentaram atividade antilisterial, sendo a maior inibição observada para Lactobacillus sake 1 e Leuconostoc mesenteroides 11 (12.800UA/mL). Lactobacillus sake 1 e Lactobacillus curvatus 5 produziram as bacteriocinas mais termoestáveis. Lactobacillus sake 1 produziu a bacteriocina com maior estabilidade a variações de pH. Todas as bactérias láticas produziram bacteriocina entre 4ºC e 30ºC, sendo esta propriedade muito interessante para futuras aplicações em produtos cárneos refrigerados.

Efeito do uso de enzimas proteolíticas na maturação de queijo Prato com teor reduzido de gordura

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Efeito de enzimas proteolíticas, de origem vegetal e microbiana, e da temperatura de maturação nas características de queijo Prato com teor reduzido de gordura

Pós-graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos - IBILCE

Glutationa e enzimas relacionadas: papel biológico e importância em processos patológicos

Glutathione (GSH) and related enzymes are pivotal for the normal functioning of several important biological processes. In this review we discuss the biosynthesis and the catalytic cycles of glutathione as well as the major GSH-related enzymes. We also present how glutathione and enzymes are involved in cancer and the chromatographic and non-chromatographic methods used to analyze glutathione and/or its derivatives.

Iogurte simbiótico de açaí (Euterpe edulis Mart.): caracterização físico-química e viabilidade de bactérias láticas e probióticas

Os iogurtes simbióticos, que combinam microrganismos probióticos e substâncias prebióticas, adicionados de polpa de frutas são uma tendência crescente no mercado. O fruto açaí (Euterpe edulis) se destaca pela presença de compostos bioativos, como as antocianinas. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar e avaliar os parâmetros físico-químicos e a viabilidade microbiológica de iogurte simbiótico de açaí enriquecido com inulina e adicionado de cultura probiótica de Bifidobacterium animallis subsp. lactis BB-12. As formulações de iogurte atenderam aos requisitos físico-químicos exigidos pela IN no 46/2007 do MAPA apresentando teor de cinzas de 0,86 % ± 0,10, extrato seco total de 23,18 % ± 2,59, teor de gordura de 4,16 % ± 0,31, acidez de 0,70 % ± 0,05 e pH de 4,45 ± 0,10. Entre as formulações o conteúdo fenólico total variou de 18,17 a 117,84 mg de AGE/100 g, teor de antocianinas de 1,92 a 47,88 mg/100 g e atividade antioxidante de 0,71 a 6,95 μmol Trolox/g, observando-se um aumento de acordo com o aumento do teor de polpa de açaí adicionada. Ao final de 28 dias de armazenamento a 5 °C, observou-se uma redução no teor de antocianinas e da atividade antioxidante. Verificou-se a contribuição positiva da polpa de açaí na viabilidade das bactérias láticas totais, cujas contagens variaram de 4,56 a 7,04 log UFC.g-1 e de B. lactis BB-12 que variou de 3,17 a 6,34 log UFC.g-1, favorecendo a multiplicação dessas bactérias nos iogurtes. Nas formulações com 20 e 25 % de polpa de açaí as contagens das bactérias láticas totais e probiótica mantiveram-se viáveis de acordo com a IN no 46/2007 do MAPA e a Lista de Alegação de Propriedade Funcional (Anvisa), durante os 28 dias de armazenamento a 5 oC. Concluiu-se que a adição de polpa de açaí E. edulis, inulina e B. lactis BB-12 foi tecnologicamente viável na elaboração de iogurte simbiótico de açaí, sendo uma excelente alternativa de diversificação do produto no mercado.

Efeito de extratos proteicos de amendoim sobre o desenvolvimento, a capacidade infectiva e atividade de enzimas proteolíticas de Meloidogyne enterolobii

No Brasil, Meloidogyne enterolobii vem causando perdas significativas na produção de goiabeiras e, no submédio do Vale do São Francisco, por exemplo, o impacto negativo decorrente da infecção e morte de goiabeiras tem refletido diretamente na qualidade de vida dos agricultores. Até o momento, não existem métodos de controle efetivos: os nematicidas avaliados experimentalmente não têm sido eficientes e não há produtos registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento para aplicação em goiabeiras. Assim, há necessidade de realizar pesquisa básica nesta área. A prospecção de proteínas relacionadas com a resistência em espécies resistentes pode ser uma alternativa para o desenvolvimento de medidas para seu controle. Para isso, foram realizados ensaios biológicos de toxicidade para a análise do efeito de extratos proteicos de amendoim sobre o desenvolvimento, a capacidade infectiva e atividade de enzimas proteolíticas de M. enterolobii visando à identificação de proteínas com potencial para controle desse nematoide. Os resultados obtidos indicaram que o extrato proteico total de amostras de raízes de plantas de amendoim inoculadas não tem efeito sobre as três características supracitadas. Sendo assim, são necessários estudos dessa natureza com outras espécies resistentes ao patógeno visando à identificação de proteínas que apresentem potencial para o seu controle.

Avaliação do desempenho do método do ensaio por enzimas imuno-adsorvidas (ELISA) em leite em pó reconstituído contaminado experimentalmente com aflatoxina M1

O desempenho do ensaio por enzimas imuno-adsorvidas (ELISA), mediante o emprego de conjuntos de reativos produzidos em escala comercial, para determinação de aflatoxina, foi avaliado em condições experimentais, através de análises repetidas, em amostras de leite em pó reconstituído contaminadas com concentrações conhecidas da fração M1 da toxina. Para os níveis de 0,10; 0,20; 0,50; e, 1,00 ng/ml, os percentuais de recuperação foram: 83,0%; 87,5%; 103,0%; e, 111,8%, respectivamente. O desvio-padrão relativo, para as referidas concentrações, foi, respectivamente, 65,5%; 31,8%; 10,9% e 13,6% (n=10, para cada nível de contaminação). Os resultados obtidos demonstram que o método é apropriado para pesquisas e levantamentos sobre a ocorrência de aflatoxina M1 em leite, sobretudo nas faixas de concentração entre 0,20 - 1,00 ng/ml.

Alteração de enzimas hepáticas em trabalhadores de refinaria de petróleo

OBJETIVO: A exposição ocupacional típica de uma refinaria de petróleo pode alterar a função hepática de seus trabalhadores. Assim, o objetivo do estudo foi identificar fatores de risco de alterações em enzimas hepáticas em trabalhadores de uma refinaria de petróleo. MÉTODOS: Os trabalhadores de uma refinaria de petróleo, localizada em São Francisco do Conde, Estado da Bahia, eram submetidos a exames periódicos anuais de 1982 a1998. O estudo caso-controle investigou todos os 150 casos de indivíduos com alteração simultânea de gama-glutamil transferase e de alanino amino transferase, de pelo menos 10% acima do valor de referência. Como controles, foram selecionados 150 indivíduos sem quaisquer alterações de enzimas hepáticas ou de bilirrubinas, desde a sua admissão. Foram calculadas as razões de chance e respectivos intervalos de confiança de 95% a partir de modelos de regressão logística. RESULTADOS: Em todos os setores de produção, o risco de alteração de enzimas hepáticas foi significantemente mais elevado do que no setor administrativo (RC=5,7; IC 95%: 1,7-18,4), estando controlados os efeitos do álcool, obesidade e antecedentes médicos de hepatite. No período 1992-1994 foram registrados 89 casos, 88 deles provieram dos diversos setores da produção. CONCLUSÕES: A exposição ocupacional desempenha papel importante na determinação de alterações de enzimas hepáticas em trabalhadores do refino de petróleo, além dos fatores de risco eminentemente biológicos e/ou comportamentais como obesidade e o consumo de álcool.