INTESTINAL AND PULMONARY INFECTION BY Cryptosporidium parvum IN TWO PATIENTS WITH HIV/AIDS

We describe two patients with HIV/AIDS who presented pulmonary and intestinal infection caused by Cryptosporidium parvum, with a fatal outcome. The lack of available description of changes in clinical signs and radiographic characteristics of this disease when it is located in the extra-intestinal region causes low prevalence of early diagnosis and a subsequent lack of treatment.

Infecção por Cryptosporidium parvum: resposta imunitária e tecnologia de anticorpos monoclonais para o diagnóstico

Cryptosporidium parvum é um protozoário intracelular, de distribuição ubiquitária, que causa enterite em humanos e animais. A diarreia é autolimitada em indivíduos imunocompetentes, podendo ser fatal em imunocomprometidos. Actualmente não existem terapêuticas específicas ou preventivas disponíveis, e o elevado custo dos actuais métodos de diagnóstico, sustentam a importância do desenvolvimento de novas abordagens. Vários estudos salientam a importância das células T CD4+ na resposta imunitária à infecção por C. parvum; outros direccionam a sua atenção para as células reguladoras (Treg); e outros tentam esclarecer qual o papel das citocinas específicas produzidas pelas células Th1 e Th2, na regulação da resposta imune, acompanhada pela produção de imunoglobulinas particulares. Na área do diagnóstico, vários e diferentes métodos têm sido utilizados, variando entre a rapidez de execução, especificidade e custo. Várias questões colocam-se, relacionadas com as características das células envolvidas na resposta à infecção e com a especificidade/sensibilidade de cada técnica. Com o objectivo de estudar a resposta imunitária de longo-termo à infecção por C. parvum, no modelo animal imunocompetente, murganhos Balb/c foram inoculados por via oral com oocistos de C. parvum, e efectivadas colheitas e análise de amostras fecais, intestino, sangue e baço, segundo um protocolo previamente definido. A caracterização das populações celulares do sangue e baço foi feita por citometria de fluxo e a identificação e quantificação de imunoglobulinas e citocinas no soro, por tecnologia xMAP® Luminex. A análise por citometria de fluxo não revelou diferenças estatisticamente significativas entre os murganhos infectados e os controlos, tendo sido apenas observado um aumento do número de neutrófilos e eosinófilos circulantes, e a sua posterior diminuição, no primeiro grupo de murganhos. Associada à elevada variabilidade observada após a reinfecção, tais variações são sugeridas como sendo o perfil exibido por estas populações de células no contexto de infecção por C. parvum no organismo imunocompetente, particularmente os eosinófilos, que apresentam um comportamento idêntico em infecção por outros parasitas. O aumento da secreção de TNF-α e IFN-γ (citocinas Th1) nos murganhos infectados, comparativamente com os grupos controlo, para além da secreção de citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e IL-10, após a reinfecção, sugere um balanço entre as respostas Th1, para controlar o crescimento do parasita, e Th2, para limitar a patologia. A IgG1 foi o isotipo predominante ao longo de toda a infecção e reinfecção, tendo-se observado um pico de IgG2a após a reinfecção, seguido de diminuição. Esta variação poderá estar relacionada com a função da IgG1 e da IgG2a, ao nível da opsonização e neutralização dos agentes patogénicos, respectivamente. A obtenção de hibridomas secretores de anticorpos específicos para antigénios de C. parvum, por fusão celular, permitiu obter anticorpos e testar a sua aplicação à detecção de oocistos de C. parvum, em amostras fecais humanas e de animais (bovinos). Em resumo, os resultados obtidos permitem sugerir o perfil de imunoglobulinas e citocinas envolvido na resposta à infecção por C. parvum no modelo roedor imunocompetente, assim como desenvolver um futuro “kit” para detecção de C. parvum em amostras biológicas, por técnicas de imunofluorescência

Infection by Cryptosporidium parvum in renal patients submitted to renal transplant or hemodialysis

The frequency of infection by Cryptosporidium parvum was determined in two groups of renal patients submitted to immunosuppression. One group consisted of 23 renal transplanted individuals, and the other consisted of 32 patients with chronic renal insufficiency, periodically submitted to hemodialysis. A third group of 27 patients with systemic arterial hypertension, not immunosuppressed, was used as control. During a period of 18 months all the patients were submitted to faecal examination to detect C. parvum oocysts, for a total of 1 to 6 tests per patient. The results showed frequencies of C. parvum infection of 34.8%, 25% and 17.4%, respectively, for the renal transplanted group, the patients submitted to hemodialysis and the control group. Statistical analysis showed no significant differences among the three groups even though the frequency of C. parvum infection was higher in the transplanted group. However, when the number of fecal samples containing C. parvum oocysts was taken in account, a significantly higher frequency was found in the renal transplanted group.

Prevalência do Cryptosporidium parvum em crianças abaixo de 5 anos, residentes na zona urbana de Campo Grande, MS, Brasil, 1996

O presente estudo visou estabelecer a prevalência de Cryptosporidium parvum em crianças abaixo de 5 anos, residentes na zona urbana de Campo Grande, MS, 1996/97, através de exames coprológicos e avaliar epidemiologicamente os casos diagnosticados. Tratou-se de um estudo transversal com inquérito domiciliar, onde foram examinadas 1051 amostras fecais, processadas segundo a técnica de Blagg, utilizando-se a coloração de Ziehl-Neelsen modificada para a pesquisa de oocistos de C. parvum. Concluiu-se que: a prevalência de C. parvum (1,1%) observada não foi estatisticamente significativa; foi relatado diarréia em 58,3% das crianças com diagnóstico positivo, supondo-se associação entre diarréia e a presença do parasita; o C. parvum foi mais freqüente em crianças com idade de 25 a 36 meses (50%), porém sem diferença estatisticamente significativa; o sexo não teve papel diferencial em relação ao parasitismo por C. parvum; entre as 12 crianças com criptosporidiose, 83,3% tiveram contato com animais domésticos (cão e ou gato).

Comparação entre os métodos de Ziehl-Neelsen modificado e Acid-Fast-Trichrome para a pesquisa fecal de Cryptosporidium parvum e Isospora belli

Devido a crescente importância dos coccídios intestinais (Cryptosporidium, Isospora e Cyclospora) como parasitos oportunistas, é fundamental para os laboratórios diferenciar morfologicamente estes protozoários; a técnica de Ziehl-Neelsen modificada (ZNm) é amplamente utilizada para este fim; recentemente, foi proposto um novo procedimento, a coloração combinada do ácido tricrômico (Acid-Fast-Trichrome - AFT). O objetivo do presente estudo foi comparar os processos AFT e ZNm para a detecção destes coccídios em amostras fecais de pacientes portadores do vírus VIH. Foram selecionados dois grupos de indivíduos, para inclusão no estudo, segundo a presença (n=60) ou ausência de diarréia (n=60). As amostras de fezes foram coletadas em solução de formalina 10% e os esfregaços fecais preparados i) diretamente das fezes e ii) após concentração prévia a 500xg (10 minutos), foram submetidos aos diferentes processos de coloração. Considerando-se a positividade por técnica (AFT e ZNm), verificou-se a superioridade do procedimento de ZNm (n=19; 100% dos casos positivos) sobre o de AFT (n=8; 42,1%). Ambos possibilitaram a identificação dos 101 casos verdadeiramente negativos. Coccidiose intestinal foi mais frequente entre os pacientes que apresentaram diarréia (26,6%) em comparação à positividade observada entre os indíviduos assintomáticos (5%) sendo que C. cayetanensis não foi detectada em ambos os grupos. Foi de nosso interesse avaliar a aplicabilidade da técnica AFT para a coloração deste protozoário. Devido à sensibilidade e especificidade obtida neste estudo (100%), conclui-se que o método de ZNm continua sendo o mais indicado para o diagnóstico da criptosporidiose e isosporose, principalmente quando associado ao procedimento de centrífugo-concentração (500xg, 10 minutos). Embora a coloração AFT tenha baixo custo, faz-se necessário o seu aperfeiçoamento pois este procedimento permite o diagnóstico simultâneo dos coccídios intestinais (C. parvum, I. belli e C. cayetanensis) e dos microsporídios.

A Study of Cryptosporidium parvum Genotypes and Population Structure

Genetic evidence for the occurrence of two Cryptosporidium parvum subgroups is presented. This evidence is based on restriction fragment length polymorphism analysis of several independent loci. Sequence analysis of the b -tubulin intron revealed additional polymorphism. The stability of the genetic profiles following passage of C. parvum isolates between different hosts was investigated.

Ultrastructural Details of Cryptosporidium parvum Development in Calf Intestine

Cryptosporidium parvum and C. muris appear to be different species found in calves, with different oocysts size and distribution on the gastrointestinal tract. This work presents new images of C. parvum ultrastructure in calf intestine, mainly its development in nonmicrovillous cells and the presence of microtubular structures in the membrane enveloping the macrogamonts and immature oocysts.

Antigen incorporation on Cryptosporidium parvum oocyst walls

Cryptosporidium parvum oocysts are the infective stages responsible for transmission and survival of the organism in the environment. In the present work we show that the oocyst wall, far from being a static structure, is able to incorporate antigens by a mechanism involving vesicle fusion with the wall, and the incorporation of the antigen to the outer oocyst wall. Using immunoelectron microscopy we show that the antigen recognized by a monoclonal antibody used for diagnosis of cryptosporidiosis (Merifluor®, Meridian Diagnostic Inc.) could be found associated with vesicles in the space between the sporozoites and the oocysts wall, and incorporated to the outer oocyst wall by an unknown mechanism.

More productive in vitro culture of Cryptosporidium parvum for better study of the intra- and extracellular phases

The great difficulties in treating people and animals suffering from cryptosporidiosis have prompted the development of in vitro experimental models. Due to the models of in vitro culture, new extracellular stages of Cryptosporidium have been demonstrated. The development of these extracellular phases depends on the technique of in vitro culture and on the species and genotype of Cryptosporidium used. Here, we undertake the molecular characterization by polymerase chain reaction-restriction fragment lenght polymorphism of different Cryptosporidium isolates from calves, concluding that all are C. parvum of cattle genotype, although differing in the nucleotide at positions 472 and 498. Using these parasites, modified the in vitro culture technique for HCT-8 cells achieving greater multiplication of parasites. The HCT-8 cell cultures, for which the culture had not been renewed in seven days, were infected with C. parvum sporozoites in RPMI-1640 medium with 10% IFBS, CaCl2 and MgCl2 1 mM at pH 7.2. Percentages of cell parasitism were increased with respect to control cultures (71% at 48 h vs 14.5%), even after two weeks (47% vs 1.9%). Also, the percentage of extracellular stages augmented (25.3% vs 1.1% at 96 h). This new model of in vitro culture of C. parvum will enable easier study of the developmental phases of C. parvum in performing new chemotherapeutic assays.

Influence of colostrum deprivation and concurrent Cryptosporidium parvum infection on the colonization and persistence of Escherichia coli O157:H7 in young lambs

Escherichia coli O157: H7 and Cryptosporidium parvum infections of man have been associated with direct contact with small ruminants. Colostrum protects neonates against gastrointestinal pathogens, and orphan lambs, which are common on petting farms, may be deprived of this protection. In a recent study, it was demonstrated that high shedding of E coli O157 : H7 by an 8-week-old goat kid was associated with coincidental C. parvum infection. Furthermore, both pathogens were co-located in the distal gastrointestinal tract. It was hypothesized that colostrum deprivation and pre-infection with C. parvum predisposed young ruminants to colonization and increased shedding of E coli O157: H7. To test this, 21 lambs 5 weeks of age were divided into four groups as follows: (A) colostrum-deprived and inoculated with E coli O157: H7, (B) colostrum-deprived and inoculated with C. parvum and then E coli O157: H7, (C) conventionally reared and inoculated with E coli O157: H7, (D) conventionally reared and inoculated with C. parvum and then E coli O15 7: H7. C. parvum was detected between 8 and 12 days post-inoculation in most of the infected lambs. At 24 h post-inoculation with E coli O157: H7, all lambs were shedding between 5 x 10(4) and 5 x 10(7) c.f.u. E coli O157: H7 per gram of faeces. E coli O157: H7 was shed in higher numbers in the groups pre-inoculated with C. parvum, whether conventionally reared or colostrum-deprived. Interestingly, for the colostrum-deprived lambs on day 3, a significant difference in shedding of E coli O157: H7 was observed (P= 0-038), with the lambs inoculated with E coli alone yielding higher counts than those pre-inoculated with C. parvum. From day 15 onwards, shedding of E coli O157: H7 was highest from the colostrum-deprived C. parvum-infected lambs, then (in descending order of shedding) the colostrum-deprived lambs, the conventionally reared lambs infected with C. parvum, and the conventionally reared animals. In total, four animals were euthanized, two at 24 h and two at 96 h post inoculation with E coli 0 157: H7 (two conventionally reared and two colostrum-deprived). All animals euthanized were from groups pre-inoculated with C. parvum prior to challenge with E coli O157 : H7. On examination of tissues, in three of the four animals examined, multifocal attaching and effacing lesions were observed in the caecum, colon, rectum and at the recto-anal junction, and were confirmed by immunolhistochemistry to be associated with E coli O157: H7.

Detection of Cryptosporidium parvum oocysts in calf fecal samples by direct immunofluorescence assay

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Natural infection with zoonotic subtype of Cryptosporidium parvum in Capybara (Hydrochoerus hydrochaeris) from Brazil

A total of 145 capybara (Hydrochoerus hydrochaeris) fecal samples from the state of Sdo Paulo, Brazil, were screened for Cryptosporidium spp. oocysts using the malachite green method. Eight samples (5.52%) showed positive results and were further submitted to nested PCR reaction for amplification of fragments of 18S rRNA gene and 60-kDa glycoprotein gene for determination of species, alleles and subtypes of Cryptosporidium. Sequencing of the PCR products of the 18S rRNA gene fragments and 60-kDa glycoprotein gene fragments showed that for both genes all Cryptosporidium isolates from capybara were respectively 100% genetically similar to a bovine isolate of C. parvum and to C parvum subtype IIaA15G2R1. To the best of our knowledge this is the first report of Cryptosporidium infection in this rodent. The finding of zoonotic C parvum infection in a semi-aquatic mammal that inhabits anthroponotic habitats raises the concern that human water supplies may be contaminated with zoonotic Cryptosporidium oocysts from wildlife. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Real-time PCR assay targeting the actin gene for the detection of Cryptosporidium parvum in calf fecal samples

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)