Rôle des cellules T CD8+ dans la pathogenèse de l'hépatite auto-immune : développement d'un modèle murin transgénique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle des cellules T CD8+ dans la pathogenèse de l'hépatite auto-immune : développement d'un modèle murin transgénique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Exploration fonctionnelle des réponses cellulaires T CD4+ et CD8+ dans l’infection par le VIH-1

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1.

Études sur la dérégulation des cytokines et des cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH-1

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1.

Transcriptional regulation of effector CD8+ T cell differentiation and molecular dysfunction during HIV-1 infection

Les cellules T CD8+ jouent un rôle primordial dans le contrôle des infections virales en limitant la dissémination des cellules infectées. Lors de l’infection chronique par le virus HIV, les cellules T CD8+ HIV-spécifiques ne se différencient pas en cellules effectrices fonctionnelles capables de tuer les cellules infectées par le virus ; ces cellules ne sont plus capables de proliférer ou de produire l’ IL-2. Ces cellules expriment PD-1 et l’engagement de PD-1, par son ligand, aboutit a plusieurs de ces déficits fonctionnels des cellules T . Le rôle de PD-1 dans la régulation d'évènements transcriptionnels contrôlant la différentiation et l'obtention des fonction effectrices des cellules T CD8+ reste à démontrer. Id2 joue un rôle central dans la différenciation des cellules T CD8+ effectrices. Nous avons émis l’hypothèse que le défaut de maturation observé chez les cellules T CD8+ PD-1 high HIV-spécifiques (CD8+PD-1hi) au cours de l’infection chronique par le virus HIV pouvait être lié à la diminution d’expression du régulateur Id2. Nous avons ainsi démontré que l'engagement de PD-1 contribuait à une diminution d'expression de Id2 et de ses cibles transcriptionnelles. La surexpression de Id2 de ces cellules a permis de restaurer l'expression de marqueurs tels que Granzyme B et Bcl-2 et diminuir l’expression du marqueur de maturation de CD27. La famille des cytokines à chaine gamma joue un rôle clef dans la survie et l’homéostasie des cellules T. Dans ce travail, nous avons démontré que l’IL-15 était unique grâce à ses capacités de stimulation de l’expression d’Id2 et ses propriétés favorisant la survie ainsi que la différenciation des cellules T CD8+ effectrices. l’IL-15 induit la prolifération de toutes les populations de cellules T mémoires provenant de donneurs sains. L’addition de cette cytokine aux sous-populations cellulaires Ttm et Tem a permis leur différenciation en cellules effectrices capables de produire Granzyme B alors que la stimulation par l’IL-15 des cellules Tcm ne favorise pas leur différenciation. Un test de cytotoxicitié par cytométrie en flux nous a permis de confirmer que la stimulation de cellules T CD8+ HIV spécifiques par l’IL-15 favorisait l’expression de Id2 et restaurait les fonctions cytotoxiques des cellules T CD8+ HIV spécifiques. En conclusion, nous avons pour la première fois dans cette thèse défini les mécanismes moléculaires impliqués dans la modulation de l’expression du régulateur transcriptionnel Id2 par l’IL-15. Nous avons également révélé comment l’engagement de PD-1 conduisait a une altération de l’expression et de la fonction d’Id2 et favorisait la diminution des fonctions effectrices des cellules T CD8-HIV spécifiques. Une perspective de traitement avec des agents tels que l’IL-15 ou le bloquage de PD-1, en combinaison avec les traitements conventionnels, pourrait contribuer à une meilleure stimulation des réponses immunes favorisant ainsi la réactivation des cellules T CD8+ et permettant la destruction de cellules T CD4+ infectées de manière latente.

Expression des SOCS-1 et SOCS-3 par les lymphocytes T humains en réponse à des cytokines immuno-modulatrices

Les cytokines jouent un rôle fondamental dans la régulation des processus biologiques via la cascade de signalisation JAK-STAT. Les « Suppressors of Cytokine Signalling » (SOCS), protéines intracellulaires, inhibent la voie JAK-STAT. Plusieurs études supportent leur implication dans des maladies immunitaires, mais peu d’informations sont disponibles sur leur expression par les lymphocytes T humains. Nous postulons que les cytokines Interféron-β(IFN-β) et Interleukine-27 (IL-27), dotées d’un potentiel immuno-régulateur, ont des rôles bénéfiques via l’induction des SOCS. L’impact de l’IFN-β et l’IL-27 sur l’expression des SOCS-1 et SOCS-3 par des cellules T CD8 et CD4 humaines a été étudié en utilisant des cellules sanguines de donneurs sains. L’expression de ces régulateurs a été évaluée aux niveaux de l’ARNm par qRT-PCR et protéique par immunocytochimie. Les SOCS-1 et SOCS-3 ont été rapidement induits en ARNm dans les deux types cellulaires en réponse à l’IFN-β ou l’IL-27 et une augmentation de l’expression a été confirmée au niveau protéique. Afin de mimer les thérapies à base d’IFN-β, les cellules T ont été exposées chroniquement à l’IFN-β. Après chaque ajout de cytokine les cellules T ont augmenté l’expression du SOCS-1, sans moduler le SOCS-3. L’IL-27 a induit les SOCS-1 et SOCS-3 préférentiellement dans les cellules T CD8 ; ceci corrèle avec des résultats du laboratoire démontrant une plus petite expression des récepteurs à l’IL-27 par les lymphocytes T CD4 que les CD8. Notre projet a permis d’élucider l’expression des SOCS dans deux populations de cellules T et de clarifier les mécanismes d’actions de l’IFN-β et l’IL-27.

L’influence du réseau de chimiokines sur les lymphocytes T dans le contexte de l’infection à virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)

Les chimiokines et leurs récepteurs respectifs jouent un rôle important dans l’immunité innée et adaptative. Les récepteurs de chimiokines identifient des cellules T CD4+ avec potentiel de migration dans des tissus spécifiques et à fonctionnalité distincte du point de vue de la spécificité antigénique et de la production de cytokines. L’identité de la population des cellules T CD4+ susceptibles versus résistantes à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste mal définie. Le recrutement dans les muqueuses intestinales d’un excès de cellules T effectrices (CD8+) comparé aux cellules cibles (CD4+) représente un bon pronostic de l’infection par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS), tandis que la déplétion des cellules Th17 dans les tissus lymphoïdes associés au tractus gastro-intestinal (GALT) est un marqueur de la progression de l’infection à VIH. L’effet régulateur des chimiokines sur l’activation de la réplication virale dans différentes sous-populations cellulaires T CD4+ reste peu étudié. Ce projet de maîtrise est divisé en 3 parties: (1) l’identification des récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 comme marqueurs de surfaces des sous populations T CD4+ avec susceptibilité distincte à l’infection par le VIH; (2) la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ et T CD8+ spécifiques au VIH de sujets à progression lente vers le stade sida (LTNP); et (3) les effets des chimiokines ligands de CCR4, CXCR3 et CCR6 sur l’activation cellulaire et la réplication virale in vitro. Nos résultats démontrent que les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ (profile cytokinique Th17) et CXCR3+CCR6+ (profile cytokinique Th1/Th17) sont hautement permissives à l’infection par le VIH. Nous proposons également de nouveaux corrélats de protection immunitaire contre le VIH chez les sujets LTNP: (i) le potentiel de co-localisation dans les muqueuses intestinales des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH via l’intégrine β7, (ii) le ratio élevé entre les cellules T effectrices (CD8+) versus les cellules cibles (CD4+) spécifiques au VIH, (iii) le profil cytokinique Th17 et (iv) la capacité des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH à produire des ligands de CCR5 bloquant l’entrée virale. Finalement, nos résultats sur l’effet co-stimulateur des chimiokines sur les cellules T et leurs effets opposés sur la réplication virale démontrent l’implication du réseau des chimiokines dans la régulation de la pathogenèse de l’infection à VIH.

Pathogenèse de l’hépatite autoimmune : influence des gènes, du sexe, de l’âge et de l’environnement

L’hépatite autoimmune (HAI) résulte d’une perte de tolérance du système immunitaire envers des antigènes de l’hépatocyte. Elle peut se présenter sous forme d’hépatite aiguë, parfois fulminante, ou comme une maladie chronique menant progressivement à une cirrhose hépatique. En absence de traitement, cette maladie est fatale. La pathogenèse de l’HAI et les mécanismes responsables de sa progression restent inconnus à ce jour. L’objectif global de ce projet est d’examiner les facteurs prédisposants et les mécanismes immunologiques responsables de l’apparition et de la progression de l’HAI. Pour permettre l’étude de la pathogenèse de l’HAI, nous avons développé un modèle murin expérimental d’hépatite autoimmune de type 2. Celui-ci est basé sur la xénoimmunisation de souris C57BL/6 avec les deux antigènes ciblés dans l’HAI de type 2 chez l’homme (CYP2D6 et FTCD). Par mimétisme moléculaire, le système immunitaire de ces souris réagit contre les protéines murines homologues et une HAI s’ensuit. Ce modèle expérimental présente la plupart des caractéristiques histologiques, biochimiques et sérologiques d’une HAI de type 2. Les souris développent une inflammation autoimmune chronique avec présence d’hépatite d’interface et d’infiltrations intralobulaires, un infiltrat composé majoritairement de lymphocytes T CD4+ mais aussi de lymphocytes T CD8+ et B, d’une élévation des ALT sériques, des niveaux d’immunoglobulines G circulantes augmentés ainsi que d’autoanticorps anti-LKM1 et anti-LC1. L’étude de l’influence du bagage génétique a permis de définir l’importance relative des gènes du CMH et des gènes non-CMH sur le développement d’une HAI. Les gènes du locus CMH sont essentiels mais insuffisants pour mener au développement d’une HAI et donc, la susceptibilité génétique à l’HAI est comme chez l’homme, multigénique. Les patients atteints d’HAI de type 2 sont généralement des jeunes filles. L’étude des influences de l’âge et du sexe dans ce modèle a permis de montrer que les souris femelles avant et au début de leur maturité sexuelle sont plus susceptibles au développement d’une HAI de type 2. De plus, les femelles ont un nombre réduit de lymphocytes T régulateurs, ce qui leur confère une susceptibilité accrue comparé aux mâles. L’ensemble de ces travaux nous a conduits à proposer un mécanisme où le développement d’une HAI chez les femelles d’un âge particulier résulterait de l’activation de cellules T CD4+ autoréactives ayant échappé aux mécanismes de tolérance centrale, via un mécanisme de mimétisme moléculaire avec un antigène exogène. En présence d’une tolérance périphérique réduite due à un faible nombre de cellules T régulatrices, les cellules T autoréactives proliféreraient et activeraient des cellules B autoréactives entraînant la sécrétion d’autoanticorps. L’activation subséquente de cellules T CD8+ cytotoxiques spécifiques amènerait la lyse des hépatocytes et la relâche d’autoantigènes permettant la perpétuation de l’autoimmunité.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Interleukin-15 in the pathogenesis of multiple sclerosis and its animal models

L'interleukine-15 (IL-15) contribue au développement et à l’activation des lymphocytes T CD8, des cellules immunes qui ont été impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes telle la sclérose en plaques. Des niveaux élevés de l'IL-15 ont été trouvés chez les patients atteints de cette maladie comparativement aux témoins, mais aucune étude n'a examiné les effets de tels niveaux élevés sur les lymphocytes T CD8. Les objectifs de notre étude étaient 1- de caractériser l’expression de l'IL-15 par des lymphocytes B humains et de déterminer ses effets sur les fonctions des lymphocytes T CD8, et 2- d’évaluer l'expression in vivo de l'IL-15 dans des modèles murins de la sclérose en plaques. Nous avons établi que les cellules B humaines augmentaient leur expression de l'IL-15 suite à une stimulation via le CD40. De plus, les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8 ont été significativement augmentées lors des co-cultures avec des cellules B alloréactives exprimant l'IL-15. Dans les modèles murins de la sclérose en plaques, nous avons détecté au sein du système nerveux central des cellules immunes exprimant l’IL-15 ainsi que des cellules T CD8 exprimant le récepteur pour cette cytokine à différents stades de la maladie. Nous avons démontré que les cellules B modulent des réponses des lymphocytes T CD8 via l’IL-15, ce qui suggère un rôle pour les cellules B dans la pathogenèse de la sclérose en plaques. Nous avons aussi mis en évidence la présence de cellules exprimant l’IL-15 dans le système nerveux central dans des modèles murins de cette maladie.

Expression et rôle de PD-1 et de ses ligands dans le contexte de la sclérose en plaques

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante et neurodégénérative du système nerveux central (SNC). Les cellules T activées qui expriment le PD-1 sont inhibées via l’interaction avec l’un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des études effectuées chez le modèle murin de la SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), ont démontré que l’interaction du PD-1 avec ses ligands contribue à atténuer la maladie. Toutefois, le rôle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogenèse de la SEP chez l’humain et dans le modèle murin n’a pas été complètement élucidé. Nous avons déterminé que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de façon significative cette expression en réponse à des cytokines inflammatoires. Le blocage de l’expression du PD-L1 par les astrocytes à l’aide de siRNA spécifiques mène à l’augmentation significative des réponses des cellules T CD8+ (prolifération, cytokines, enzymes lytiques). Nos résultats établissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les réponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus cérébraux post-mortem par immunohistochimie démontre que dans les lésions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus élevés que dans les tissus de témoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moitié des lymphocytes T CD8+ ayant infiltré des lésions de SEP n’expriment pas le récepteur PD-1. Au cours du développement de l’EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprimé par les cellules T dès le début des symptômes, mais son intensité diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoyé par le PD-L1. Nous avons observé que les cellules endothéliales humaines formant la barrière hémato-encéphalique (BHE) expriment de façon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l’expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprimés par les cellules endothéliales ont la capacité de freiner l’activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration à travers la BHE. L’endothélium du cerveau des tissus normaux et des lésions SEP n’exprime pas des taux détectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moitié de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lésions SEP. Nos travaux démontrent que l’entrée des cellules T activées est contrôlée dans des conditions physiologiques grâce à la présence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l’expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lésions SEP nuit au contrôle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ étant dépourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprimé par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activées.

Étude de protection conférée par vaccination ADN dans un modèle murin d’hépatite auto-immune

La vaccination ADN à l’aide de plasmides codant pour des autoantigènes s’est avérée efficace dans la protection contre plusieurs maladies auto-immunes. Le but de ce mémoire était dans un premier temps d’établir si un protocole de vaccination ADN composé de 3 injections de pCMV-CTLA-4-NP et de pVR-IL-12 à deux semaines d’intervalle avait un effet protecteur contre le développement d’une hépatite auto-immune chez la souris TTR-NP, un modèle murin transgénique de la maladie et précédemment développé au laboratoire. Dans un deuxième temps, le but était d’élucider, le cas échéant, les mécanismes sous-tendant la protection conférée par la vaccination ADN. Les hypothèses initiales étaient qu’une protection allait effectivement être conférée par la vaccination ADN et que celle-ci pouvait être attribuable à une déviation de la réponse typiquement Th1 de la maladie vers une réponse Th2, à un épuisement des cellules immunitaires et/ou à l’activation et à l’induction de prolifération de cellules régulatrices. Les résultats montrent que la vaccination ADN induit une protection transitoire contre le développement d’infiltrations lymphocytaires au foie. Cette protection se ferait via un épuisement des cellules CD4+, CD8+ et CD19+ se retrouvant à la rate et exprimant PD 1 dans une plus forte proportion à 3 mois, et ne serait médiée ni par les lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+FoxP3+, ni par les cellules CD8+FoxP3+. Une déviation de la réponse Th1 vers une réponse Th2 demeure une explication supplémentaire plausible à la protection conférée mais nécessiterait une caractérisation en situation plus physiologique avant de pouvoir inférer sur son implication réelle. La vaccination ADN n’influe ni sur la présence d’autoanticorps, ni sur les niveaux d’alanine aminotransférase, deux marqueurs de la maladie.

Correlates of protective immunity against hepatitis C virus

Le virus de l’hépatite C (VHC) infecte ~185 millions d’individus dans le monde. Malgré le développement des nouvelles thérapies dirigées contre le VHC, on compte deux millions de nouvelles infections chaque année, en particulier dans les pays sous-développés et les populations marginalisées. Comme pour la plupart des virus à infection chronique, le développement d’un vaccin prophylactique efficace est limité par le manque de caractérisation des déterminants de la mémoire immunitaire protectrice lors des épisodes de réinfection naturelle chez les êtres humains. Le VHC représente un modèle unique au sein des virus à infection chronique pour étudier l’immunité protectrice. En effet ~30% des patients infectés par le VHC peuvent être guéris suite à un premier épisode d’infection spontanément. Dans cette thèse, nous avons étudié l’immunité protectrice contre le VHC dans une cohorte d’utilisateurs de drogues par injection qui sont à risque d’être infectés ou réinfectés. Notre hypothèse est que la majorité des patients qui ont résolu une première infection par le VHC sont protégés contre le développement d’une infection chronique s’ils sont réexposés. Cette immunité protectrice est associée à la présence des cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles qui possèdent des fréquences, magnitudes et avidités élevées. La capacité protectrice des cellules T mémoire contre les séquences variables du VHC est dépendante de la diversité et flexibilité du répertoire de leurs récepteurs de cellules T (TCR), qui reconnaissent les séquences variables des épitopes ciblés. Notre premier objectif était de définir et détailler les déterminants de l’immunité protectrice conférée par les cellules T spécifiques du VHC. Nos résultats ont montré que la protection pendant l’épisode de réinfection était associée à une augmentation de la magnitude et du spectre des réponses spécifiques par les cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles, ainsi que par l’apparition d’une population de cellules T tétramère+ CD8+ effectrices qui expriment faiblement le marqueur CD127 (CD127lo) lors du pic de la réponse. Chez les patients qui ont développé une infection chronique pendant l’épisode de réinfection, nous avons observé une expansion très limitée des cellules T CD4 et CD8. Le séquençage des épitopes ciblés par les cellules T CD8 chez ces patients qui sont non-protégés a montré que les séquences de ces épitopes sont différentes des séquences de référence qui étaient utilisées pour tous les essais immunologiques de cette étude. Le deuxième objectif était d’analyser la dynamique du répertoire des TCRs des cellules T CD8 spécifiques chez les patients protégés versus les patients non-protégés. Nos résultats ont montré que le répertoire des cellules T CD8 spécifiques est plus focalisé que chez les patients protégés. En plus, nous avons observé que les clonotypes qui forment le répertoire chez les patients protégés sont distincts de ceux chez les patients non-protégés. Ces clonotypes chez les patients protégés ont montré de plus grandes avidité et polyfonctionnalité que leurs homologues chez les patients non-protégés. En conclusion, nos résultats suggèrent que la protection contre le développement d’une infection chronique pendant l’épisode de réinfection par le VHC est associée à une augmentation de la magnitude, du spectre et de la fonctionnalité des réponses des cellules T spécifiques, ainsi qu’à un répertoire des TCRs plus focalisé composé des clonotypes distincts qui possèdent de plus grandes avidité et polyfonctionnalité que chez les patients non-protégés. L’homologie des séquences des souches virales entre les différents épisodes de l’infection est un déterminant majeur de l’établissement d’une protection efficace. Ces résultats ont donc des implications très importantes pour le développement d’un vaccin prophylactique contre le VHC et d’autres virus à infection chronique.

Le CpG et le poly(I:C) agissent en synergie avec le trastuzumab contre le cancer du sein HER2+

Chez la souris, la thérapie anti-HER2 est dépendante de la présence de cellules T CD8+IFN-γ+ et des réponses IFN de type I. Ces IFN sont induits par les TLRs suite à la reconnaissance de signaux de danger, appelés PAMPs et DAMPs. Les TLR-3 et TLR-9 sont tous deux de bons inducteurs d’IFN de type I et sont également capable d’agir en synergie afin d’augmenter les niveaux d’IFN-γ, de TNF-α et d’IL-12. Notre hypothèse fut que la stimulation de ces deux TLRs mènerait à l’amélioration de l’activité anti-tumorale du trastuzumab via le recrutement et l’activation des cellules immunitaires. Nos buts furent de confirmer le potentiel thérapeutique de la combinaison de l’anticorps anti-HER2, de l’agoniste de TLR-3, le poly(I:C), et de l’agoniste de TLR-9, le CpG ODN. Des études in vivo et in vitro nous ont permis de découvrir une synergie entre ces agents qui résulte en une cytotoxicité ciblée plus efficace. De plus, cette thérapie s’avéra efficace chez des modèles CD8-dépendants et CD8-indépendents. Les souris purent rejeter leur tumeur et demeurer sains plusieurs semaines après l’arrêt des injections. Ces souris étaient également protégées lors d’un challenge, soulignant ainsi la présence d’une immunité mémoire. Nous avons aussi découvert que l’administration combine de trastuzumab des deux agonistes de TLRs mène à des réponses systémiques. Des études de déplétion confirmèrent que les cellules T CD8+ sont cruciales pour la protection à long terme des animaux, mais que les pDC sont moins impliquées que ce que l’on pourrait croire. Leur absence n’a que modestement affecté les effets de notre thérapie. À l’opposé, les cellules NK sont d’importants médiateurs des effets thérapeutiques. Des expériences d’ADCC ont révélé que le CpG ODN et poly(I:C) ont tous deux la capacité d’améliorer les fonctions des cellules NK, mais que la stimulation simultanée des TLR-3 et TLR-9 permet de maximiser les effets bénéfiques du trastuzumab. De la même manière, l’addition de CpG ODN et de poly(I:C) aux anticorps anti-HER2 a permis d’augmenter les réponses pro-inflammatoires, plus spécifiquement l’IFN-γ, le TNF-α, l’IP-10 et l’IL-12.

L’importance de la coopération de TRAF1 et LSP1 en aval du récepteur 4-1BB(CD137) pour la survie des lymphocytes

4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqué dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protéine adaptatrice qui est recrutée par 4-1BB et autres TNFRs et est caractérisée par une expression très restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules épithéliales. TRAF1 est nécessaire pour l’expansion et la survie des cellules T mémoire en présence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk impliquée dans la régulation de la molécule pro-apoptotique Bim. Suite à l’activation du récepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqués dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. L’activation et la régulation de TRAF1 et Bim ont un rôle important dans la survie des cellules T CD8 mémoires. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche protéomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratégie, nous avons identifié que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recruté dans le complexe de signalisation 4-1BB de manière TRAF1 dépendante. Une caractérisation plus poussée de l’interaction entre TRAF1 et LSP1 a montré que LSP1 lie la région unique N-terminal de TRAF1 de façon indépendante de la région conservée C-terminal. À l’instar des cellules T déficientes en TRAF1, les cellules T déficientes en LSP1 ne sont pas capables d’activer ERK en aval de 4-1BB et par conséquent ne peuvent pas réguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB dans le but d’activer ERK et réguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littérature, le récepteur 4-1BB n’est pas exprimé à la surface des cellules B murines, mais le récepteur 4-1BB favorise la prolifération et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'étudier l'expression du récepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modèle murin et de prédire la réponse clinique à la manipulation de 4-1BB. En utilisant différentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifié que le récepteur 4-1BB est exprimé à la surface des cellules B de souris suite à une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractérisation plus poussée a montré que le récepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manière dépendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a démontré que la stimulation avec le LPS induit l’expression du récepteur 4-1BB à la surface des cellules B murines, menant ainsi à l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manière similaire aux cellules T. Les cellules B déficientes en TRAF1 et les cellules B déficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau d’expression du récepteur significativement diminué comparé aux cellules B d’une souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont nécessaires pour une expression maximale du récepteur 4-1BB à la surface cellulaire de cellules B murines et coopèrent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.