Rôle de l’extrémité C-terminale dans l’expression du canal calcique Cav1.2 à la membrane plasmique

Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane.

Couplage entre les régions IIS4-S5 et IIS6 lors de l’activation du canal calcique CaV2.3

Les canaux calciques dépendants du voltage CaV font partie de la famille structurale des canaux ioniques à 6 segments transmembranaires. Tout comme les canaux potassiques Kv, les canaux CaV possèdent une série de résidus chargés dans l’hélice S4 de chaque domaine ou sous-unité qui conférerait à la protéine une sensibilité aux changements de voltage. De plus les hélices S6 tapissent la paroi du pore et forment la porte d’activation de la protéine. Comment le mouvement des hélices S4 se traduit par l’ouverture de la porte d’activation des hélices S6 demeure une question encore non résolue. Suite à la publication de la structure cristalline du canal Kv1.2 en 2005, le groupe de MacKinnon a proposé que le mouvement des hélices S4 est mécaniquement couplé à la porte d’activation S6 à travers le glissement de l’hélice amphiphile S4-S5 selon un mécanisme nommé couplage électromécanique (Long et al. 2005b). Dans le but de déterminer si la région S4-S5 joue un rôle dans l’activation du canal calcique CaV2.3, nous avons étudié, par la méthode d’analyse cyclique de mutations doubles (« Double Mutant Cycle Analysis », (Horovitz 1996)), le couplage entre la boucle S4-S5 et l’hélice S6 du domaine II de ce canal. Les mesures d’énergies d’activation, ΔGact, obtenues en présence des sous-unités auxiliaires CaVα2δ et CaVβ3 ont affiché un couplage significatif pour l’activation entre les paires de résidus V593G/L699G, V593G/A700G, V593G/A702G, S595G/V703G L596G/L699G, L596G/A700G, L596G/I701G, L596G/A702G, L596G/V703G, L596G/D704G, M597G/I701G, et S602G/I701G. Aucune de ces paires de résidus n’a affiché de couplage lors de l’inactivation, suggérant que les effets observés sont spécifiques au mécanisme d’activation. Mis ensemble, ces résultats suggèrent que la boucle IIS4-S5 et l’hélice IIS6 interagissent et jouent un rôle déterminant dans l’activation de CaV2.3.

Étude du couplage entre les sous-unités du canal potassique KcsA par des mesures de spectroscopie de fluorescence en canal unitaire

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Couplage entre les régions IIS4S5 et IIIS6 lors de l’activation du canal calcique CaV3.2

Le canal calcique dépendant du voltage de type-T CaV3.2 joue un rôle important dans l’excitabilité neuronale et dans la perception de la douleur. Le canal CaV3.2 partage une grande homologie structurale et fonctionnelle avec les canaux NaV. Ces deux types de canaux sont activés par de faibles dépolarisations membranaires et possèdent des cinétiques de temps d’activation et d’inactivation plus rapides que les canaux CaV de type-L. Les structures cristallines à haute résolution des canaux bactériens NaVAb (Payandeh et al. 2011; Payandeh et al. 2012) et NaVRh (Zhang et al. 2012) suggèrent que l’hélice amphiphile S4S5 du domaine II peut être couplée avec les résidus de l’hélice S6 dans le domaine II ainsi qu’avec des résidus de l’hélice homologue dans le domaine adjacent, soit le domaine III, et ce, durant l’activation du canal. Pour déterminer les résidus fonctionnellement couplés, durant l’activation du canal CaV3.2, une analyse cyclique de doubles mutants a été effectuée par substitution en glycine et alanine des résidus clés entre l’hélice S4S5 du domaine II et le segment S6 des domaines II et III. Les propriétés biophysiques ont été mesurées à l’aide de la technique de « cut-open » sur les ovocytes. Les énergies d’activation ont été mesurées pour 47 mutations ponctuelles et pour 14 paires de mutants. De grandes énergies de couplage (ΔΔGinteract > 2 kcal mol-1) ont été observées pour 3 paires de mutants introduites dans les IIS4S5/IIS6 et IIS4S5/IIIS6. Aucun couplage significatif n’a été observé entre le IIS4S5 et le IVS6. Nos résultats semblent démontrer que les hélices S4S5 et S6 provenant de deux domaines voisins sont couplées durant l’activation du canal calcique de type-T CaV3.2.

ACID-SENSING ION CHANNELS: functional and molecular characterization in putative nociceptors, and modulation by nerve injury and serine protease

Résumé Les canaux ioniques ASICs (acid-sensing ion channels) appartiennent à la famille des canaux ENaC/Degenerin. Pour l'instant, quatre gènes (1 à 4) ont été clonés dont certains présentent des variants d'épissage. Leur activation par une acidification rapide du milieu extracellulaire génère un courant entrant transitoire essentiellement sodique accompagné pour certains types d'ASICs d'une phase soutenue. Les ASICs sont exprimés dans le système nerveux, central (SNC) et périphérique (SNP). On leur attribue un rôle dans l'apprentissage, la mémoire et l'ischémie cérébrale au niveau central ainsi que dans la nociception (douleur aiguë et inflammatoire) et la méchanotransduction au niveau périphérique. Toutefois, les données sont parfois contradictoires. Certaines études suggèrent qu'ils sont des senseurs primordiaux impliqués dans la détection de l'acidification et la douleur. D'autres études suggèrent plutôt qu'ils ont un rôle modulateur inhibiteur dans la douleur. De plus, le fait que leur activation génère majoritairement un courant transitoire alors que les fibres nerveuses impliquées dans la douleur répondent à un stimulus nocif avec une adaptation lente suggère que leurs propriétés doivent être modulés par des molécules endogènes. Dans une première partie de ma thèse, nous avons abordé la question de l'expression fonctionnelle des ASICs dans les neurones sensoriels primaires afférents du rat adulte pour clarifier le rôle des ASICs dans les neurones sensoriels. Nous avons caractérisé leurs propriétés biophysiques et pharmacologiques par la technique du patch-clamp en configuration « whole-cell ». Nous avons pu démontrer que près de 60% des neurones sensoriels de petit diamètre expriment des courants ASICs. Nous avons mis en évidence trois types de courant ASIC dans ces neurones. Les types 1 et 3 ont des propriétés compatibles avec un rôle de senseur du pH alors que le type 2 est majoritairement activé par des pH inférieurs à pH6. Le type 1 est médié par des homomers de la sous-unité ASIC1 a qui sont perméables aux Ca2+. Nous avons étudié leur co-expression avec des marqueurs des nocicepteurs ainsi que la possibilité d'induire une activité neuronale suite à une acidification qui soit dépendante des ASICs. Le but était d'associer un type de courant ASIC avec une fonction potentielle dans les neurones sensoriels. Une majorité des neurones exprimant les courants ASIC co-expriment des marqueurs des nocicepteurs. Toutefois, une plus grande proportion des neurones exprimant le type 1 n'est pas associée à la nociception par rapport aux types 2 et 3. Nous avons montré qu'il est possible d'induire des potentiels d'actions suite à une acidification. La probabilité d'induction est proportionnelle à la densité des courants ASIC et à l'acidité de la stimulation. Puis, nous avons utilisé cette classification comme un outil pour appréhender les potentielles modulations fonctionnelles des ASICs dans un model de neuropathie (spared nerve injury). Cette approche fut complétée par des expériences de «quantitative RT-PCR ». En situation de neuropathie, les courants ASIC sont dramatiquement changés au niveau de leur expression fonctionnelle et transcriptionnelle dans les neurones lésés ainsi que non-lésés. Dans une deuxième partie de ma thèse, suite au test de différentes substances sécrétées lors de l'inflammation et l'ischémie sur les propriétés des ASICs, nous avons caractérisé en détail la modulation des propriétés des courants ASICs notamment ASIC1 par les sérines protéases dans des systèmes d'expression recombinants ainsi que dans des neurones d'hippocampe. Nous avons montré que l'exposition aux sérine-protéases décale la dépendance au pH de l'activation ainsi que la « steady-state inactivation »des ASICs -1a et -1b vers des valeurs plus acidiques. Ainsi, l'exposition aux serine protéases conduit à une diminution du courant quand l'acidification a lieu à partir d'un pH7.4 et conduit à une augmentation du courant quand l'acidification alleu à partir d'un pH7. Nous avons aussi montré que cette régulation a lieu des les neurones d'hippocampe. Nos résultats dans les neurones sensoriels suggèrent que certains courants ASICs sont impliqués dans la transduction de l'acidification et de la douleur ainsi que dans une des phases du processus conduisant à la neuropathie. Une partie des courants de type 1 perméables au Ca 2+ peuvent être impliqués dans la neurosécrétion. La modulation par les sérines protéases pourrait expliquer qu'en situation d'acidose les canaux ASICs soient toujours activables. Résumé grand publique Les neurones sont les principales cellules du système nerveux. Le système nerveux est formé par le système nerveux central - principalement le cerveau, le cervelet et la moelle épinière - et le système nerveux périphérique -principalement les nerfs et les neurones sensoriels. Grâce à leur nombreux "bras" (les neurites), les neurones sont connectés entre eux, formant un véritable réseau de communication qui s'étend dans tout le corps. L'information se propage sous forme d'un phénomène électrique, l'influx nerveux (ou potentiels d'actions). A la base des phénomènes électriques dans les neurones il y a ce que l'on appelle les canaux ioniques. Un canal ionique est une sorte de tunnel qui traverse l'enveloppe qui entoure les cellules (la membrane) et par lequel passent les ions. La plupart de ces canaux sont normalement fermés et nécessitent d'être activés pour s'ouvrire et générer un influx nerveux. Les canaux ASICs sont activés par l'acidification et sont exprimés dans tout le système nerveux. Cette acidification a lieu notamment lors d'une attaque cérébrale (ischémie cérébrale) ou lors de l'inflammation. Les expériences sur les animaux ont montré que les canaux ASICs avaient entre autre un rôle dans la mort des neurones lors d'une attaque cérébrale et dans la douleur inflammatoire. Lors de ma thèse je me suis intéressé au rôle des ASICs dans la douleur et à l'influence des substances produites pendant l'inflammation sur leur activation par l'acidification. J'ai ainsi pu montrer chez le rat que la majorité des neurones sensoriels impliqués dans la douleur ont des canaux ASICs et que l'activation de ces canaux induit des potentiels d'action. Nous avons opéré des rats pour qu'ils présentent les symptômes d'une maladie chronique appelée neuropathie. La neuropathie se caractérise par une plus grande sensibilité à la douleur. Les rats neuropathiques présentent des changements de leurs canaux ASICs suggérant que ces canaux ont une peut-être un rôle dans la genèse ou les symptômes de cette maladie. J'ai aussi montré in vitro qu'un type d'enryme produit lors de l'inflammation et l'ischémie change les propriétés des ASICs. Ces résultats confirment un rôle des ASICs dans la douleur suggérant notamment un rôle jusque là encore non étudié dans la douleur neuropathique. De plus, ces résultats mettent en évidence une régulation des ASICs qui pourrait être importante si elle se confirmait in vivo de part les différents rôles des ASICs. Abstract Acid-sensing ion channels (ASICs) are members of the ENaC/Degenerin superfamily of ion channels. Their activation by a rapid extracellular acidification generates a transient and for some ASIC types also a sustained current mainly mediated by Na+. ASICs are expressed in the central (CNS) and in the peripheral (PNS) nervous system. In the CNS, ASICs have a putative role in learning, memory and in neuronal death after cerebral ischemia. In the PNS, ASICs have a putative role in nociception (acute and inflammatory pain) and in mechanotransduction. However, studies on ASIC function are somewhat controversial. Some studies suggest a crucial role of ASICs in transduction of acidification and in pain whereas other studies suggest rather a modulatory inhibitory role of ASICs in pain. Moreover, the basic property of ASICs, that they are activated only transiently is irreconcilable with the well-known property of nociception that the firing of nociceptive fibers demonstrated very little adaptation. Endogenous molecules may exist that can modulate ASIC properties. In a first part of my thesis, we addressed the question of the functional expression of ASICs in adult rat dorsal root ganglion (DRG) neurons. Our goal was to elucidate ASIC roles in DRG neurons. We characterized biophysical and pharmacological properties of ASIC currents using the patch-clamp technique in the whole-cell configuration. We observed that around 60% of small-diameter sensory neurons express ASICs currents. We described in these neurons three ASIC current types. Types 1 and 3 have properties compatible with a role of pH-sensor whereas type 2 is mainly activated by pH lower than pH6. Type 1 is mediated by ASIC1a homomultimers which are permeable to Ca 2+. We studied ASIC co-expression with nociceptor markers. The goal was to associate an ASIC current type with a potential function in sensory neurons. Most neurons expressing ASIC currents co-expressed nociceptor markers. However, a higher proportion of the neurons expressing type 1 was not associated with nociception compared to type 2 and -3. We completed this approach with current-clamp measurements of acidification-induced action potentials (APs). We showed that activation of ASICs in small-diameter neurons can induce APs. The probability of AP induction is positively correlated with the ASIC current density and the acidity of stimulation. Then, we used this classification as a tool to characterize the potential functional modulation of ASICs in the spared nerve injury model of neuropathy. This approach was completed by quantitative RT-PCR experiments. ASICs current expression was dramatically changed at the functional and transcriptional level in injured and non-injured small-diameter DRG neurons. In a second part of my thesis, following an initial screening of the effect of various substances secreted during inflammation and ischemia on ASIC current properties, we characterized in detail the modulation of ASICs, in particular of ASIC1 by serine proteases in a recombinant expression system as well as in hippocampal neurons. We showed that protease exposure shifts the pH dependence of ASIC1 activation and steady-state inactivation to more acidic pH. As a consequence, protease exposure leads to a decrease in the current response if ASIC1 is activated by a pH drop from pH 7.4. If, however, acidification occurs from a basal pH of 7, protease-exposed ASIC1a shows higher activity than untreated ASIC1a. We provided evidence that this bi-directional regulation of ASIC1a function also occurs in hippocampal neurons. Our results in DRG neurons suggest that some ASIC currents are involved in the transduction of peripheral acidification and pain. Furthermore, ASICs may participate to the processes leading to neuropathy. Some Ca 2+-permeable type 1 currents may be involved in neurosecretion. ASIC modulation by serine proteases may be physiologically relevant, allowing ASIC activation under sustained slightly acidic conditions.

Modulation allostérique de la fonction des récepteurs FP et PAF

Les récepteurs couplés aux protéines-G (RCPGs) constituent la première étape d’une série de cascades signalétiques menant à la régulation d’une multitude de processus physiologiques. Dans le modèle classique connu, la liaison du ligand induit un changement de conformation du récepteur qui mène à sa forme active. Une fois activés, les RCPGs vont réguler l’activité d’une protéine membranaire cible qui peut être tant une enzyme qu’un canal ionique. L’interaction entre le récepteur et la cible nécessite l’intermédiaire d’une protéine hétérotrimérique appelée « protéine G », qui est activée pour favoriser l’échange du GDP (guanosine diphosphate) pour un GTP (guanosine triphosphate) et assurer la transduction du signal du récepteur à l’effecteur. Les mécanismes moléculaires menant à l’activation des effecteurs spécifiques via l’activation des RCPGs par les protéines G hétérotrimériques sont encore plutôt méconnus. Dans notre étude nous nous sommes intéressés aux récepteurs FP et PAF, à leurs ligands naturels, la PGF2α et le Carbamyl-PAF respectivement, et à des ligands à action antagoniste sur ces récepteurs. Des ligands considérés comme agonistes, sont des molécules qui interagissent avec le récepteur et induisent les mêmes effets que le ligand naturel. Les antagonistes, par contre, sont des molécules qui interagissent avec le récepteur et bloquent l’action du ligand naturel en prévenant le changement conformationnel du complexe, et ils peuvent avoir une action compétitive ou non-compétitive. Nous avons étudié aussi des ligands orthostériques et allostériques du récepteur FP des prostaglandines et du récepteur PAF. Un ligand orthostérique peut se comporter comme agoniste ou antagoniste en se fixant au site de liaison du ligand (agoniste) naturel. Un ligand allostérique est un agoniste ou antagoniste se fixant à un site autre que celui du ligand naturel entraînant un changement de conformation ayant pour conséquence soit une augmentation (effecteur positif), soit une diminution (effecteur négatif) de l'activité du ligand naturel.

Influence des glycines du lien S4-S5 sur le couplage électromécanique des canaux ioniques dépendants du voltage

Les canaux potassiques dépendants du voltage sont formés de quatre sous-unités, chacune possédant six segments transmembranaires (S1-S6) et une boucle (p-loop) qui se trouve entre le cinquième et le sixième segment au niveau du pore. Il est connu que le segment senseur du voltage (S1-S4) subit un mouvement lorsque le potentiel membranaire change. Pour ouvrir le canal, il est nécessaire de transférer l'énergie du senseur du voltage (généré par le mouvement des charges positives de S4) au pore. Le mécanisme exact de ce couplage électromécanique est encore sous étude. Un des points de liaison entre le senseur de voltage et le pore est le lien physique fait par le segment S4-S5 (S45L). Le but de cette étude est de déterminer l'influence de la flexibilité du segment S45L sur le processus de couplage. Dans le S45L, trois glycines sont distribuées dans des positions différentes. Elles sont responsables de la flexibilité des hélices-alpha. Ces glycines (mais pas leurs positions exactes) sont conservées pour tous les canaux potassiques dépendants de potentiel. En utilisant la technique de mutagènes dirigé, la glycine a été remplacée dans chacune de ces différentes positions par une alanine et dans une deuxième étape, par une proline (pour introduire un angle dans l'hélice). Pour étudier le comportement des canaux dans cette nouvelle conformation, on a appliqué la technique de « patch clamp » pour déterminer les effets lors de l'ouverture du pore (courant ionique). Avec le « cut-open oocyte voltage-clamp », nous avons étudié les effets sur le mouvement du senseur de voltage (courant “gating”) et la coordination temporelle avec l'ouverture du pore (courant ionique). Les données ont montré qu’en réduisant la flexibilité dans le S45L, il faut avoir plus d'énergie pour faire ouvrir le canal. Le changement pour une proline suggère que le mouvement du senseur est indépendant du pore pendant l'ouverture du canal.

Hepsine et matriptase activent l’hémagglutinine des virus influenza A et B et leur inhibition représente une nouvelle stratégie thérapeutique n’entraînant pas le développement de résistance

Résumé: Chaque année, les épidémies saisonnières d’influenza causent de 3 à 5 millions de cas sévères de maladie, entraînant entre 250 000 et 500 000 décès mondialement. Seulement deux classes d’antiviraux sont actuellement commercialisées pour traiter cette infection respiratoire : les inhibiteurs de la neuraminidase, tels que l’oseltamivir (Tamiflu) et les inhibiteurs du canal ionique M2 (adamantanes). Toutefois, leur utilisation est limitée par l’apparition rapide de résistance virale. Il est donc d’un grand intérêt de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’influenza. Le virus influenza dépend de l’activation de sa protéine de surface hémagglutinine (HA) pour être infectieux. L’activation a lieu par clivage protéolytique au sein d’une séquence d’acides aminés conservée. Ce clivage doit être effectué par une enzyme de l’hôte, étant donné que le génome du virus ne code pour aucune protéase. Pour les virus infectant l’humain, plusieurs études ont montré le potentiel de protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) à promouvoir la réplication virale : TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 et matriptase, identifiée récemment par notre équipe (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activent l’HA des virus influenza A (principalement H1N1 et H3N2). Toutefois, il existe peu d’information sur le clivage de l’HA des virus influenza B, et seulement TMPRSS2 et HAT ont été identifiées comme étant capables d’activer ce type de virus. Les travaux de ce projet de maîtrise visaient à identifier d’autres TTSP pouvant activer l’HA de l’influenza B. L’efficacité de clivage par la matriptase, hepsine, HAT et Desc1 a été étudiée et comparée entre ces TTSP. Ces quatre protéases s’avèrent capables de cliver l’HA de l’influenza B in vitro. Cependant, seul le clivage par matriptase, hepsine et HAT promeut la réplication virale. De plus, ces TTSP peuvent aussi supporter la réplication de virus influenza A. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de TTSP, développé en collaboration avec notre laboratoire, permet de bloquer significativement la réplication virale dans les cellules épithéliales bronchiques humaines Calu-3. Cet inhibiteur se lie de façon covalente et lentement réversible au site actif de la TTSP par un mécanisme slow tight-binding. Puisque cet inhibiteur cible une composante de la cellule hôte, et non une protéine virale, il n’entraîne pas le développement de résistance après 15 passages des virus en présence de l’inhibiteur dans les cellules Calu-3. L’inhibition des TTSP activatrices d’HA dans le système respiratoire humain représente donc une nouvelle stratégie thérapeutique pouvant mener au développement d’antiviraux efficaces contre l’influenza.

Implications des canaux K+ sur la régulation génique du canal ENaC, et impact de l'hyperglycémie sur le transport ionique et la réparation de l'épithélium respiratoire

Dans mon projet de doctorat, j’ai étudié des fonctions primordiales de l’épithélium respiratoire telles que la régulation du transport ionique, la clairance liquidienne et la réparation épithéliale. J’ai particulièrement mis l’emphase sur le rôle des canaux potassiques qui interviennent dans ces trois fonctions de l’épithélium respiratoire. J’ai tout d’abord prouvé que la modulation des canaux potassiques régulait l’activité du promoteur de αENaC, en partie via la voie de signalisation ERK1/2, dans des cellules alvéolaires. Cette régulation entraîne une variation de l’expression génique et protéique du canal ENaC. Physiologiquement, il en résulte une augmentation du phénomène de clairance liquidienne suite à l’activation des canaux K+, tandis que l’inhibition de ces canaux la diminue sévèrement. J’ai aussi pu démontrer que l’absence de canal KvLQT1 entraînait une diminution du courant (ENaC) sensible à l’amiloride, dans les cellules de trachée en culture primaire, isolées de souris KO pour kcnq1. Dans la seconde partie de mon étude, j’ai évalué l’impact de l’hyperglycémie sur la capacité de transport ionique et de réparation de cellules épithéliales bronchiques saines ou Fibrose Kystique. Mes résultats montrent que l’hyperglycémie diminue le transport transépithélial de chlore et le transport basolatéral de potassium. Des études préalables du laboratoire ayant montré que les canaux K+ et Cl- contrôlent les processus de réparation, j’ai donc évalué si ceux-ci étaient modifiés par l’hyperglycémie. Et en effet, l’hyperglycémie ralentit la vitesse de réparation des cellules issues des voies aériennes (CFBE-wt et CFBE-ΔF508). J’ai donc démontré que le transport de potassium intervenait dans des fonctions clés de l’épithélium respiratoire, comme dans la régulation génique de canaux ioniques, le contrôle de la clairance liquidienne alvéolaire, et que l’hyperglycémie diminuait le transport ionique (K+ et Cl-) et la réparation épithéliale.

Régulation du canal à sodium épithélial par le sodim extracellulaire et développement d'un microsystème intégré pour l'étude électrophysiologique sur ovocytes de "Xenopus laevis"

Résumé : La première partie de ce travail de thèse est consacrée au canal à sodium épithélial (ENaC), l'élément clé du transport transépithélial de Na+ dans le néphron distal, le colon et les voies aériennes. Ce canal est impliqué dans certaines formes génétiques d'hypo- et d'hypertension (PHA I, syndrome de Liddle), mais aussi, indirectement, dans la mucoviscidose. La réabsorption transépithéliale de Na+ est principalement régulée par des hormones (aldostérone, vasopressine), mais aussi directement par le Na+, via deux phénomènes distincts, la « feedback inhibition » et la « self-inhibition » (SI). Ce second phénomène est dépendant de la concentration de Na+ extracellulaire, et montre une cinétique rapide (constante de temps d'environ 3 s). Son rôle physiologique serait d'assurer l'homogénéité de la réabsorption de Na+ et d'empêcher que celle-ci soit excessive lorsque les concentrations de Na+ sont élevées. Différents éléments appuient l'hypothèse de la présence d'un site de détection de la concentration du Na+ extracellulaire sur ENaC, gouvernant la SI. L'objectif de ce premier projet est de démontrer l'existence du site de détection impliqué dans la SI et de déterminer ses propriétés physiologiques et sa localisation. Nous avons montré que les caractéristiques de la SI (en termes de sélectivité et affinité ionique) sont différentes des propriétés de conduction du canal. Ainsi, nos résultats confirment l'hypothèse de l'existence d'un site de détection du Na+ (responsable de la transmission de l'information au mécanisme de contrôle de l'ouverture du canal), différent du site de conduction. Par ailleurs, ce site présente une affinité basse et indépendante du voltage pour le Na+ et le Li+ extracellulaires. Le site semble donc être localisé dans le domaine extracellulaire, plutôt que transmembranaire, de la protéine. L'étape suivante consiste alors à localiser précisément le site sur le canal. Des études précédentes, ainsi que des résultats préliminaires récemment obtenus, mettent en avant le rôle dans la self-inhibition du premiers tiers des boucles extracellulaires des sous-unités α et γ du canal. Le second projet tire son origine des limitations de la méthode classique pour l'étude des canaux ioniques, après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis, par la méthode du voltage-clamp à deux électrodes, en particulier les limitations dues à la lenteur des échanges de solutions. En outre, cette méthode souffre de nombreux désavantages (manipulations délicates et peu rapides, grands volumes de solution requis). Plusieurs systèmes améliorés ont été élaborés, mais aucun ne corrige tous les désavantages de la méthode classique Ainsi, l'objectif ici est le développement d'un système, pour l'étude électrophysiologique sur ovocytes, présentant les caractéristiques suivantes : manipulation des cellules facilitée et réduite, volumes de solution de perfusion faibles et vitesse rapide d'échange de la perfusion. Un microsystème intégré sur une puce a été élaboré. Ces capacités de mesure ont été testées en utilisant des ovocytes exprimant ENaC. Des résultats similaires (courbes IV, courbes dose-réponse au benzamil) à ceux obtenus avec le système traditionnel ont été enregistrés avec le microsystème. Le temps d'échange de solution a été estimé à ~20 ms et des temps effectifs de changement ont été déterminés comme étant 8 fois plus court avec le nouveau système comparé au classique. Finalement, la SI a été étudiée et il apparaît que sa cinétique est 3 fois plus rapide que ce qui a été estimé précédemment avec le système traditionnel et son amplitude de 10 à 20 % plus importante. Le nouveau microsystème intégré apparaît donc comme adapté à la mesure électrophysiologique sur ovocytes de Xenopus, et possèdent des caractéristiques appropriées à l'étude de phénomènes à cinétique rapide, mais aussi à des applications de type « high throughput screening ». Summary : The first part of the thesis is related to the Epithelial Sodium Channel (ENaC), which is a key component of the transepithelial Na+ transport in the distal nephron, colon and airways. This channel is involved in hypo- and hypertensive syndrome (PHA I, Liddle syndrome), but also indirectly in cystic fibrosis. The transepithelial reabsorption of Na+ is mainly regulated by hormones (aldosterone, vasopressin), but also directly by Na+ itself, via two distinct phenomena, feedback inhibition and self-inhibition. This latter phenomenon is dependant on the extracellular Na+ concentration and has rapid kinetics (time constant of about 3 s). Its physiological role would be to prevent excessive Na+ reabsorption and ensure this reabsorption is homogenous. Several pieces of evidence enable to propose the hypothesis of an extracellular Na+ sensing site on ENaC, governing self-inhibition. The aim of this first project is to demonstrate the existence of the sensing site involved in self-inhibition and to determine its physiological properties and localization. We show self-inhibition characteristics (ionic selectivity and affinity) are different from the conducting properties of the channel. Our results support thus the hypothesis that the Na+ sensing site (responsible of the transmission of the information about the extracellular Na+ concentration to the channel gating mechanism), is different from the channel conduction site. Furthermore, the site has a low and voltage-insensitive affinity for extracellular Na+ or Li+. This site appears to be located in the extracellular domain rather than in the transmembrane part of the channel protein. The next step is then to precisely localize the site on the channel. Some previous studies and preliminary results we recently obtained highlight the role of the first third of the extracellular loop of the α and γ subunits of the channel in self-inhibition. The second project originates in the limitation of the classical two-electrode voltageclamp system classically used to study ion channels expressed in Xenopus /aevis oocytes, in particular limitations related to the slow solution exchange time. In addition, this technique undergoes several drawbacks (delicate manipulations, time consumption volumes). Several improved systems have been built up, but none corrected all these detriments. The aim of this second study is thus to develop a system for electrophysiological study on oocytes featuring an easy and reduced cell handling, small necessary perfusion volumes and fast fluidic exchange. This last feature establishes the link with the first project, as it should enable to improve the kinetics analysis of self-inhibition. A PDMS chip-based microsystem has been elaborated. Its electrophysiological measurement abilities have been tested using oocytes expressing ENaC. Similar measurements (IV curves of benzamil-sensitive currents, benzamil dose-response curves) have been obtained with this system, compared to the traditional one. The solution exchange time has been estimated at N20 ms and effective exchange times (on inward currents) have been determined as 8 times faster with the novel system compared to the classical one. Finally, self-inhibition has been studied and it appears its kinetics is 3 times faster and its amplitude 10 to 20 % higher than what has been previously estimated with the traditional system. The novel integrated microsystem appears therefore to be convenient for electrophysiological measurement on Xenopus oocytes, and displays features suitable for the study of fast kinetics phenomenon, but also high throughput screening applications. Résumé destiné large public : Le corps humain est composé d'organes, eux-mêmes constitués d'un très grand nombre de cellules. Chaque cellule possède une paroi appelée membrane cellulaire qui sépare l'intérieur de cette cellule (milieu intracellulaire) du liquide (milieu extracellulaire) dans lequel elle baigne. Le maintien de la composition stable de ce milieu extracellulaire est essentiel pour la survie des cellules et donc de l'organisme. Le sodium est un des composants majeurs du milieu extracellulaire, sa quantité dans celui-ci doit être particulièrement contrôlée. Le sodium joue en effet un rôle important : il conditionne le volume de ce liquide extracellulaire, donc, par la même, du sang. Ainsi, une grande quantité de sodium présente dans ce milieu va de paire avec une augmentation du volume sanguin, ce qui conduit l'organisme à souffrir d'hypertension. On se rend donc compte qu'il est très important de contrôler la quantité de sodium présente dans les différents liquides de l'organisme. Les apports de sodium dans l'organisme se font par l'alimentation, mais la quantité de sodium présente dans le liquide extracellulaire est contrôlée de manière très précise par le rein. Au niveau de cet organe, on appelle urine primaire le liquide résultant de la filtration du sang. Elle contient de nombreuses substances, des petites molécules, dont l'organisme a besoin (sodium, glucose...), qui sont ensuite récupérées dans l'organe. A la sortie du rein, l'urine finale ne contient plus que l'excédent de ces substances, ainsi que des déchets à éliminer. La récupération du sodium est plus ou moins importante, en fonction des ajustements à apporter à la quantité présente dans le liquide extracellulaire. Elle a lieu grâce à la présence de protéines, dans les membranes des cellules du rein, capables de le transporter et de le faire transiter de l'urine primaire vers le liquide extracellulaire, qui assurera ensuite sa distribution dans l'ensemble de l'organisme. Parmi ces protéines « transporteurs de sodium », nous nous intéressons à une protéine en particulier, appelée ENaC. Il a été montré qu'elle jouait un rôle important dans cette récupération de sodium, elle est en effet impliquée dans des maladies génétiques conduisant à l'hypo- ou à l'hypertension. De précédents travaux ont montré que lorsque le sodium est présent en faible quantité dans l'urine primaire, cette protéine permet d'en récupérer une très grande partie. A l'inverse, lorsque cette quantité de sodium dans l'urine primaire est importante, sa récupération par le biais d'ENaC est réduite. On parle alors d'autorégulation : la protéine elle-même est capable d'adapter son activité de transport en fonction des conditions. Ce phénomène d'autorégulation constitue a priori un mécanisme préventif visant à éviter une trop grande récupération de sodium, limitant ainsi les risques d'hypertension. La première partie de ce travail de thèse a ainsi consisté à clarifier le mécanisme d'autorégulation de la protéine ENaC. Ce phénomène se caractérise en particulier par sa grande vitesse, ce qui le rend difficile à étudier par les méthodes traditionnelles. Nous avons donc, dans une deuxième partie, développé un nouveau système permettant de mieux décrire et analyser cette « autorégulation » d'ENaC. Ce second projet a été mené en collaboration avec l'équipe de Martin Gijs de l'EPFL.

Impact de l’hyperglycémie et de l’infection sur le transport ionique, la réparation épithéliale et l’action des correcteurs dans les voies aériennes en Fibrose kystique

La Fibrose kystique (FK), causée par des mutations du canal Cl- CFTR, entraîne une dysfonction de la sécrétion de Cl- et un débalancement dans la sécrétion des fluides. La diminution de la clairance mucociliaire qui s’en suit occasionne une accumulation du mucus. Cet environnement est alors favorable à l’installation d’infections et d’inflammation chroniques, responsables de lésions au niveau de l’épithélium respiratoire. Le vieillissement de la population FK, suite à la prise en charge plus appropriée de la maladie, est accompagné par l’émergence de pathologies associées, telles que le diabète. Celui-ci, ainsi que plusieurs autres facteurs comme l’infection à Pseudomonas aeruginosa, contribuent au déclin progressif de la fonction pulmonaire, principale cause de mortalité et de morbidité des patients FK. Le maintien de la fonction pulmonaire est dépendant notamment du transport ionique et liquidien régulant la clairance mucociliaire ainsi que de la réparation épithéliale nécessaire à la génération d’un épithélium fonctionnel en réponse aux agressions. Nous avons donc évalué l’impact de l’hyperglycémie et des exoproduits de P. aeruginosa sur ces deux mécanismes. Nos résultats ont tout d’abord montré qu’un niveau de glucose élevé diminue les courants Cl- CFTR et potassique et altère la réparation de l’épithélium bronchique FK et non FK. Nous avons aussi observé que l’hyperglycémie limite l’impact bénéfique de la correction de CFTR sur la réparation épithéliale. Dans un second temps, nous avons évalué l’impact de l’infection à Pseudomonas aeruginosa sur le CFTR, qui tient un rôle important dans la fonctionnalité de l’épithélium des voies aériennes non-FK. Nous avons noté que l’expression du CFTR ainsi que sa fonction sont réduites par l’exposition aux produits bactériens dans les cellules non-FK. De plus, ces exoproduits compromettent la maturation du CFTR muté par les correcteurs ainsi que leur bénéfice sur la réparation de l’épithélium FK. Finalement, nous avons testé différentes combinaisons de composés correcteurs et potentiateurs de CFTR afin de déterminer quelle stratégie serait la plus efficace afin de favoriser la réparation épithéliale bronchique FK malgré la présence d’infection.

Evaluation Of The Radiopacity Of Esthetic Root Canal Posts.

The radiopacity of esthetic root canal posts may impair the assessment of their fit to the root canal when using radiographic images. This study determined in vitro the radiographic density of esthetic root canal posts using digital images. Thirty-six roots of human maxillary canines were assigned to six groups (N=6 per group): Reforpost (RP); Aestheti-Plus (AP); Reforpost MIX (RPM); D.T. Light Post (LP); Reforpost Radiopaque (RPR); and White Post DC (WP). Standardized digital images of the posts were obtained in different conditions: outside the root canal, inside the canal before and after cementation using luting material, and with a tissue simulator. Analysis of variance was used to compare the radiopacity mean values among the posts outside the root canal and among the posts under the other conditions, and the t unpaired test to compare the radiopacity between the posts and the dentin, and between the posts and the root canal space. There was no statistically significant difference in radiopacity between RP and RPM, and LP and WP. AP posts showed radiopacity values significantly lower than those for dentin. No statistically significant difference was found between posts (RP and AP) and the root canal space. A statistically significant difference was observed between the luted and non-luted posts; additionally, luted posts with and without tissue simulator showed no significant differences. Most of the cement-luted posts analyzed in this study were distinguishable from the density of adjacent dentin surfaces, allowing radiographic confirmation of the fit of the post in the canal. The success of using esthetic root canal posts depends mainly on the fit of the post within the canal.[1] The radiopacity of a post allows for radiographic imaging to be used to determine the fit, an important factor in a clinical perspective.

Does The Reciproc File Remove Root Canal Bacteria And Endotoxins As Effectively As Multifile Rotary Systems?

To evaluate the effectiveness of Reciproc for the removal of cultivable bacteria and endotoxins from root canals in comparison with multifile rotary systems. The root canals of forty human single-rooted mandibular pre-molars were contaminated with an Escherichia coli suspension for 21 days and randomly assigned to four groups according to the instrumentation system: GI - Reciproc (VDW); GII - Mtwo (VDW); GIII - ProTaper Universal (Dentsply Maillefer); and GIV -FKG Race(™) (FKG Dentaire) (n = 10 per group). Bacterial and endotoxin samples were taken with a sterile/apyrogenic paper point before (s1) and after instrumentation (s2). Culture techniques determined the colony-forming units (CFU) and the Limulus Amebocyte Lysate assay was used for endotoxin quantification. Results were submitted to paired t-test and anova. At s1, bacteria and endotoxins were recovered in 100% of the root canals investigated (40/40). After instrumentation, all systems were associated with a highly significant reduction of the bacterial load and endotoxin levels, respectively: GI - Reciproc (99.34% and 91.69%); GII - Mtwo (99.86% and 83.11%); GIII - ProTaper (99.93% and 78.56%) and GIV - FKG Race(™) (99.99% and 82.52%) (P < 0.001). No statistical difference were found amongst the instrumentation systems regarding bacteria and endotoxin removal (P > 0.01). The reciprocating single file, Reciproc, was as effective as the multifile rotary systems for the removal of bacteria and endotoxins from root canals.

Root Canal Content From Primary Endodontic Infection And Upregulation Of Gelatinases In Fibroblast Cells.

To investigate endotoxin levels from primary endodontic infections before and after chemomechanical preparation (CMP) and to determine their antigenicity against 3T3 fibroblasts through gelatinolytic activity of matrix metalloproteinases (MMPs). Twenty-four root canals with primary endodontic infection and apical periodontitis were selected. Samples were collected using paper points before (S1) and after chemomechanical preparation (CMP) (S2). The limulus amebocyte lysate assay was used for endotoxin measurement. Fibroblasts were stimulated with root canal contents for 24 h. Supernatants of cell cultures stimulated with root canal contents were collected after 24 h to determine the levels of MMP-2 and MMP-9 gelatinolytic activity using the zymography technique. Friedman and Wilcoxon tests were used to compare the amount of endotoxin before (S1) and after CMP (S2) (P < 0.05). Data obtained from gelatinolytic activity were analysed using anova and Tukey's tests (P < 0.05). Endotoxin was recovered in 100% of the samples. There was a significant reduction in endotoxin levels after CMP (P < 0.05). A correlation was found between the levels of endotoxins and MMP-2 expression (P < 0.05). Root canal contents of initial samples (S1) induced significantly greater MMP-2 expression by fibroblasts when compared to S2 and the nonstimulated group (P < 0.05). No gelatinolytic activity of MMP-9 was observed in S1, S2 and control group. Root canal contents from primary endodontic infections had gelatinolytic activity for MMP-2. Moreover, CMP was effective in reducing endotoxin levels and their antigenicity against fibroblasts on gelatinolytic activity.