Production and characterization of an alcoholic fermented beverage from grape must and beer wort

Mestrado Vinifera Euromaster - Instituto Superior de Agronomia - UL

Studies on the wine spoilage yeast Brettanomyces bruxellensis: 4-ethylphenol production and improved detection

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Conversion of hydroxycinnamic acids into volatile phenols in a synthetic medium and in red wine by Dekkera bruxellensis

The conversion of p-coumaric acid, ferulic acid, and caffeic acid into 4-ethylphenol, 4-ethylguaiacol and 4-ethylcatechol was studied in Dekkera bruxellensis ISA 1791 under defined conditions in a synthetic medium and in a red wine. Liquid chromatography (HPLC-DAD) was used to quantify the phenolic acids, and gas chromatography (GC) coupled to a FID detector was used to quantify volatile phenols using a novel analytical methodology that does not require sample derivatization. Identification was achieved by gas chromatography-mass detection (GC-MS). The results show that phenolic acids concentration decreases while volatile phenols concentration increases. The proportion of caffeic acid taken up by Dekkera bruxellensis is lower than that for p-coumaric or ferulic acid; therefore less 4-ethylcatechol is formed. More important, 4-ethylcathecol synthesis by Dekkera bruxellensis in wine has never been demonstrated so far. These results contribute decisively to a better understanding of the origin of the volatile phenols in wines. The accumulation of these compounds in wine is nowadays regarded as one of the key factors of quality control.

Avaliação da contaminação conjunta de Dekkera bruxellensis e Lactobacillus fermentum sobre a fermentação alcoólica: efeito do substrato e formas de controle

As contaminações por leveduras selvagens e por bactérias no processo de produção de etanol combustível no Brasil causam prejuízos ao rendimento fermentativo e aumento de custos pelo uso de biocidas. No entanto, poucos estudos tem focado no efeito das contaminações conjuntas de leveduras selvagens e bactérias e as possíveis interações entre os micro-organismos, especialmente em função dos diferentes substratos de fermentação e das formas de controle. Este trabalho teve por objetivos verificar o efeito do substrato (caldo de cana e melaço) sobre o desenvolvimento das contaminações pela levedura da espécie Dekkera bruxellensis e pela bactéria Lactobacillus fermentum, em co-culturas com Saccharomyces cerevisiae (linhagem industrial PE-2) e possíveis formas de controle do crescimento dos contaminantes (pelo uso de metabissulfito de potássio e adição de etanol ao tratamento ácido) sem afetar a levedura do processo. Os testes foram realizados em condições de crescimento (substrato com 4 °Brix, culturas agitadas) e fermentação com reciclo celular (substrato com 16 °Brix, culturas estáticas). Houve interação entre as leveduras e a bactéria quando crescidas em caldo de cana 4 °Brix. A levedura industrial não foi afetada pela presença dos micro-organismos contaminantes, no entanto, para D. bruxellensis a presença de L. fermentum interferiu positivamente no crescimento, com aumento no número de UFC, e consequentemente inibição do crescimento da bactéria. Em melaço, houve um estímulo ao crescimento de L. fermentum quando em co-cultura com S. cerevisiae. Houve influência das contaminações sobre os parâmetros avaliados no experimento (pH, açúcar redutor total, etanol, glicerol e crescimento das células) e a contaminação conjunta de L. fermentum e D. bruxellensis potencializou o efeito das contaminações pelos micro-organismos isoladamente, tanto em caldo quanto em melaço. A adição de 13% de etanol à solução de ácido sulfúrico pH 2,0 no tratamento celular resultou em uma diminuição significativa no número de UFC de D. bruxellensis (entre 90-99%). A levedura PE-2 foi pouco afetada pelo tratamento proposto. A bactéria L. fermentum teve seu crescimento afetado em todas as combinações testadas. Como os experimentos foram feitos em co-culturas, verificouse que pode haver influência de um micro-organismo sobre a viabilidade do outro, dependendo da reação ao tratamento ácido-etanol. O metabissulfito de potássio (MBP), no intervalo entre 200-400 mg/L, foi eficaz para controlar o crescimento de D. bruxellensis dependendo do meio de cultura e linhagem. Quando adicionado (250 mg/L) à solução ácida (pH 2,0) no tratamento celular, um efeito significativo foi observado nas culturas mistas, pois ocorreu a inativação do SO2 pela S. cerevisiae e uma provável proteção das células de D. bruxellensis, não sendo essa levedura prejudicada pelo MBP. A resposta fisiológica de S. cerevisiae na presença de MBP pode explicar a diminuição significativa na produção de etanol. Quando o MBP foi adicionado ao meio de fermentação, resultou no controle da D. bruxellensis mas não em sua morte, com efeito menos intensivo sobre a eficiência fermentativa. Em cocultura com a adição de MBP, a eficiência fermentativa foi significativamente menor do que na ausência de MBP.

Aegidii Francisci de Gottignies bruxellensis è Societate Iesu .... Logistica idea speculatiue & practice declarata : Liber primus.

Mode of access: Internet.

Aegidii Francisci de Gottignies bruxellensis è Societate Iesu .... Epistolarum mathematicarum : liber primus ; Ad illustrississimum ... Liuium Odescalcum ...

Mode of access: Internet.

Flora Bruxellensis : exhibens characteres generum et specierum plantarum circum Bruxellas crescentium, secundum Linneum disposita, cum synonymis auctorum, cui additur lexicon botanicon, in quo termini artis breviter exponuntur /

Index: p. [339]-348.

Textus abbreviatus in cursum totius physices et metaphysicorum Aristotelis. [With the Quaestiones of Georgius Bruxellensis]

Hain. Repertorium (with Coppingers Supplement) 3971; Gesamtkat. d. Wiegendr. 5543; Brit. Mus. Cat. (XV cent) VIII, p. 135 (IB. 40128)

Complete DNA sequence of Kuraishia capsulata illustrates novel genomic features among budding yeasts (Saccharomycotina)

The numerous yeast genome sequences presently available provide a rich source of information for functional as well as evolutionary genomics but unequally cover the large phylogenetic diversity of extant yeasts. We present here the complete sequence of the nuclear genome of the haploid-type strain of Kuraishia capsulata (CBS1993(T)), a nitrate-assimilating Saccharomycetales of uncertain taxonomy, isolated from tunnels of insect larvae underneath coniferous barks and characterized by its copious production of extracellular polysaccharides. The sequence is composed of seven scaffolds, one per chromosome, totaling 11.4 Mb and containing 6,029 protein-coding genes, ~13.5% of which being interrupted by introns. This GC-rich yeast genome (45.7%) appears phylogenetically related with the few other nitrate-assimilating yeasts sequenced so far, Ogataea polymorpha, O. parapolymorpha, and Dekkera bruxellensis, with which it shares a very reduced number of tRNA genes, a novel tRNA sparing strategy, and a common nitrate assimilation cluster, three specific features to this group of yeasts. Centromeres were recognized in GC-poor troughs of each scaffold. The strain bears MAT alpha genes at a single MAT locus and presents a significant degree of conservation with Saccharomyces cerevisiae genes, suggesting that it can perform sexual cycles in nature, although genes involved in meiosis were not all recognized. The complete absence of conservation of synteny between K. capsulata and any other yeast genome described so far, including the three other nitrate-assimilating species, validates the interest of this species for long-range evolutionary genomic studies among Saccharomycotina yeasts.

« Recueil de toutes sortes de pieces differentes, tant vieilles que nouvelles, en prose et en vers », le tout écrit de la main de « Philippe Harduyn de Saint Jacques », médecin.

Contient : 1 « Nomina corum omnium, quae in HIERONYMI libro de scriptoribus ecclesiasticis continentur », extraits ; 2 « GENNADIUS in virorum illustrium catalogo. Cyrus, genere Alexandrinus, arte medicus et ex philosopho monachus, vir dicendi peritus, scripsit adversus Nestorem,... ». En latin ; 3 « De medicis ». En latin ; 4 Notice sur « sainte Collette », religieuse et réformatrice de l'ordre de Sainte-Claire. « Environ l'an 1435 vivoit une femme sainte et devote... » ; 5 « Satyra in questiones quodlibeticas F. Garassii, jussu et auctoritate supremi senatus laceratas et combustas, 17 januarii 1626 » ; 6 « Scotinographie de PIERRES DE VERIGNY » ; 7 « Extraict du tome second de l'Affrique, titre des licornes que l'on trouve à l'environ de Mecca, etc. Du costé du temple y a une grande cour fermée de murailles, où nous veismes deux licorne[s] ... » ; 8 Note concernant Antonin et Sévère. Tirée d'Hérodien ; 9 Quatre vers latins sur Hippocrate et Apelle ; 10 Traduction en quatre vers grecs des vers latins ci-dessus indiqués. Au-dessous on lit, comme nom d'auteur : « M. WEYMS, Flamand » ; 11 « Harengue prononcée par Mr le premier president DE VERDUN devant le roy [Louis XIII] au pallais, le mardy 18 fevrier 1620, en presence de M. de Luines » ; 12 « Versus quos papa misit imperatori cum uno agnus Dei, et hoc pro munere magno ; 13 « Autres vers » ; 14 « Que S. Pierre n'a point esté à Rome, disent les heretiques ». Discussion de cette proposition ; 15 Vers « à l'honneur de la Vierge » (fol. 6) ; 16 « L'adjuration et demandes du catholique à Mrs les cardinaux, prelats, confesseurs et ausmoniers du roy, devant et apres le cruel massacre de Mrs le duc et le cardinal de Guise freres, et le tout à la face des estats, à Blois, du XXIIIe et XXIIIIe decembre 1588 » ; 17 « Pour sçavoir l'an de bissexte, le nombre d'or, l'epacte et le jour de la nouvelle lune », note ; 18 « Extraict du traicté de paix entre le roy et l'empereur, à Cambray (1529), par lequel appert qu'il n'y a pas d'aubins d'un costé ny d'aultre » ; 19 Notices sur « Edouard, roy d'Angleterre... Robert, surnommé Courbecuisse,... Guillaume le Bastard, roy d'Angleterre... Guillaume, surnommé le Roux,... Robert, duc de Normandie... Guillaume le Roux, roy d'Angleterre... Henry,... roy d'Angleterre... Mathilde, fille du roy Henry d'Angleterre... Henry d'Angleterre » ; 20 « De Jesabelis anglicae parricidiis ad piae reginae Mariae Stuardae manes carmen » ; 21 « Sonnet » contre la reine Élisabeth d'Angleterre ; 22 « Ad praeceptorem doctissimum dominum Sanjacobaeum epigramma » ; 23 « Ad suum praeceptorem ANT. SCIPIO DE JOYEUSE flebile carmen » ; 24 « Epigramma » ; 25 « Ad charissimum et apprime eruditum praeceptorem HENRICI DE JOYEUSE carmen flebile » ; 26 « Ad eundem epigramma » ; 27 « Elegia » ; 28 « Ad praeceptorem observandissimum GEORGII GAUDIOSANI flebile carmen » ; 29 « In clarissimi domini Sanjacobaei Harduini, doctoris medici, nuptiarum solennia epithalamium » ; 30 « Epithalame ou chant nuptial sur le mariage de noble homme Me Philippe Harduyn de S. Jacques, docteur en medecine, et dame Catherine Gervais, son espouse... mariez à Paris, le 13 janvier 1587, pièce en vers ; 31 « Ad convivas » ; 32 « Clarissimo spectatissimoque viro domino a Sancto Jacobo S. D. PETRUS DICUNOWART » ; 33 « Sonnet » ; 34 « Responce de la noblesse aux harangues des lieutenans deputez du tiers estat » ; 35 « Quatrain » ; 36 « Sixain » ; 37 « Autre » sixain ; 38 « Epigramma » ; 39 « Huictain » ; 40 « Quatrain » ; 41 « Huictain » ; 42 « Autre quatrain » ; 43 « Vents ordinaires au pays de Congo » ; 44 « Le royaume de Monomotapa », note ; 45 « Nom du Prete-Jan », note ; 46 « Prophetie d'un jacobin, traduite en françois, tirée et extraite d'un livre fort ancien, escript à la main, en langue flamande » ; 47 « Pour la statue du roy Henry le Grand, qui est sur le Pont Neuf » ; 48 « Pour le pont », vers latins ; 49 « Vita sanctae Odiliae » ; 50 « Vers chronographe sur la mort de Barnevelt » ; 51 « Autres vers » en latin, « faict[s] sur le synode tenu à Dordrecht, l'an 1619 ; 52 « Devise de la reine mere Catherine de Medicis, apres la mort de son mary, le roy Henry II ; 53 Citation extraite de « GERARDUS DORN, in epistola dedicatoria », placée en tête de l'ouvrage de Paracelse qui a pour titre : « Aurora, sive thesaurus philosophorum ». En latin ; 54 « IAMBLICHUS de mysteriis, statim initio, ex Marsilii Ficini versione. Mercurius praeest sapientiae et eloquio... ». En latin ; 55 « Epigramme faict sur la mort de Mr de Luynes, connestable de France, qui est mort de la peste devant Monheurt, soubz le nom de Sabinus » ; 56 « Plaintes de l'espée de Mr le connestable de Luynes » ; 57 « Sur le Te Deum chanté pour la prise de Montheur (sic) et la mort du connestable, epigramme » ; 58 « Autre sur la mesme mort » ; 59 « Autre » ; 60 « Autre » ; 61 « Tombeau du connestable, 1622 » ; 62 « Sur la vanité de Monsigot, secretaire du connestable, epigramme » ; 63 « Sur sa calotte » ; 64 « Sur sa retraicte de la chambre des comptes » ; 65 « Imperatoris Caroli V elogium, inscriptum velis navis Victoriae, quae rotis imposita et equis tracta, pompam illius funebrem Bruxellis, anno 1558, decoravit, et quotannis, dominica sexta post Pascha, circumducitur in encoeniis ejusdem urbis bruxellensis ». En latin ; 66 « Ejusdem triumphi ordine recensiti ». En latin ; 67 « Ad columnas Herculis » ; 68 « Serenissimi Alberti austriaci, Belgarum principis, cenotaphium ». En latin ; 69 « De Elisabeth, regina Angliae, epigramma ». En latin ; 70 « Aliud, de Roma ». En latin ; 71 « Sur la mort du mareschal d'Ancre » ; 72 « Summission de ceux de la religion pretendue reformée au roy de France et de Navarre Louis XIIIe, dict le Juste, entrant dedans la ville de Montpellier, M.DC.XXII », discours ; 73 « Prophetia S. MALACHIAE, archiepiscopi... ardinacensis... de summis pontificibus » ; 74 « Prophetiae LEONIS, sapientissimi imperatoris, inventae Romae in Vaticana bibliotheca » ; 75 « Apologie pour la Compagnie de Jesus, extraite de la predication du R. P. et docteur F. PIERRE DOZA, religieux de l'ordre S. Dominique, prononcée en l'eglise de la maison professe de la Compagnie de Jesus, en la cité de Valence, le 26 janvier de l'an 1610, pour la beatification du glorieux pere Ignace de Loyola, fondateur de la mesme compagnie; traduite par le Père FRANÇOIS SOLIER, religieux de la Compagnie de Jesus. Imprimé à Poitiers par Antoine Mesnier, imprimeur et libraire ordinaire du roy en l'Université, 1611 » ; 76 « Les muses lanternieres, par LAMY » ; 77 « Epigramme sur le mesme sujet » ; 78 « Sixain » ; 79 Épigramme ; 80 « Autre » ; 81 « Sur la journée du mariage de Madame, soeur du roy, avec le roy d'Angleterre, qu'il pleut tout le jour, l'an 1625 » ; 82 Vers latins ; 83 « Sur l'arrivée du cardinal Barberin, legat en France, l'an 1625 » ; 84 « Le marchand de soye de Paris » ; 85 « Autre pour le mesme marchand » ; 86 « Epitaphe de M. Servin, advocat general du parlement de Paris, et du R. P. Cotton, decedez quasi en mesme temps, en mars de l'an 1626 » ; 87 Vers sur Lucrèce ; 88 « La solitude » ; 89 « La berne » ; 90 « La pluye » ; 91 « Satyre » ; 92 « Hymne du fromage » ; 93 « Voeu à Bacchus » ; 94 Vers ; 95 « La Nuict » ; 96 Vers ; 97 Suite de notes historiques ; Note ; Note sur le partage de 842 et l'origine du nom de Lorraine ; Note sur Baudouin Bras de Fer, comte de Flandre ; Date de l'entrée à Paris de Philippe, archiduc d'Autriche ; Note sur le mariage de Marguerite, soeur de Philippe, archiduc d'Autriche ; Note concernant les papes Alexandre VI, Pie III, Jules II, Leon X ; Note concernant Isabelle, reine d'Espagne, morte en 1506, le mariage du roi d'Espagne Ferdinand, avec la soeur du comte de Foix, la mort dudit roi, en 1515, et celle de Philippe, archiduc d'Autriche, en 1506 ; Note concernant le mariage du roi François Ier et de Claude de France, fille de Louis XII, et celui du roi Louis XII avec Marie, soeur du roi d'Angleterre, Henri VIII ; Note sur le mariage de la veuve du roi Louis XII avec le duc de Suffolk ; Note sur l'origine des derniers ducs de Bourgogne ; Naissances de Louis, duc d'Orléans, et de Jean, duc de Bourgogne ; Mariage de Jean, comte de Nevers, fils de Philippe le Hardi, duc de Bourgogne, avec Marguerite, fille du comte de Hainaut ; Mort de Louis de Masle, comte de Flandre ; Mort de Charles le Mauvais, roi de Navarre ; Notes concernant le titre de Filles de France, les armoiries des princes du sang de France, les reines regentes, le lieu du sacre de plusieurs reines de France ; Notes sur les épithètes dont on accompagne les noms de certaines familles nobles ; Ce que c'est que le « praeteur praetorian » ; Note sur l'origine des Fran çais, la signification de certains noms francs, les pénalités de la loi salique ; Note sur l'antiquité du titre de roi tres chrétien, donné au roi de France ; Que les rois de France sont souverains et indépendants ; Que le titre de reine donne aux femmes quelque chose « de plus auguste que ce que leur sexe ne leur octroye » ; 98 « Voyage de Mr PHILIPPES HARDUIN DE S. JAQUES, pour lors medecin ordinaire des bandes françoises de l'Estat et couronne de France » ; 99 Note concernant la maison de Bourbon ; a « Source de la maison de Bourbon », d'après OLIVIER DE LA MARCHE ; b « Pourquoi la maison de Bourbon quereloit la couronne de France contre la maison de Valois » ; c Tableau généalogique de la descendance de S. Louis ; 100 « Epitaphe de Santarelli et autres de sa cabale » ; 101 « Extraict d'ANTONIUS SANCTARELLUS, de haeresi, schismate, apostasia et sollicitatione in sacramento poenitentiae, et de auctoritate summi pontificis in his delictis puniendis » ; 102 ; 103 « Censura sacrae Facultatis theologiae parisiensis, lata in librum qui inscribitur ANTONII SANCTARELLI e societate Jesu tractatus de haeresi, schismate, apostasia, sollicitatione in sacramento poenitentiae, et de potestate summi pontificis in his delictis puniendis... » ; 104 « Ex libello cui titulus : G. G. R., theologi, ad Ludovicum XIII, Galliae et Navarrae regem Christianissimum, admonitio », extrait ; 105 « Arrest de la cour de parlement, prononcé contre les PP. du college de Clairmont, le 17 mars 1626. Extraict des registres de la cour de parlement » ; 106 « Soubscription des PP. jesuites » ; 107 « Questiones quodlibeticae huic tempori accomodatae, disputandae in antiqua Sorbona parisiensi, mense decembri, diebus saturnalitiis, et dedicatae illustrissimo S. R. E. cardinali de Richelieu, sive de Rupella, negotiorum status in regno Galliae supremo praefecto, anno Domini M. DC. XXV, 13 decemb. mane » ; 108 « Inscrizione dell' arco trionfale di Verua », inscription en latin ; 109 « Ex libello cui titulus : Veritas odiosa, fragmenta varia colloquii Machiavelli et Mercurii, 1626. Ex schedis M. S. RICHARDI ATTONITI, eboracensis, protocancellarii nuper classis anglicancae. Oxonii, apud Gualtherum Mapes, Academiae bidellum » ; 110 « Catalogus librorum mystico-politorum (sic) qui autumnalibus nundinis francofordiensibus anni 1626 in lucem prodibunt » ; 111 « Ex libello cui titulus : Jubilus con foederatorum, alias Nova novorum, in quibus magnae victoriae et laeti terra marique progressus anni 1625 continentur, ad nobilem historicum D. Ferrerium gallum Nemausensium Reipubl. apud christianissimum regem Ludovicum XIII oratorem, editio ultima, ab authore recognita et emendata, M.DC.XXVI » ; 112 « Appendix ad catalogum librorum mystico-politicorum qui proximis nundinis francfurtensibus prodibunt » ; 113 Vers latins, composés à propos de la tentative des jésuites, qui avaient essayé de substituer dans l'almanach la fête de S. Ignace de Loyola à celle de S. Germain, qui se célébrait le 31 juillet ; 114 « Bibliotheca mystica clarissimi viri Ludovici Servini, sex aliis longe ditioribus scilicet Arnaldi, Paschasii, Martyllerii, Hardivillerii, Turgotii et Tarini, in antecessum praemissa... 1626 » ; 115 « Contract de mariage de Henry IV,... roy de France et de Navarre, avec Marguerite de Valois ». 17 août 1572 ; 116-117 Contrats de mariage de Louis XIII avec Anne d'Autriche, et du prince d'Espagne, don Philippe, avec Élisabeth de France. 1612 ; 118 Contrat de mariage de Henri d'Orléans, duc de Longueville, avec Louise de Bourbon. Paris, 5 mars 1617 ; 119 Mémoire « pour l'accompagnement et voyage de Madame jusques à la frontiere, et de la reyne, revenant de lad. frontiere jusques à Bordeaux » ; 120 Mémoire intitulé : « L'homme d'Estat françois vrayment catholique », dédié au roi Louis XIII « par le Sr DE CHIREMONT » ; 121 « Instruction de M. de Schomberg, comte de Nanteuil, conseiller du roy en son conseil d'Estat, lieutenant general de S. M. es pays de Lymosin, haute et basse Marche, pour son voyage d'Allemagne » ; 122 « Cronique de S. Clou » ; 123 « Lettre de Cloris à Lysis » ; 124 « Reponse de Lysis à Cloris » ; 125 « La mouche et le courtisan »

Isolation of culturable yeasts from market wines and evaluation of the 5 center dot 8S-ITS rDNA sequence analysis for identification purposes

Aims: To test the possibility that wines available in the marketplace may contain culturable yeasts and to evaluate the 5.8S-ITS rDNA sequence analysis as adequate means for the identification of isolates. Methods and Results: As a case study, typical Greek wines were surveyed. Sequence analysis of the 5.8S-ITS rDNA was tested for its robustness in species or strain identification. Sixteen isolates could be assigned into the species Brettanomyces bruxellensis, Saccharomyces cerevisiae and Rhodotorula pinicola, whereas four isolates could not be safely identified. B. bruxellensis was the dominant species present in house wines, while non-Saccharomyces sp. were viable in aged wines of high alcohol content. Conclusions: Yeast population depends on postfermentation procedures or storage conditions. Although 5.8S-ITS rDNA sequence analysis is generally a rapid method to identify wine yeast isolates at the species level, or even below that, it may not be sufficient for some genera. Significance and Impact of the Study: This is the first report to show that commercial wines may possess diverse and potentially harmful yeast populations. The knowledge of yeasts able to reside in this niche environment is essential towards integrated quality assurance programmes. For selected species, the 5.8S-ITS rDNA sequence analysis is a rapid and accurate means.

Qualidade microbiológica e ocorrência de leveduras em polpas congeladas de frutas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Estudo do comportamento fisiológico de cepas de leveduras frente às condições do meio de cultivo visando processos de fermentação alcoólica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Entwicklung von molekularen Sonden für die sichere Identifizierung von Hefen der Gattungen Brettanomyces, Dekkera

Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera sind in der Produktion von fermentierten Getränken, insbesondere in der Bier-, Sekt- und Weinherstellung bekannt. Sie können als Schädlingshefen insbesondere durch die Bildung von charakteristischen Sekundärmetaboliten zu einer negativen geschmacklichen Veränderung des Getränks führen. Aufgrund ihres langsamen Wachstums werden diese Hefen bei Routineanalysen mit konventionellen Kultivierungsmethoden leicht übersehen. Ein schneller und eindeutiger Nachweis von Brettanomyces/Dekkera-Hefen ist bis heute problematisch. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode zur sicheren Detektion und Identifizierung aller fünf bekannten Spezies dieser Gattungen entwickelt. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit Cy3-markierten DNA-Sonden ermöglichte einen direkten mikroskopischen Nachweis dieser Mikroorganismen in der Untersuchungsprobe. Im Hinblick auf die Generierung Art-spezifischer Sonden wurden die ribosomalen Gen-Cluster der verschiedenen Spezies hinsichtlich potentieller Zielregionen analysiert. Eine signifikante Steigerung des Sonden-vermittelten Fluoreszenz-Signals konnte durch die Anwendung eines neuen Sonden-Konzepts (Gemeinschafts-Sonden) auf hochvariable Bereichen der 26S rRNAs, unter Berücksichtigung ihrer Sekundärstrukturen, realisiert werden. Die Untersuchung der regionalen Verbreitung dieser Hefen in der Weinbauregion Rheinhessen ergab, dass bei 15 % der untersuchten Winzerbetriebe D. bruxellensis in Rotweinproben vorhanden war. Insgesamt konnten bei den Probenuntersuchungen aus 299 Weinen 44 D. bruxellensis-Stämme isoliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden darüber hinaus verschiedene Vitalitätsfärbungen hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit auf Brettanomyces/Dekkera evaluiert und eine Differenzierung dieser Hefen durch einen physiologischen Mikrotiterplatten-Test (Biolog, USA) überprüft.

Entwicklung und Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Art- und Stamm-Identifizierung pro- und eukaryotischer Organismen

Das Wachstum von Milchsäurebakterien-Arten der Gattungen Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc während der Weinfermentation kann durch die Bildung verschiedener Stoffwechselprodukte zu Weinfehlern führen. Um rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen zu können und einem Weinverderb vorzubeugen, bedarf es geeigneter Identifizierungsmethoden. Klassische mikrobiologische Methoden reichen oft nicht aus, um Mikroorganismen auf Art- und Stammniveau gezielt zu identifizieren. Wegen ihrer schnellen Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit sind molekularbiologische Identifizierungsmethoden zur Kontrolle der mikrobiellen Flora während der Lebensmittelfermentierung in der heutigen Zeit unabdingbar. In der vorliegenden Forschungsarbeit wurden die 23S rRNA-Gensequenzen von neun Pediococcus-Typstämmen sequenziert, analysiert und phylogenetische Analysen durchgeführt. Zur Art-Identifizierung der Pediokokken wurden PCR-Primer generiert und ein Multiplex PCR System entwickelt, mit dem alle typischen Arten simultan in einer Reaktion nachgewiesen werden konnten. Die Ergebnisse der Multiplex PCR-Identifizierung von 62 Pediococcus-Stämmen aus Kulturensammlungen und 47 neu isolierten Stämmen aus Wein zeigten, dass einige Stämme unter falschen Artnamen hinterlegt waren, und dass P. parvulus im Weinanbaugebiet Rheinhessen weit verbreitet war. Die Fähigkeit der Pediococcus-Stämme zur Exopolysaccharid-Synthese wurde durch den Nachweis zweier Gene überprüft. Auf Basis der 23S rDNA-Sequenzen wurden rRNA-Sekundärstrukturen mit der neu entwickelten Software Structure Star generiert, die zum Auffinden von Zielbereichen für fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden geeignet waren. Die Sequenzunterschiede zwischen den Pediococcus-Arten reichten aus, um zwei Gruppen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung differenzieren zu können. Die Verwendung unmarkierter Helfer-sonden verbesserte die Zugänglichkeit der Sonden an die rRNA, wodurch das Fluoreszenz-Signal verstärkt wurde. Um Milchsäurebakterien durch Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese differenzieren zu können, wurden Primer entwickelt, mit denen ein hochvariabler 23S rDNA-Bereich amplifiziert werden konnte. Die Nested Specifically Amplified Polymorphic DNA (nSAPD)-PCR wurde in der vorliegenden Arbeit zur Art- und Stamm-Differenzierung pro- und eukaryotischer Organismen angewandt. Es wurden vor allem weinrelevante Milchsäurebakterien der Gattungen Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc und Hefen der Gattungen Dekkera / Brettanomyces und Saccharomyces untersucht. Die Cluster-Analyse der Pediococcus-Typstämme führte zu einer unterschiedlichen Baum-Topologie im Vergleich zum phylogenetischen 23S rDNA-Stammbaum. Die Verwandtschaftsverhältnisse der untersuchten O. oeni-Stämme aus Starterkulturen konnten in Bezug auf eine frühere Cluster-Analyse reproduziert werden. Die Untersuchung von 40 B. bruxellensis-Stämmen aus rheinhessischen Weinproben zeigte eine Gruppierung der Stämme gemäß dem Ort der Probennahme. Beim Vergleich der Verwandtschaftsverhältnisse von Stämmen der Arten P. parvulus und B. bruxellensis, die aus denselben Weinproben isoliert wurden, konnte eine hohe Übereinstimmung der beiden Baum-Topologien beobachtet werden. Anhand der SAPD-PCR Untersuchung von Sekthefen aus Starterkulturen konnten alle Stämme der Art S. cerevisiae zugeordnet werden. Die nSAPD-PCR war darüber hinaus geeignet, um höhere Eukaryoten wie Weinreben zu differenzieren und es konnten die Verwandtschaftsverhältnisse von Mäusen und menschlichen Individuen durch Cluster-Analysen nachvollzogen werden. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik wurden (n)SAPD-Marker in SCAR-Marker konvertiert. Die neu generierten SCAR-Primer konnten zur simultanen Art-Identifizierung von sieben weinschädlichen Milchsäurebakterien in einer Multiplex PCR erfolgreich eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit entwickelten molekularbiologischen Identifizierungsmethoden können zum Beispiel in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle Anwendung finden.