Co-cultura de embriões humanos em células vero e transferência em fase de blastocisto

Objetivos: determinar se o dia da transferência ou o estágio em que o embrião é transferido interferem nas taxas de gravidez e implantação. Métodos: cento e sete pacientes tiveram seus oócitos aspirados e submetidos à fertilização in vitro. Os embriões foram co-cultivados em células Vero e transferidos no dia 3 ou dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica. Resultados: a taxa de implantação dos embriões transferidos no dia 5 foi significativamente maior que quando os embriões eram transferidos no dia 3, mas as taxas de gravidez não variaram. Observou-se uma diferença significativa nas taxas de gravidez quando se comparou o estágio em que o embrião era transferido, obtendo-se 70,6% de gravidez quando se transferiam blastocistos expandidos e 20,0% e 10,5% quando eram transferidos blastocistos iniciais ou mórulas, respectivamente. Conclusões: as taxas de implantação e gravidez são significativamente aumentadas quando se transferem embriões em estágio de blastocisto expandido, mas os meios e condições de cultura de que dispomos no momento ainda são insuficientes para nos fornecer uma taxa satisfatória de embriões neste estágio.

Transferência de blastocisto após descongelamento de embriões em mórula resultando em gestação gemelar: relato de caso

A criopreservação de embriões em estágios mais tardios do desenvolvimento parece apresentar resultados satisfatórios. Com o objetivo de melhor testar a sobrevivência e o desenvolvimento de embriões, os mesmos foram criopreservados e descongelados em estadio de mórula ou blastocisto e deixados em cultura para que pudesse ser avaliada sua evolução natural. Dos 2 blastocistos e 5 mórulas congelados, 4 mórulas sobreviveram ao descongelamento, tendo sido transferidas em estadio de blastocisto, 24 horas depois. A transferência, realizada em paciente jovem, segundo casamento de homem vasectomizado há dez anos, resultou em gestação gemelar. O descongelamento de embriões em estadio de mórula e a observação in vitro da retomada de seu desenvolvimento até o estadio de blastocisto fornecem um parâmetro adicional na avaliação da qualidade do embrião e, provavelmente, melhore as taxas de gravidez.

Cultura de Embriões até o Estágio de Blastocisto: Comparação entre o Uso de Meios Seqüenciais e de Co-Cultura

Objetivos: comparar o desenvolvimento embrionário com o uso de dois métodos diferentes de cultura (meio seqüencial ou co-cultura em células Vero). Métodos: foram incluídas 110 pacientes que tiveram ovócitos aspirados e submetidos à fertilização in vitro. Metade das pacientes teve seus embriões cultivados juntamente com células Vero e a outra metade em meio seqüencial G1:2/G2:2. Os embriões foram transferidos no dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica, verificando-se a taxa de blastulação. A gravidez foi definida por meio de ultra-sonografia, verificando-se batimento cardíaco após a 13ª semana pós-transferência. Resultados: a taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 15,9% e 14% com células Vero e G1:2/G2:2, respectivamente. Com células Vero 36,0% das pacientes engravidaram com taxa de implantação de 18,9%. Quando se utilizou G1:2/G2:2 as taxas de gravidez e implantação foram 28,9% e 14,9%, respectivamente. Em apenas 17 casos obtiveram-se blastocistos após co-cultivo em células Vero, apresentando 76,5% de taxa de gravidez e 63,0% de implantação. Quando o cultivo foi em G1/G2 21 pacientes apresentaram blastocistos e as taxas de gravidez e implantação foram de 57,1 e 76,0%, respectivamente. Conclusão: não houve diferença significativa entre as taxas de gravidez ou implantação nos 2 tipos de cultivo. Nos casos em que blastocistos expandidos foram transferidos, as taxas de implantação e gravidez aumentaram com ambos os tipos de cultivo. Nestas pacientes, independente do tipo de cultivo utilizado, um número maior de ovócitos foi obtido, o que nos leva a pensar que não apenas as condições de cultura influenciam as taxas de implantação e gravidez, mas a qualidade dos óvulos também é importante, pois as "boas respondedoras" tiveram melhores resultados.

Geração de blastocisto quimérico pela agregação de trofectoderme com a massa celular interna ou com células iPS

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Farmacologia) - IBB

Efeito do número da passagem e do gênero das células doadoras de núcleo no desenvolvimento de bovinos produzidos por transferência nuclear

Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito do número da passagem e do sexo das células doadoras de núcleo no desenvolvimento embrionário e fetal após transferência nuclear. Para isso, oócitos bovinos foram maturados, enucleados e reconstruídos com células somáticas de animal adulto. Após a fusão e ativação química, os zigotos reconstituídos foram cultivados em Charles Rosenkranz 2 (CR2) com monocamada de células da granulosa a 38,8ºC em atmosfera umidificada a 5% de CO2 em ar, durante sete dias, e transferidos para receptoras sincronizadas. As taxas de clivagem e desenvolvimento a blastocisto de embriões reconstruídos com células cultivadas por tempo maior foram inferiores às obtidas com os demais tempos de cultivo. Além disso, os blastocistos produzidos não resultaram no desenvolvimento de uma gestação a termo. Embora a taxa de clivagem em embriões fêmeas tenha sido maior, o número de embriões que atingiram o estádio de blastocisto foi maior nos embriões machos. No período gestacional, fêmeas apresentaram maior taxa de aborto entre 90 e 120 dias de gestação. Esses resultados indicam que células doadoras de núcleos cultivados por longos períodos dificultam a produção de blastocistos e aumentam as chances de perdas durante a gestação. Embriões clonados machos têm maior competência para se desenvolver a blastocisto e resultam em menor taxa de perda gestacional.

Produção in vitro de embriões de ovinos: uma visão crítica do método e de seu resultado a campo

A metodologia de produção in vitro de embriões de ovinos implica no desenvolvimento de meios de maturação, fertilização e cultivo que permitam aumentar a taxa de clivagem e desenvolvimento, tanto para o investimento biotecnológico em programas comerciais, quanto para sua utilização em clonagem e transgenia dessa espécie animal. Do ponto de vista da pesquisa, os ovócitos podem ser obtidos pelas técnicas de punção e slicing a partir de ovários oriundos de matadouros, ou através de aspiração folicular por laparoscopia. Como vantagem, este método permite o uso de uma mesma doadora estimulada hormonialmente em intervalos periódicos, mantida sob rigoroso controle sanitário, o que é de vital importância para a produção de biofármacos em programas que utilisem os ovinos como modelo biológico. Por outro lado, em nosso país a demanda pela multiplicação de animais de alto valor genético, seja pela produtividade ou pelo elevado valor comercial dos mesmos, impõe o desenvolvimento, adaptação e otimização das diferentes metodologias desenvolvidas ao longo dos ultimos anos em laboratórios de referência mundiais. Nesse contexto, cresce de importância o perfeito conhecimento da fisiologia dessa espécie e das raças criadas em nosso país, e da problemática da produção in vitro de seus embriões. Respeitando essas premissas, gerar o desenvolvimento de protocolos que permitam não apenas aumentar a população de ovócitos passíveis de maturação in vitro, mas de sua competência ao desenvolvimento ao estágio de blastocisto, ou, alternativamente, sua transferência a receptoras em estágios precoces do desenvolvimento, evitando assim as conhecidas perdas durante o desenvolvimento in vitro, e o baixo percentual de gestações que chegam a termo, com cordeiro saudáveis. Trata-se de um desafio, que já apresenta os primeiros resultados em nosso país, tanto na produção comercial de embriões produzidos in vitro, quanto em programas de clonagem e transgenia.

Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción. In vitro Production of Transgenic Bovine Embryos using Intracitoplasmic Sperm Injection (ICSI) and Restriction Enzymes

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas. Genetic engineering and reprogrammed organisms represent the new biotechnological frontiers which will make possible to generate animals with precise genetic modifications for agricultural and biomedical applications. Current methods used to generate genetically modified large animals, lay behind those used in laboratory animals, specially the mouse. Therefore, we seek to develop and optimize protocols to produce transgenic bovine embryos through the use of a non-viral vector. The strategy involves the simultaneous presence inside the cell of a restriction enzyme (I-SceI) and a transgene (carrying cassettes for a fluorescent protein -ZsGreen1- and neomycin phosphotransferase) flanked by restriction sites for the endonuclease. We plan to develop an alternative approach to generate transgenic bovine embryos by coinjecting the transgene flanked by I-SceI restriction sites plus the enzyme I-SceI along with the spermatozoon during the technique known as intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Embryos will be cultured in vitro and inspected daily with a fluorescence microscope to characterize transgene expression. Embryos that reach the blastocyst stage and express the transgene will be surgically transfer to the uterus of a synchronized ewe. After 7 days, the embryos will be flushed out the ovine uterus and transported to the laboratory to determine the number of integration sites and transgene copies by Southern blot. We anticipate that results from this research will set the stage for the development of efficient strategies to achieve precise genetic modifications in large domestic animals for future biotechnological applications.

Análisis comparativo de tres técnicas de derivación de células madre

Las células madre embrionarias (Embryonic Stem Cells; ESC) son células pluripotentes que presentan la capacidad de dividirse indefinidamente a la vez que mantienen la habilidad para diferenciarse a cualquier tipo celular. Aunque de manera rutinaria se derivan a partir de la masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto, también pueden derivarse a partir de embriones en estadios precompactacionales y de embriones reconstruidos por procesos de transferencia nuclear. Debido a que durante el desarrollo embrionario temprano, momento en el que se derivan las ESC, tienen lugar profundos cambios de metilación en el genoma, tanto la derivación como el cultivo se consagran como técnicas que pueden alterar los patrones de metilación en genes regulados por impronta genómica. Con el objetivo de analizar la estabilidad epigenética de embriones preimplantacionales y ESC murinas, en este trabajo se ha optimizado un protocolo de anàlisis de los niveles de metilación mediante pirosecuenciación. Para ello se han seleccionado tres genes regulados por impronta genómica (H19/Igf2, Snrpn and Peg3), dos genes relacionados con el mantenimiento de pluripotencia en ESC (Oct4, Nanog y Sox2) y dos genes marcadores de diferenciación temprana (Cdx2 y Gata6). Nuestros resultados muestran que algunos grupos de embriones preimplantacionales presentan una hipo e hipermetilación en las regiones diferencialmente metiladas (Differentially Methylated Regions, DMRs) de los genes Snrpn y Peg3. Además, la línea de ESC analizada presentó anomalías en los tres genes regulados por impronta genómica. No obstante, el hecho de que esta línea fuera inestable a nivel cariotípico no permite establecer una relación entre el cultivo in vitro o la técnica de derivación y la inestabilidad epigenética demostrada. Por todo esto, parece pertinente analizar tanto la integridad epigenética como la estabilidad cromosómica de ESC antes de proceder a realizar ensayos clínicos en humanos.

Efeito de concentração espermática e período de incubação oócitoespermatozóides na fecundação in vitro em bovinos da raça Gir

Avaliou-se o efeito de concentrações espermáticas e períodos de incubação na fecundação in vitro com sêmen de touros Gir (Bos indicus). Oócitos maturados in vitro foram fecundados com sêmen de dois touros, nas concentrações de 1, 2 ou 4x10(6) espermatozóides/mL, por 12 ou 18 horas, e avaliada a taxa de fecundação e polispermia. Posteriormente, foi avaliada a taxa de clivagem com 72 horas e de blastocisto no oitavo dia pósfecundação. Um segundo experimento verificou o efeito de 1, 2 e 4x10(6) espermatozóides/mL por 18 horas, utilizando sêmen de três touros separadamente, bem como o efeito de 12 e 18 horas de incubação, na concentração de 1 a 2x10(6) espermatozóides/mL. Observou-se maior (P<0,05) polispermia na concentração de 4x10(6) espermatozóides/mL e que a associação dessa concentração com 18 horas aumentou a taxa de clivagem (P<0,05). No segundo experimento, o aumento do período de incubação melhorou (P<0,05) a taxa de clivagem para um dos touros e, quando comparados entre si, os animais produziram taxa de clivagem e de blastocistos diferentes (P<0,05) em uma mesma concentração ou período de incubação. Os resultados revelaram que a polispermia é o principal efeito do aumento da concentração espermática e que a eficiência entre touros na fecundação in vitro é dependente da concentração e período de incubação.

Avaliação do Desenvolvimento de Embriões Bovinos Pós-Biópsia: um Modelo para Treinamento

Objetivo: montar um protocolo animal para estudo e treinamento em biópsia embrionária. Métodos: ovários de vaca obtidos em abatedouro eram transportados ao laboratório onde os oócitos aspirados eram maturados. Posteriormente eram submetidos à fertilização in vitro. No dia 5 pós-fertilização, os embriões eram biopsiados, com a abertura da zona pelúcida realizada mediante lâmina de corte ajustada ao microscópio óptico. Após abertura da zona pelúcida 1 ou 2 blastômeros eram removidos dos embriões. Após a biópsia, os embriões permaneciam em co-cultivo por mais três dias. Ao final deste tempo, o desenvolvimento dos embriões era avaliado e comparado ao do grupo controle por meio de estudo morfológico e contagem do número de células, usando coloração específica para núcleos. Resultados: dos 57 embriões biopsiados, 40 atingiram o estágio de blastocisto (70,2%) e em 11 foi observado o "hatching" (27,5%). No grupo controle obtiveram-se 42 blastocistos (73,7%) e, destes, 11 chegaram a "hatching" (26,2%). Após contagem do número de células, observou-se que não houve diferença estatisticamente significante entre os 2 grupos. Conclusão: podemos verificar por meio dos resultados que o protocolo proposto foi tecnicamente viável, além de fornecer bom número de embriões, pela facilidade de obtenção de oócitos bovinos, podendo ser adotado para treinamento.

Desenvolvimento embrionário em ratas tratadas com tacrolimus durante a fase de pré-implantação

OBJETIVO: avaliar a toxicidade do tacrolimus sobre o desenvolvimento embrionário em ratas tratadas durante o período de trânsito tubário. MÉTODOS: sessenta ratas Wistar foram distribuídas em quatro grupos (15 animais cada), que receberam diferentes doses de tacrolimus por via intragástrica: (T1) 1,0 mg/kg/dia, (T2) 2,0 mg/kg/dia e (T3) 4,0 mg/kg/dia. O grupo controle (C) recebeu água destilada. As ratas foram observadas diariamente para detectar sinais clínicos de toxicidade. O tratamento foi realizado do primeiro ao quinto dia de gestação. As seguintes variáveis maternas foram analisadas: peso corporal, de ovários, fígados e rins, consumo de alimento, número de corpos lúteos, implantes, fetos vivos e mortos e índice de implantação. Os fetos e placentas foram pesados e os primeiros foram observados para detectar malformações externas. Estatística: análise de variância (ANOVA), uma via, seguida de teste de Dunnett (alfa=0,05). RESULTADOS: não ocorreram indícios clínicos de toxicidade materna, tais como perda de peso, redução do consumo de alimento ou do peso de órgãos (p>0,05). Também não houve diferença significativa no peso corporal dos fetos (C: 1,8±0,6; T1: 2,2±0,5; T2: 1,9±0,5 e T3: 2,0±0,5 g) e de placentas (C: 1,6±0,4; T1: 1,5±0,4; T2: 1,8±0,4 e T3: 1,6±0,4 g), com p>0,05. Nenhuma malformação externa foi detectada. CONCLUSÕES: a administração de tacrolimus a ratas prenhes durante o período de trânsito tubário não parece ter qualquer efeito tóxico e materno ou embrionário.

Efeito do ultra-som terapêutico em ratas prenhes

OBJETIVO: avaliar o efeito da exposição de ratas ao ultra-som terapêutico na fase de pré-implantação. MÉTODOS: ratas Wistar prenhes foram expostas, na fase de pré-implantação, ao ultra-som de 3 MHz, 0,6 W/cm², com ondas pulsadas (USP) ou ondas contínuas (USC), e os controles (USS) ao ultra-som desligado, por cinco minutos. As ratas foram sacrificadas no 20º dia pós-inseminação. Foram feitas análises bioquímicas e hematológicas. Os animais foram submetidos à necrópsia para identificação de lesões de órgãos internos, remoção e pesagem de fígado, rins e ovários. Foram contados os fetos vivos, malformados, mortos e reabsorvidos. Os fetos, seus cérebros, pulmões, fígados, rins e placentas foram pesados. Os dados obtidos foram analisados por ANOVA - uma via - seguida de teste de Dunnett, qui quadrado ou Kruskal-Wallis (α = 0,05). RESULTADOS: as ratas não apresentaram alteração de peso corporal, de órgãos e nem na capacidade reprodutiva, mas houve o aumento dos triglicérides em ambos os grupos, quando comparados ao USS. Os pesos relativos do coração (0,7 ± 0,9), fígado (9,8 ± 0,8), rins (6,2 ± 0,8) e pulmão (3,8 ± 0,4) dos fetos aumentaram no USC, quando comparados ao coração (0,6 ± 0,1), fígado (8,8 ± 0,5), rins (5,52 ± 0,5) e pulmão (3,4 ± 0,4) do USS. CONCLUSÕES: no modelo experimental usado, o ultra-som terapêutico não causou toxicidade materna significativa. Ondas pulsadas não alteraram a morfologia fetal, mas as ondas contínuas acarretaram aumento nos pesos relativos do coração, fígado, pulmão e rins dos fetos.

Limitações e controvérsias na determinação do valor preditivo de critérios de morfologia oocitária e embrionária

Com o objetivo de aumentar as taxas de sucesso das pacientes que são submetidas a técnicas de reprodução humana assistida (RHA), numerosos estudos apresentam como foco a identificação do embrião com maior potencial de implantação. Apesar dos avanços tecnológicos significativos da Medicina Reprodutiva baseados no advento da era da genômica, proteômica e metabolômica (OMICS), técnicas rotineiramente aplicáveis ainda não estão disponíveis. Dessa forma, laboratórios de fertilização in vitro(FIV) de todo o mundo selecionam para transferência embriões humanos cultivados in vitrobaseados em parâmetros morfológicos avaliados em microscopia de luz. Diversos parâmetros morfológicos podem ser avaliados desde o estágio pronuclear até o estágio de blastocisto para embriões humanos cultivados in vitro. De modo geral, independentemente do dia da transferência, tais critérios parecem apresentar valor preditivo de viabilidade embrionária quando avaliados individualmente ou coletivamente. No entanto, a subjetividade da avaliação morfológica, bem como a ampla diversidade de sistemas de classificação embrionária aplicados por diferentes clínicas, implica em resultados contraditórios, tornando extremamente difícil a implementação de um consenso do valor preditivo dos diferentes parâmetros morfológicos avaliados. A otimização da seleção embrionária representa um grande potencial de aumento das taxas de sucesso do tratamento, além de possibilitar a realização da transferência de um número reduzido de embriões, minimizando os riscos derivados de estações múltiplas.

Produção in vitro de embriões bovinos utilizando diferentes condições de maturação oocitária

O experimento avaliou o uso do meio TCM-199 suplementado com: SVE, SEE e SFB (meio indefinido); BSA (meio semi-definido) e PVA (meio definido); na presença ou ausência de hormônios (FSH e hCG) na maturação in vitro de oócitos bovinos nas condições do Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução da UFRGS. Complexos cumuli-oophorus (CCOs), em número total de 1458, foram aleatoriamente distribuídos em doze tratamentos, maturados por 24 h em atmosfera de 5% CO2, em ar e 100% umidade relativa em estufa a 39°C. A fecundação nos doze tratamentos foi realizada mediante exposição dos CCOs maturados aos espermatozóides (1x106/mL), previamente capacitados, durante 20 h. O cultivo foi realizado em fluído sintético de oviduto modificado (SOFaa) acrescido de 10% SVE a 39°C, 100% de umidade relativa do ar e 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. Na presença de hormônios os meios indefinidos (SVE: 63,6%, 70/110; SEE: 53,4%, 70/131 e SFB: 56,0%, 75/134) apresentaram maior eficiência em proporcionar suporte à primeira divisão embrionária, em comparação ao meio definido (PVP: 50,6%, 45/89). Os CCOs maturados em meio indefinido suplementado com SVE e hormônios apresentaram maior competência em fecundar e suportar o desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto após sete dias de cultivo (27,3%, 30/110).

Efeitos da manipulação neonatal sobre a concentração plasmática de hormônios da reprodução e a densidade de receptores de angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas

A manipulação neonatal é um modelo experimental utilizado para avaliar o modo pelo qual interferências precoces na vida do animal podem alterar funções neuroendócrinas e comportamentos na vida adulta. O procedimento de manipulação neonatal, além de alterar a atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (eixo HPA) em ratos machos e fêmeas, pode causar profundas mudanças na função reprodutiva de ratas adultas. De fato, há evidências de que a manipulação neonatal diminui a atividade do eixo HPA através da redução da síntese e secreção de hormônios que são liberados quando os animais são expostos ao estresse na vida adulta e, além disso, induz à presença de ciclos anovulatórios e diminui a receptividade sexual de ratas. Considerando essas alterações induzidas pela manipulação neonatal que são relacionadas à função reprodutiva de ratas, essa tese teve por objetivo estudar as possíveis causas da alteração no comportamento sexual e ovulação induzidas pela manipulação neonatal. Para isto, além de estudar o perfil hormonal desses animais, o que incluiu os esteróides gonadais, as gonadotrofinas e a prolactina (PRL) em diferentes fases e horários do ciclo estral, o conteúdo do hormônio liberador de gonadotrofinas (LHRH) em algumas regiões do sistema nervoso central (SNC) e na eminência mediana (EM); foi avaliada a possível participação do sistema angiotensinérgico central, através da análise da densidade dos receptores de angiotensina II (Ang II) pela técnica de auto-radiografia, na mediação dos efeitos da manipulação neonatal sobre a função do eixo hipotálamo-hipófise-gônada (eixo HPG) e do eixo HPA. O presente estudo confirmou dados obtidos em nosso laboratório sobre a redução do comportamento sexual e da ovulação em ratas manipuladas no período neonatal. Na tarde do proestro, período no qual ocorrem os eventos necessários para a ovulação na próxima fase do ciclo estral, os resultados mostram que os animais do grupo manipulado têm redução significativa da concentração plasmática de estradiol, de gonadotrofinas e de PRL, assim como um aumento no conteúdo de LHRH na área pré-óptica medial (APOM). A manipulação neonatal também reduziu a concentração plasmática de progesterona analisada após o coito que pode ser decorrente da reduzida estimulação vaginocervical recebida por essas ratas, já que houve uma redução significativa da freqüência de intromissão realizada pelo macho sobre as ratas do grupo manipulado. A densidade de receptores de Ang II na APOM e no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) também foi alterada pela manipulação neonatal, pois houve redução significativa na densidade desses receptores nessas duas regiões. Em conclusão, a manipulação neonatal reduz profundamente a atividade do eixo HPG e essa alteração é causada por modificações nas concentrações de estradiol no plasma que, por sua vez, pode alterar a secreção de LHRH, de gonadotrofinas e de PRL, comprometendo dessa maneira a ovulação e a receptividade sexual. Contribuindo para os efeitos deletérios da manipulação neonatal sobre a função reprodutiva em ratas, este procedimento pode alterar a implantação do blastocisto devido à redução da secreção de progesterona observada após o coito no grupo manipulado. Alguns dos efeitos da manipulação neonatal parecem ser mediados pelo sistema angiotensinérgico central, como o aumento do conteúdo de LHRH na APOM e a diminuída resposta do eixo HPA observada em animais manipulados submetidos a situações estressantes na vida adulta.