Isolamento e caracterização de microssatélites do genoma de Echinococcus granulosus (Cestoda, Taeniidae)

A presença de microssatélites no genoma de Echinococcus granulosus foi verificada utilizando-se oito oligonucleotídeos com repetições como sondas (GT15, CT15, AT15, CG15, CAT10, CAA10, CGG10 e CATA10). Experimentos de hibridização revelaram que as repetições GT, CAA, CATA e CT são as mais frequentes no genoma de E. granulosus. As sondas AT e GC não apresentaram sinais de hibridização. Seis lócus contendo repetições CA/GT, quatro lócus contendo repetições GA/CT e oito lócus contendo repetições AAC/GGT foram clonados e sequenciados. O lócus Egmsca1 foi analisado em 73 isolados do Brasil e da Argentina cujas linhagens haviam sido previamente caracterizadas e em 27 isolados provenientes da Etiópia cujas linhagens ainda não foram identificadas. Os isolados brasileiros da linhagem bovina e os isolados argentinos da linhagem do camelo apresentaram-se monomórficos e compartilharam o alelo (CA)7. Isolados argentinos das linhagens da ovelha e da ovelha da Tasmânia compartilharam dois alelos [(CA)8 e (CA)10] com os isolados brasileiros da linhagem da ovelha. O alelo (CA)11 foi encontrado somente em isolados brasileiros da linhagem da ovelha em uma baixa frequência. O alelo (CA)9 ocorreu apenas em um isolado da Etiópia. As populações brasileira e argentina da linhagem da ovelha foram testadas em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg e somente a primeira estava de acordo com as expectativas. Protoescólices isolados de um único cisto hidático não apresentaram polimorfismo, validando a utilização de protoescólices de um mesmo cisto, agrupados como um isolado, em estudos populacionais. Um microssatélite contendo repetições de pentanucleotídeos, contido no complexo gênico do snRNA U1, também foi isolado. Este estudo descreve pela primeira vez o isolamento e caracterização de microssatélites em E. granulosus.

Polimorfismos de inserção/deleção do gene da ECA e K121Q do gene PC-1 em pacientes com Diabete Mellito tipo 1 normoalbuminúricos : estudo com 10 anos de acompanhamento

O objetivo deste estudo foi analisar o papel do polimorfismo de I/D do gene da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) e o polimorfismo K121Q da PC-1 nas modificações das taxas de filtração glomerular (TFG), excreção urinária de albumina (EUA) e pressão arterial em uma coorte de pacientes diabéticos tipo 1 normoalbuminúricos (EUA<20μg/min) em um estudo com seguimento de 10,2 ± 2,0anos (6,5 a 13,3 anos). A EUA (imunoturbidimetria), TFG (técnica da injeção única de 51Cr-EDTA), HbA1c (cromatografia de troca iônica) e pressão arterial foram medidas no início do estudo e a intervalos de 1,7 ± 0,6 anos. O polimorfismo I/D e K121Q foram determinados através da PCR e restrição enzimática. Onze pacientes apresentaram o genótipo II, 13 o ID e 6 apresentaram o genótipo DD. Pacientes com o alelo D (ID/DD) desenvolveram mais freqüentemente hipertensão arterial e retinopatia diabética. Os 3 pacientes do estudo que desenvolveram nefropatia diabética apresentaram o alelo D. Nos pacientes ID/DD (n=19) ocorreu maior redução da TFG quando comparados com os pacientes II (n=11) (-0,39 ± 0,29 vs – 0,12 ± 0,37 ml/min/mês; P=0,035). A presença do alelo D, em análise de regressão múltipla linear (R2=0,15; F=4,92; P=0,035) foi o único fator associado à redução da TFG (-0,29 ± 0,34 ml/min/mês; P<0,05). Já o aumento da EUA (log EUA = 0,0275 ± 0,042 μg/min/mês; P=0,002) foi associado somente aos níveis iniciais de EUA (R2=0,17; F=5,72; P=0,024). Um aumento significativo (P<0,05) no desenvolvimento de hipertensão arterial e de novos casos de retinopatia diabética foi observado somente nos pacientes com os genótipos ID/DD. Vinte e dois pacientes apresentaram genótipo KK, 7 KQ e 1 apresentou genótipo QQ. Pacientes com os genótipos KQ/QQ apresentaram um aumento significativo (P=0,045) de novos casos de retinopatia diabética. Em conclusão a presença do alelo D nesta amostra de pacientes DM tipo 1 normoalbuminúricos e normotensos está associada com aumento na proporção de complicações microvasculares e hipertensão arterial.

Estudos moleculares em pacientes com fibrose cística do sul do Brasil

Fibrose Cística (FC) ou mucoviscidose é uma das doenças hereditárias mais comuns em caucasóides, com uma freqüência estimada em um caso em cada 2000 nascimentos sendo a freqüência de indivíduos portadores estimada em 5% em indivíduos. Esta doença caracteriza-se principalmente por infecções e obstrução crônica do aparelho respiratório, insuficiência pancreática exócrina e suas conseqüências nutricionais e por elevados níveis de eletrólitos no suor. A apresentação clínica, a gravidade da doença e a velocidade de progressão da FC variam consideravelmente, incluindo-se entre as manifestações a agenesia congênita de vasos deferentes (ACVD). Dentre as 1006 mutações associadas à FC, a R117H foi descrita em associação com um sítio polimórfico de timidinas no intron 8 do gene CFTR, a qual pode estar relacionada a ACVD. Este trabalho teve como objetivos: ① identificar alterações nas seqüências de nucleotídeos dos exons 3, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 19, 20 e 22 do gene CFTR; ② identificar a freqüência de algumas mutações freqüentes no gene CFTR (R347P, R347H, R334W, Q359K, G542X, G551D, R553X, S549N, R1162X, W1282X e N1303K) na amostra e estimar a freqüência destas mutações na população estudada; ③ determinar o genótipo dos pacientes com FC participantes do estudo; ④ estabelecer um protocolo eficiente e rápido para identificar as alterações de politimidinas em pacientes não homozigotos para a mutação ∆F508; ⑤ estabelecer a freqüência dos alelos 5T, 7T e 9T em pacientes com FC do sul do Brasil; ⑥ estabelecer a correlação do polimorfismo politimidinas com manifestações clínicas da doença, como por exemplo, azoospermia Para a identificação das mutações no gene CFTR foram avaliados 100 alelos ou 50 pacientes portadores de FC. No entanto, para a avaliação do polimorfismo de politimidinas foram avaliados 54 pacientes não relacionados. Estes pacientes foram previamente diagnosticados e se encontram em tratamento no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Após extração de DNA destes pacientes, o material foi amplificado por PCR utilizando-se primers específicos para as regiões de interesse. A identificação de alterações nas seqüências de nucleotídios foi possível através da técnica de SSCP. Esta técnica permitiu a detecção de 7 pacientes com alteração no exon 7, 3 pacientes com alterações no exon 11, 2 pacientes com alterações no exon 19 e de 3 pacientes com alterações no exon 20. Nenhum paciente apresentou alteração molecular nos exons 3, 4, 5, 12 e 22. As freqüências das mutações R334W, R1162X e W1282X na amostra estudada foram estabelecidas em 1,0% para cada uma delas. Não foram encontrados pacientes portadores das mutações R347P, R334H, Q359N e S549N na amostra estudada. Com a utilização deste protocolo associado ao do estudo anterior (Streit et al., 1999) foi possível a triagem de mutações em 44,4% do gene da FC O alelo 5T foi encontrado em 2 dos 108 alelos analisados. Já o polimorfismo 7T, o mais comum, foi detectado em 65 alelos, enquanto o polimorfismo 9T estava presente em 41 alelos. O genótipo mais comum estabelecido no presente estudo foi o 7T/9T, encontrado em 39 pacientes (72,2%), seguido do genótipo 7T/7T, encontrado em 12 pacientes (22,2%), e do 5T/7T, encontrado em 2 pacientes (3,7%) e, finalmente, do genótipo 9T/9T, em 1 paciente (1,85%). Os resultados obtidos sugerem que o fenótipo dos pacientes com FC estudados não resulta apenas do genótipo dos mesmos, pois existem pacientes com o mesmo genótipo e expressões fenotípicas diferentes. Fatores epigenéticos assim como ambientais devem influenciar a expressão das alterações moleculares. Entretanto, a identificação do defeito molecular básico é de fundamental importância para a confirmação precoce e precisa do diagnóstico em pacientes suspeitas e para o estudo familiar permitindo que as medidas de tratamento e prevenção sejam implementadas do modo mais eficiente.

Metabolismo da homocisteína e defeitos do tubo neural : um estudo bioquímico e molecular no sul do Brasil

Os defeitos de fechamento de tubo neural constituem uma das malformações mais freqüentes na espécie humana, apresentando alta morbi-mortalidade. Sua etiologia é considerada multifatorial, estando envolvidos fatores genéticos e ambientais. Estes fatores estão relacionados principalmente com o metabolismo da homocisteína. Realizamos um estudo de caso-controle com o objetivo de estudar os fatores bioquímicos e genéticos relacionados ao DTN na nossa população. Em pares de afetados com DTN e suas mães e pares de pacientes normais e suas mães foram avaliados dosagem de folato, vitamina B12, homocisteína e polimorfismos da enzima metileno tetraidrofolato redutase (MTHFR), C677T e A1298C. A dosagem de folato nos casos foi 11,37 ng/mL(±6,72) e nos controles 5,64 ng/mL(±4,16) (p<0,001). O folato sérico das mães foi 7,27 ng/mL (±4,48) e 3,90 ng/mL (±1,77) nas mães controles (p<0,001). A média de dosagem de vitamina B12 foi de 641,88 pg/mL ((±262,21) nos casos e 743,27 pg/mL (±433,52) nos controles (p= 0,205). A média de dosagem de vitamina B12 nas mães dos casos foi 354,75 pg/mL (±142,06) e 465,25 pg/mL (±194,91) nas mães controles (p=0,004). O nível de homocisteína plasmático médio foi 6,89 μmol/L(±4,48) para os casos e 5,41 μmol/L (±2,55) para os controles (p=0,099). Nas mães dos casos a dosagem média de homocisteína foi 7,23 μmol/L (±2,64) e 7,00 μmol/L (±2,24) nas mães controles (p=0,666). Não houve diferença entre a freqüência dos genótipos C677T e A1298C da MTHFR nos casos e controles e suas mães. Para o polimorfismo C677T as freqüências dos alelo C e T foram respectivamente 0,6585 e 0,3414 nos pacientes com DTN; 0,6590 e 0,3410 nos controles; 0,6460 e 0,3540 nas mães dos casos e 0,6136 e 0,3860 nas mães controles. Para o polimorfismo A1298C as freqüências dos alelos A e C foram respectivamente 0,7436 e 0,2564 nos pacientes com DTN; 0,7610 e 0,2390 nos controles; 0,8055 e 0,1945 nas mães dos casos e 0,8065 e 0,1935 nas mães controles. Identificamos que indivíduos homozigotos 677TT apresentam um maior nível de homocisteína e este é inversamente relacionado com os níveis de vitamina B12. Estes achados sugerem que uma alteração metabólica relacionada ao metabolismo da homocisteína e principalmente devido à diminuição da vitamina B12 seja um fator de risco para DTN na nossa população.

Análise de haplótipos intragênicos ao gene MJD1 em pacientes com doença de Machado-Joseph

A doença de Machado-Joseph (DMJ), ou ataxia espinocerebelar tipo 3 (SCA3), é uma desordem neurodegenerativa autossômica dominante, originalmente descrita em famílias de ancestralidade portuguesa-açoriana. Incordenação generalizada da marcha, dos membros e da fala podem estar presentes nos pacientes afetados por essa doença. O início das manifestações clínicas ocorre, em geral, entre os 30 e os 40 anos, apresentando uma progressão bastante lenta. O tempo médio de sobrevida depois do início da doença é de 14 a 17 anos. O gene associado à doença, denominado MJD1, foi identificado em 1994 e localiza-se no cromossomo 14. Este gene se caracteriza por apresentar uma repetição nucleotídica CAG na região 5` do exon 2. O número destas repetições é polimórfico na população, sendo que indivíduos normais apresentam de 12 a 37 repetições CAG, enquanto os afetados pela DMJ podem apresentar de 61 a 84 repetições. Um recente estudo mundial de haplótipos demonstrou a presença de dois diferentes haplótipos em famílias de origem açoriana, que são específicos à ilha de origem. Em famílias da porção continental de Portugal, os dois haplótipos foram encontrados. A maioria das famílias não portuguesas também compartilha o mesmo haplótipo encontrado em famílias originárias da ilha de Flores, mas três outros haplótipos foram encontrados nessas famílias. Até o momento, a hipótese mais forte declara que a difusão da mutação original está diretamente ligada à imigração portuguesa-açoriana No presente estudo, esta hipótese foi testada através da análise de disequilíbrio de ligação de três polimorfismos intragênicos (A669TG/C669TG, C987GG/G987GG, TAA1118/TAC1118). O polimorfismo na posição 669 foi identificado por PCR seguido de SSCP e confirmado por sequenciamento direto. Os polimorfismos nas posições 987 e 1118 foram detectados por PCR alelo-específico. Os resultados obtidos indicaram que o haplótipo intragênico A-C-A estava associado ao alelo com a expansão na maioria dos pacientes (92%). Estes resultados confirmam achados em outros estudos. Isto indica que uma única mutação na DMJ foi introduzida em várias populações, seguida de um efeito fundador local, e indicando também que provavelmente esta mutação é muito antiga. E, para finalizar, baseado neste estudo e comparando com dados gerados no estudo mundial de haplótipos, pode-se especular que a origem da mutação associada a DMJ nos pacientes do sul do Brasil é proveniente da ilha de Flores.

Análise molecular de indivíduos com doença de Machado-Joseph

As ataxias espinocerebelares (SCAs) constituem um grupo de doenças neurodegenerativas fatais que apresentam uma grande heterogeneidade clínica. A doença de Machado-Joseph (DMJ), ou ataxia espinocerebelar tipo 3 (SCA3), é causada por uma expansão de uma seqüência repetitiva CAG em um gene, denominado MJD1, localizado no braço longo do cromossomo 14, expansão codificadora de uma seqüência poliglutamínica constituinte da proteína ataxina 3. Indivíduos normais apresentam entre 12 a 41 repetições, enquanto indivíduos afetados apresentam 61 a 84 repetições CAGs neste gene. Este trabalho teve como objetivos principais a padronização de metodologias moleculares para o identificação e a quantificação do número de repetições CAG no gene responsável pela da DMJ. Um grupo de 112 pacientes, pertencentes a 77 famílias, com suspeita clínica de algum tipo de ataxia espinocerebelar foi avaliado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Após a extração de DNA destes pacientes, este material foi amplificado por PCR utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos para a região de interesse e posterior transferência destes fragmentos (1) para uma membrana de nylon pelo método de Southern blot, visando ao estabelecimento de um protocolo não-radioativo para detectar a presença do alelo normal e/ou mutante; e (2) análise em gel de poliacrilamida para quantificação do número de repetições presentes no alelo mutante. As análises laboratoriais identificaram um total de 77 pacientes com uma expansão CAG no gene da MJD1. Considerando-se apenas indivíduos não relacionados, a freqüência encontrada foi de 61% (47 indivíduos). Os protocolos estabelecidos demonstraram-se bastante eficazes e sensíveis para o diagnóstico da DMJ e quantificação do alelo expandido da respectiva doença.

Análise de variáveis genéticas relacionadas ao metabolismo da homocisteína em crianças com fissuras lábio-palatinas

As fissuras orofaciais não-sindrômicas estão entre as mais comuns malformações congênitas, com uma incidência de aproximadamente 1/700 nascidos vivos, cuja prevalência varia de acordo com a região geográfica e nível sócio econômico. As fissuras lábio-palatinas apresentam uma patogênese complexa que pode ser causada pela interação de fatores genéticos e ambientais, principalmente aqueles relacionados ao metabolismo da homocisteína. Muitos estudos têm apontado evidências de que alterações no metabolismo da homocisteína devido a polimorfismos nos genes envolvidos nesta rota metabólica, associados aos hábitos maternos durante a gestação, podem estar relacionados à etiologia das fissuras orofaciais. O metabolismo da homocisteína requer os genes MTHFR, MTR e MTRR para a manutenção das concentrações adequados de homocisteína no plasma. Com o objetivo de avaliar a influência de polimorfismos destes genes na etiologia das fissuras orofaciais foi desenvolvido um estudo caso-controle com 94 crianças com fissuras (casos), 91 de suas mães, além de 100 crianças sem malformações (controles) e suas mães, todos provenientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Com relação aos hábitos maternos durante a gestação (uso de suplementação vitamínica, fumo e álcool) não houve diferença estatisticamente significativa entre mães de casos e controles. As análises dos polimorfismos C677T do gene MTHFR, A2756G do gene MTR e A66G do gene MTRR não mostraram diferenças significativas quanto a distribuição de seus genótipos em pacientes com FL/P e seus controles. Uma freqüência aumentada do genótipo 677TT do gene MTHFR foi observada entre as mães de crianças com fissuras orofaciais (casosTT= 20,8; controlesTT=10,0%; OR=2,38; IC95%=0,97-5,89; p<0,03), mas não para os outros genótipos dos genes MTR e MTRR. Não foram observadas diferenças significativas nas análises de genótipos combinados e interação do alelo 677T, genótipo 677TT com hábitos maternos em mães dos casos. Estes resultados indicam que alterações no metabolismo do folato, relacionados ao genótipo materno TT do polimorfismo C677T do gene MTHFR, podem predispor ao aparecimento de fendas orofaciais na prole, na nossa população.

Análise do gene transportador de serotonina em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio

Introdução: Inúmeros estudos têm associado alterações no sistema serotoninérgico com doenças psiquiátricas como a depressão e os atos suicidas. O gene transportador da serotonina possui um papel central na regulação da função sináptica serotoninérgica e esse gene possui um polimorfismo na região promotora que se constitui em um gene candidato para estudos de associação do comportamento suicida. O objetivo deste trabalho foi verificar a associação entre a freqüência dos alelos “l” e “s” do polimorfismo 5-HTTLPR em pacientes com depressão maior segundo o DSM-IV que tentaram o suicídio e um grupo controle. Avaliamos também se há uma relação entre este polimorfismo e o comportamento suicida. Métodos: A amostra foi composta de 84 pacientes deprimidos que tentaram suicídio e 152 controles doadores voluntários do Banco de Sangue. A região promotora do gene 5-HTT contendo o polimorfismo 5-HTTLPR foi amplificada através do método da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A avaliação diagnóstica destes pacientes foi feita através de entrevista psiquiátrica clínica e por entrevista diagnóstica padronizada breve Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI) para adultos e uso da escala Suicide Intent Scale (SIS). Resultados: Não houve diferenças significativas na freqüência dos alelos e do genótipo nos sujeitos de pesquisa comparados ao grupo controle. Encontramos uma maior freqüência de alelo “s” e do genótipo SS e LS em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio. A razão de chance (odds ratio) para o genótipo SS e LS contra o outro genótipo (LL) foi de 1,301 (95% I.C.= 0.737-2.296). A razão de chance (OR) para o alelo “s” em comparação com o alelo “l” foi de 1,38 (95% I.C.= 0.780-1.661).Conclusões: Nossos resultados sugerem que há um risco aumentado de suicídio nos pacientes deprimidos que possuem o genótipo SS e LS.

Estudo das características bioquímicas da β-glicosidase humana em indivíduos homozigotos e heterozigotos para a doença de Gaucher com mutações pré-determinadas : comparação com indivíduos normais

A Doença de Gaucher (DG) é a doença de depósito mais comum. É causada pela deficiência da enzima -glicosidase (-gli), necessária para o catabolismo intralisossômico do glicocerebrosídio, sendo herdada de modo autossômico recessivo. Esta deficiência resulta em um acúmulo de glicocerebrosídio nos lisossomos de macrófagos derivados de monócitos em tecidos do sistema reticuloendotelial. No período de janeiro de 1982 a outubro de 2003 foram analisadas, bioquimicamente, 1081 amostras de sangue de pacientes com suspeita de DG. Nestas amostras foram medidas as atividades das enzimas -gli e quitotriosidase (QT). Foram diagnosticados 412 casos de DG (38,1%), sendo na sua grande maioria DG tipo 1. As regiões brasileiras de maior concentração destes pacientes foram as regiões sudeste, sul e nordeste. A idade média destes pacientes ao diagnóstico foi de 19 anos. A atividade da -gli de indivíduos com DG foi em média 10,7% daquela apresentada pelos indivíduos normais. A QT apresentou-se em média 269 vezes mais elevada no grupo de pacientes com DG. Nos 669 casos em que não foi confirmada a presença de DG, houve pacientes com Doença de Niemann-Pick tipos A, B ou C (44 casos), possíveis heterozigotos para DG (59 casos), pacientes com outras DL (19 casos) e outros EIM (3 casos) Em 508 casos não foi encontrado nenhum distúrbio metabólico. Foram analisadas as mutações de 128 indivíduos com DG, sendo que o genótipo N370S/L444P foi o mais freqüente (48,4%). Este estudo mostra que o protocolo bioquímico empregado foi eficiente para a detecção de DG, uma doença que se mostra bastante freqüente também no Brasil. Neste estudo também foi possível caracterizar o comportamento do pH ótimo, termoestabilidade, Km e Vmax da -gli em leucócitos de pacientes com DG e heterozigotos obrigatórios com diferentes genótipos comparando-os com indivíduos normais. Os resultados mostraram um comportamento diferente da enzima nos três grupos analisados. Esse comportamento variou conforme a mutação presente nos indivíduos. Não foi observado somente um único pH ótimo nos 3 grupos. A enzima de indivíduos normais mostrou uma faixa de pH de 5,0 a 5,4, a de heterozigotos, um único pH ou uma estreita faixa e a de indivíduos com DG, 2 picos de pH ótimo. O Km e a Vmax da enzima de heterozigotos variou desde igual até maior que aquele da enzima normal. Quando comparamos a enzima de indivíduos normais com aquela de pacientes com DG, observamos que nos genótipos N370S/N370S e N370S/IVS2+1 o Km foi maior e no grupo N370S/L444P o Km foi significativamente menor. A Vmax nos indivíduos com DG apresentou valores menores em relação aos indivíduos normais. A enzima de leucócitos de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG, foi inativada a 60ºC. As diferenças de comportamento entre as enzimas dos três grupos analisados permitiram discriminá-los, ou seja, a enzima de indivíduos homozigotos apresentou uma maior atividade residual após 60 minutos de pré-incubação, sendo mais termoestável que os grupos de indivíduos normais e heterozigotos. . A mutação N370S produziu uma enzima mais estável e cataliticamente mais ativa que aquela da mutação L444P. Esta por sua vez, foi mais estável e ativa do que a mutação D409H. O mesmo aconteceu com os indivíduos homozigotos para DG, onde o comportamento bioquímico da b-gli foi determinado pela presença do alelo N370S. Portanto há um gradiente de estabilidade que vai de uma condição mais estável a uma condição menos estável. Este gradiente assemelha-se aquele da classificação do fenótipo clínico da DG. Os resultados nos permitem correlacionar diretamente a mutação N370S, mais estável cineticamente, com a forma clínica não neurológica da doença e a mutação menos estável cataliticamente (D409H) com a forma clínica neurológica da DG. Através deste trabalho foi possível obter informações sobre o comportamento da proteína em cada mutação estudada, seja ela em homo ou em heterozigose e estes dados podem colaborar para uma melhor distinção entre a enzima de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG.

Polimorfismos nos genes DAT1 DRD4 e transtorno de déficits de atenção e hiperatividade (TDAH) em adultos

O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um dos problemas psiquiátricos mais comuns na infância, o qual apresenta uma herdabilidade significativa e se caracteriza pela presença de desatenção, hiperatividade e impulsividade. Cerca da metade das crianças com TDAH permanecem com o transtorno durante a vida adulta. Embora os estudos em amostras de crianças tenham explorado diversos genes de suscetibilidade ao TDAH, os resultados são inconclusivos e há poucos estudos em adultos. A amostra aqui estudada é composta por 308 adultos portadores de TDAH e 233 doadores de sangue do Hemocentro do Rio Grande do Sul.Ambos os grupos são compostos por brasileiros descendentes de europeus. Os diagnósticos psiquiátricos foram realizados por uma equipe treinada, seguindo os critérios do DSM-IV. Este trabalho objetivou testar possíveis associações entre polimorfismos nos genes do receptor D4 de dopamina (DRD4) e da proteína transportadora de dopamina (DAT1) com o TDAH, tendo em conta os subtipos, gravidade, comorbidades e idade de início dos sintomas de TDAH. Não foi encontrada associação entre os dois polimorfismos estudados no gene DRD4 (duplicação de 120 pares de base da região 5’ e VNTR de 48 pares de base do éxon III) e o TDAH. Porém, o alelo de 7-repetições do éxon III mostrou-se associado a uma menor idade de início dos sintomas e com o transtorno bipolar do humor associado ao TDAH. Genótipos contendo o alelo de 9-repetições do VNTR de 40pb na região 3’ não traduzida do gene DAT1 predisporiam ao subtipo desatento de TDAH entre os pacientes do sexo masculino e ao TDAH em geral entre as mulheres. Pacientes com o genótipo homozigoto para o alelo de 10-repetições apresentaram um maior número de sintomas de hiperatividade. Os resultados aqui obtidos apontam para a existência de diferenças substanciais no perfil genético entre as amostras de TDAH em crianças e adultos. As características amostrais relacionadas com o sexo, idade, subtipo e comorbidades mais prevalentes podem modificar a associação entre os polimorfismos estudados e o transtorno.

A associação entre genes do sistema noradrenégico e a resposta clínica ao tratamento com metilfenidato em crianças e adolescentes com transtorno de déficit de atenção/hiperatividade : um estudo de farmacogenética

Introdução O Transtorno de Déficit de Atenção/Hiperatividade (TDAH) está associado a um impacto negativo em diversas esferas da vida dos indivíduos afetados e de suas famílias. Os prejuízos causados por este transtorno são minimizados de forma significativa pelo tratamento medicamentoso, principalmente pelo uso do metilfenidato (MFD), cujo mecanismo de ação não é completamente conhecido. Estudos pré-clínicos têm apontado para o sistema noradrenérgico como um dos principais alvos da ação do MFD. Há um número reduzido de estudos que avaliaram a associação de genes do sistema noradrenérgico à melhora dos sintomas do TDAH e à ocorrência de efeitos adversos com o tratamento com MFD. Objetivos O presente estudo tem por objetivo avaliar a associação de polimorfismos localizados nos genes para o receptor adrenérgico α2A (ADRA2A), para a enzima dopamina-β-hidroxilase (DBH) e para o transportador de noradrenalina (NET1) e a resposta clínica (em termos de melhora sintomatológica, melhora do funcionamento global e ocorrência de efeitos adversos) ao tratamento com MFD em crianças e adolescentes com TDAH. Métodos 14 Crianças e adolescentes diagnosticados com TDAH foram tratados com MFD e reavaliados no 1o e no 3o mês de uso da medicação. Nos três momentos, os pais relataram a ocorrência de sintomas de desatenção, hiperatividade-impulsividade e oposição através da Escala Swanson, Nolan e Pelham - versão IV (SNAP-IV) e de efeitos colaterais à medicação através da Escala de Efeitos Adversos de Barkley (SERS). O médico assistente avaliou o funcionamento global da criança através da Escala de Avaliação Global de Crianças (CGAS). Foram avaliados os polimorfismos ADRA2A MspI, DBH TaqI e HhaI e NET1 BslI. Suas associações às medidas clínicas descritas foram analisadas através do método da análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas ou através do modelo de efeitos mistos. Foi avaliada ainda a associação da interação entre os polimorfismos DBH TaqI, DBH HhaI e NET1 BslI e a redução dos sintomas através da ANOVA. Resultados Foram incluídos nas análises 106 indivíduos. Foi detectado um efeito significativo da interação entre a presença do alelo G no polimosfismo ADRA2A MspI e o tratamento com MFD ao longo do tempo sobre os sintomas de desatenção após 1 mês (n=106; F1,104 =8.51; P=0.004) e 3 meses (n=106; F2,198 =4.30; P=0.015) de tratamento. Não houve associação entre este polimorfismo e os demais desfechos avaliados. Paradoxalmente, indivíduos homozigotos para o alelo A2 no polimorfismo DBH TaqI apresentaram menor redução dos sintomas de hiperatividade-impulsividade após 1 mês (n=83; F=7.13; P=0.009) e maior redução destes sintomas após 3 meses (n=80; F=3.01; P=0.05) de tratamento com MFD do que indivíduos sem este genótipo. Não houve associação entre este polimorfismo e os demais desfechos avaliados. Não foram detectadas associações significativas dos polimorfismos DBH HhaI e NET1 BslI e melhora de sintomas, melhora do funcionamento global ou ocorrência de efeitos adversos durante o tratamento com MFD (P>0.05). Não foi demonstrado efeito da interação entre os polimorfismos avaliados sobre a resposta ao tratamento com MFD (P>0.05). Conclusão Este estudo demonstrou de forma consistente a participação do polimorfismo MspI do gene ADRA2A na redução de sintomas de desatenção com o tratamento com MFD durante o período de acompanhamento. As evidências clínicas encontradas corroboram dados bioquímicos, neurobiológicos e farmacológicos existentes e indicam a necessidade de mais estudos sobre a participação do sistema noradrenérgico no mecanismo de ação do MFD. Esforços conjuntos entre os diversos grupos de pesquisa devem ser postos em prática para que novas metodologias possam ser empregadas no tratamento do TDAH.

Variantes genéticas da calpaína-10 (CAPN-10) numa amostra de pacientes hiperandrogênicas

A síndrome dos ovários policísticos atinge 5 - 10% das mulheres em idade fértil e mais de 40% destas pacientes apresenta obesidade e resistência insulínica, o que aumenta o risco para o desenvolvimento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Numerosos genes poderiam contribuir para o desenvolvimento do DM2 e outras alterações metabólicas. Dentre estes o gene da calpaína-10 (CAPN-10), tem sido associado com DM2 em populações mexicanosamericanos, e em duas populações do Norte da Europa (Finlândia e Alemanha). No presente estudo analisamos o genótipo de 96 pacientes hiperandrogênicas reunidas em dois grupos: Síndrome dos ovários policísticos (PCOS) e Hirsutismo idiopático (HI), com relação à freqüência de quatro polimorfismos do gene da CAPN-10 (SNP-44, 43, 19 e 63). Foram ainda realizadas análises de associação entre a freqüência alélica dos polimorfismos e características clínicas das pacientes, com ênfase na obesidade e resistência insulínica A variação genética da CAPN-10 foi avaliada a partir do DNA genômico por amplificação pela Polimerase Chain Reaction (PCR) e PCR-aleloespecífico (Teste de AMRS) dos fragmentos que contém os polimorfismos do gene da CAPN-10. Nossos resultados mostraram que não houve diferença entre as freqüências genotípicas e alélicas dos SNPs 44, 43, 19 e 63 entre os grupos PCOS e HI. Por outro lado, a comparação das características clínicas dos dois grupos mostrou que o alelo Ins do SNP-19 da CAPN-10 tendeu a ser mais freqüente entre as pacientes PCOS estratificadas para sobrepeso e obesas (p≤0,05). Não houve diferença na comparação das características clínicas avaliadas e a freqüência alélica para os SNPs 43 e 63. A análise da amostra total de pacientes hirsutas, ou seja, pacientes com PCOS e HI agrupadas não evidenciou diferença entre a freqüência alélica das variantes genéticas estudadas para a CAPN-10 e a presença de resistência insulínica. Tendo em vista o efeito modesto dos SNPs 44, 43, 19 e 63 avaliados isoladamente nestas pacientes, estudos adicionais serão necessários avaliando a freqüência desses polimorfismos na população do Sul do Brasil.

Estudos de microsatélites em humanos: aplicações na identificação de indivíduos, genética de populações, datação de mutações e diagnóstico de doenças

Os microsatélites, também chamados STRs (Short Tandem Repeat), são pequenas sequências de DNA que consistem numa sequência de repetições de um motivo que varia de um a seis pares de bases. Existem em quase todos os cromossomas humanos e podem situar-se nos exões ou nos intrões. Estes últimos são altamente polimórficos e são por isso utilizados na identificação de indivíduos em testes de paternidade e também em estudos de genética de populações. A combinação dos vários genótipos possíveis faz com que cada indivíduo possua um perfil único, que permite a sua identificação. Existem também microsatélites associados a exões ou a regiões promotoras dos genes, normalmente repetições trinucleotídicas CGG/CCG ou CAG/CTG, associados a doenças neurodegenerativas como a síndrome do X-frágil e a doença de Huntington. Neste trabalho caracterizaram-se geneticamente várias populações humanas dos arquipélagos da Madeira, Açores e Cabo Verde. A partir do estudo dos microsatélites do cromossoma Y, foram definidas idades de coalescência que permitiram concluir que as cópias do gene DAZ situado no cromossoma Y são o resultado de um processo evolutivo estando a sua evolução associada a alguns haplogrupos. Verificou-se também a ocorrência de possíveis mutações nos SNPs que definem os haplogrupos, através da comparação dos microsatélites do cromossoma Y dentro de cada haplogrupo, especialmente no haplogrupo E3b. Verificou-se existir uma associação entre o número de repetições CAG e GGC do gene Receptor de Androgénios (AR), situado no cromossoma X, e a infertilidade especialmente quando combinados os dois polimorfismos, parecendo haver um efeito protector dos alelos maiores e alguma susceptibilidade para os alelos menores. Quando se estudou o número de repetições GGC do gene FMR1 em doentes com suspeita de síndrome de X-frágil observaram-se diferenças significativas quando comparadas com a população em geral e com um grupo de sobredotados. Essa diferença deveu-se principalmente à presença do alelo 29 em quase todos os indivíduos do primeiro grupo o que por si só não constitui um factor de risco mas poderá ser uma indicação da associação deste alelo com outra mutação no mesmo gene que possa ser responsável por este fenótipo.

Análise do efeito de polimorfismos não-sinônimos em genes de reparo de DNA da via BER na resposta inflamatória da meningite

In vitro and in animal models, APE1, OGG1, and PARP-1 have been proposed as being involved with inflammatory response. In this work, we have investigated if the SNPs APE1 Asn148Glu, OGG1 Ser326Cys, and PARP-1 Val762Ala are associated to meningitis and also developed a system to enable the functional analysis of polymorphic proteins. Patients with bacterial meningitis (BM), aseptic meningitis (AM) and controls (non-infected) genotypes were investigated by PIRA-PCR or PCR-RFLP. DNA damages were detected in genomic DNA by Fpg treatment. IgG and IgA were measured from plasma and the cytokines and chemokines were measured from cerebrospinal fluid samples using Bio-Plex assays. The levels of NF-κB and c-Jun were measured in CSF by dot blot assays. A significant (P<0.05) increase in the frequency of APE1 148Glu allele in BM and AM patients was observed. A significant increase in the genotypes Asn/Asn in control group and Asn/Glu in BM group was also found. For the SNP OGG1 Ser326Cys, the genotype Cys/Cys was more frequent (P<0.05) in BM group. The frequency of PARP-1 Val/Val genotype was higher in control group (P<0.05). The occurrence of combined SNPs increased significantly in BM patients, indicating that these SNPs may be associated to the disease. Increasing in sensitive sites to Fpg was observed in carriers of APE1 148Glu allele or OGG1 326Cys allele, suggesting that SNPs affect DNA repair activity. Alterations in IgG production were observed in the presence of SNPs APE1Asn148Glu, OGG1Ser326Cys or PARP-1Val762Ala. Reductions in the levels ofIL-6, IL-1Ra, MCP-1/CCL2and IL-8/CXCL8 were observed in the presence of APE1148Glu allele in BM patients, however no differences were observed in the levels of NF-κB and c-Jun considering genotypes and analyzed groups. Using APE1 as model, a system to enable the analysis of cellular effects and functional characterization of polymorphic proteins was developed using strategies of cloning APE1 cDNA in pIRES2-EGFP vector, cellular transfection of the construction obtained, siRNA for endogenous APE1 and cellular cultures genotyping. In conclusion, we obtained evidences of an effect of SNPs in DNA repair genes on the regulation of immune response. This is a pioneering work in the field that shows association of BER variant enzymes with an infectious disease in human patients, suggesting that the SNPs analyzed may affect immune response and damage by oxidative stress level during brain infection. Considering these data, new approaches of functional characterization must be developed to better analysis and interactions of polymorphic proteins in response to this context

Associação da frequência alélica dos polimorfismos dos genes do sistema renina angiotensina com a força muscular e pressão arterial de idosas

Physiological changes induced by the aging process is dynamic and progressive, reducing the adaptability and independence of older people and may be influenced by genetic and environmental factors. Thus the aim of this thesis was to investigate the association between polymorphism of the ACE gene ID and the phenotypes of muscular strength and blood pressure of 62 elderly Brazilian (67.35 ± 5.66 years) during a 16-week program of supervised training. The elderly women were stratified by age, with the group 1 (G1, n = 34) <70 years and group 2 (G2 n = 28) ≥ 70 years, and in three groups by ACE, ACE-II (n = 8) ACE- DD (n = 35) and ACE-ID (n = 19). The level of muscle strength was evaluated by the method of maximum repetitions and measures of blood pressure (BP) were measured before and after training (PAPré1 and PAPós1) and before and after each training session (PAPre2 and PAPós2), in place of training. DNA samples were isolated from peripheral blood leukocytes polymorphism and insertion / deletion (ID) of the ACE gene (rs1800795) was genotyped by polymerase chain reaction (PCR) plus PCR-confirmatory. The genotype distribution of the polymorphism ID attended the prerogatives of Hardy-Weitíherg. There was variation in power levels before and after training and the age between groups (t-test) and the ACE polymorphism (ANOVA) (p <0.05). Depending on the results it was concluded that resistance training helps to reduce SBP and increased muscle strength of upper and lower limbs when considering the age and ACE polymorphism. In this study the Elderly carriers of the D allele were more reactive to changes in BP resistance training. This study was multidisciplinary project involving researchers in the areas Medical, Physical Education, Pharmacy, Nutrition, Gerontology and Statistics. This fulfilled the requirements of the multidisciplinary Graduate Program in Health Sciences