Die Bedeutung veränderter Bewusstseinszustände in der psychosozialen Beratung

Die Inhalte der Arbeit befassen sich nach dem immanenten Erkenntnisinteresse mit dem Zusammenhang zwischen menschlichen Konflikten, Krisen und Krankheiten einerseits sowie mentalen Zuständen und Befindlichkeiten andererseits. Um die Voraussetzungen für ein umfassendes Verständnis der komplexen Materie herauszustellen, werden folgende Theorien und Erkenntnisse untersucht und diskutiert: Der Themenschwerpunkt Soziale Therapie gibt Einblick in die Entwicklung und den Stand der psychosozialen Beratung, es folgt die Darstellung und Auseinandersetzung mit innovativen Aspekten der Gesundheitswissenschaften, aufgezeigt an den Paradigmen Resilienz, Salutogenese und Bindungsforschung. Exemplarisch werden die Neurobiologie des Gehirns und des Nervensystems, die Epigenetik (Zellbiologie) und ihre Bedeutung für Entwicklungs- und Lebensprozesse betrachtet und auf Anwendungsmöglichkeiten hin diskutiert. In die Schlussfolgerungen zur Anwendung werden Neuropsychotherapie, Hypnose, Energetische Psychotherapie und Neurozeption einbezogen. Beispiel für eine nicht evidenzbasierte ganzheitliche Arbeit mit veränderten Bewusstseinszuständen ist die Auseinandersetzung mit dem peruanischen Schamanismus. In der abschließenden Zusammenfassung zeigt sich, dass die Erarbeitung und die Auseinandersetzung dem Verfasser ein tieferes Verständnis seiner eigenen Arbeit als Berater und Therapeut eingebracht hat.

Lokalisation und Funktion von Mitgliedern der Familie der short-chain Dehydrogenasen/Reduktasen in Dictyostelium discoideum

Dictyostelium discoideum wird als Modellorganismus für diverse Krankheitsbilder benutzt. Darunter zählen lysosomale, neurodegenerative Störungen sowie Stoffwechselerkrankungen. Werden diese Amöben mit einer Fettsäure gefüttert, so wird die Biogenese von lipid droplets (LDs) initiiert. Diese dynamischen Organellen dienen der Neutrallipidspeicherung. Das Proteom der LDs konnte für D. discoideum entschlüsselt werden. Unter den rund 70 Proteinen, befinden sich ca. 15, die eine Funktion im Lipidstoffwechsel haben. Darunter befinden sich auch Mitglieder der Enzymklasse der short-shain Dehydrogenasen/Reduktasen. Diese zeigen, wie viele andere LD-Proteine auch, eine duale Lokalisation im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und auf LDs. In dieser Arbeit konnten die Sequenzen, die den Wechsel von einer doppelte Phospholipidschicht (ER) auf eine einfache Membran (LDs) möglich machen, entschlüsselt werden. Im Fall der Proteine SdrB/C/D/E/F handelt es sich dabei um ein membranständiges N-terminales Peptid gefolgt von einer Membrandomäne. Helix-brechende Aminosäuren wie Prolin und Glycin in diesen Domänen erzeugen einen Knick, sodass sowohl die C- als auch N-Termini fusioniert an ein Reporterprotein cytoplasmatisch lokalisieren können. Direkt nach der Membrandomäne befindet sich ein kurzer Abschnitt mit basischen, positiv geladenen Aminosäuren, die mit der negativ geladenen Oberfläche der LDs interagieren. Die Membrandomäne allein ist zwar für eine ER-Lokalisation ausreichend, eine LD-Verteilung kann jedoch nur in Kombination mit dem basischen Abschnitt erfolgen. Des Weiteren konnte die Lokalisation von SdrG aufgeklärt werden. Dieses Protein lokalisiert sowohl im ER, als auch auf LDs und den Peroxisomen. Die knockouts einzelner Sdr-Gene zeigten keinen Phänotyp. Auch der Doppel-knockout von SdrB und SdrC blieb Phänotyp-frei. Aus diesem Grund wurden die tandemartig im Genom vorliegenden Gene SdrD-F in einem Triple-knockout untersucht, ebenso wie ein Penta-knockout der Gene SdrB-F. Weiterhin konnten keine Auswirkungen auf die Phagocytose bzw. auf die Verwertung von Fettsäuren und die Mitoserate festgestellt werden. Ebenfalls verläuft der Aufbau und die Degradation von lipid droplets wildtypisch. Mittels Gaschromatographie gekoppelter Massenspektrometrie konnte jedoch ein geringer Unterschied in der Fettsäurekomposition der LDs festgestellt werden. Sobald diese fünf Proteine nicht mehr vorhanden sind, werden 5% weniger 18:1 Δ11 Fettsäuren gebildet und es verbleiben mehr 16:0 Fettsäuren in den LDs. Eine Übernahme der Funktion als Δ9 Desaturase, nach dem Abschnüren der LDs vom Endoplasmatischen Retikulum ist wahrscheinlich.

Untersuchung von Morphologie, Enzymverteilungen und Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Säugerzellen mittels hochauflösender MMM-4Pi-Mikroskopie in zwei Farben

Seit der Entdeckung des Golgi-Apparates im Jahre 1898 wurden seine Struktur, seine enzymatische Zusammensetzung und die Dynamik des in ihm stattfindenden Proteintransports intensiv untersucht. Dennoch blieben bis heute wesentliche Fragen zu seiner Funktionsweise unbeantwortet. So existieren nach wie vor mehrer konkurrierende Modelle zur Organisation der hoch komplexen räumlichen Verteilung seiner Enzyme sowie zum grundlegenden Mechanismus des Intra-Golgi Transports. Die Beantwortung dieser und weiterer Fragen ist für das Verständnis des Golgi-Apparates essentiell, aber aus methodischen Gründen höchst schwierig, da es bisher nicht möglich war die Struktur und Dynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit der hierfür notwendigen Auflösung und Geschwindigkeit zu untersuchen. Bis heute gibt es für die funktionsmorphologischen Untersuchungen des Golgi-Apparates lebender Zellen keine echte Alternative zur Fernfeld- Fluoreszenzmikroskopie. Das MMM-4Pi-Mikroskop ermöglicht als erstes Fluoreszenzmikroskop, aufgrund seiner Auflösung von ~200 nm in der Fokalebene und 100-150 nm entlang der optischen Achse, die Untersuchung der Subkompartimente des Golgi-Apparates und kann, aufgrund seiner hohen Aufnahmegeschwindigkeit von 0.5 Hz, die Dynamik des Intra-Golgi Transports zeitlich auflösen. Ziel dieser Arbeit war es daher, den Golgi-Apparate lebender Zellen in zwei Farben sowie mit einer bisher nicht möglichen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu untersuchen. Um die Leistungsfähigkeit der dreidimensionalen Bildgebung dieser Methode zu überprüfen, wurde erstmals der Golgi-Apparat fixierter Säugerzellen korrelativ mit dem Transmissionselektronenmikroskop und dem MMM-4Pi-Mikroskop aufgenommen. Die rekonstruierten Strukturen korrelierten in allen drei Raumrichtungen zu über 80%, was die Validität beider Methoden eindrucksvoll unter Beweis stellt. Zudem konnten mit dem MMM-4Pi-Mikroskop Aussackungen von Golgi-Cisternen aufgelöst werden, was die Eignung dieser Methode zur strukturellen Analyse der Subkompartimente des Golgi-Apparates unterstreicht. Des Weiteren wurde, in einer Reihe zweifarbiger Aufnahmeserien, die Verteilung dreier Golgi-Enzyme in lebenden Säugerzellen untersucht, und ihre mittlere relative Distanz bestimmt. Ihre aus der Literatur bekannten Lokalisationen konnten in zwei Fällen bestätigt (GalT, MannII) und in einem Fall korrigiert werden (2-OST). Im Gegensatz zu der konfokal bestimmten Cis-/Mid-Lokalisation von 2-OST zeigen die Ergebnisse der hoch aufgelösten Distanzanalyse deutlich, dass eine Mid-/Trans-Lokalisation vorliegt. Dieses Ergebnis wurde elektronenmikroskopisch überprüft und bestätigt. Da die räumliche Anordnung der Golgi-Enzyme die Reihenfolge ihrer Akitvität wiederspiegelt, ist eine möglichst präzise Bestimmung ihrer Konzentrationsverteilungen essentiell, um die Funktion des Golgi-Apparates zu verstehen. Insbesondere zeigt dieses Resultat, dass die Bestimmung der Lokalisation von Golgi-Enzymen über konfokale Kolokalisationsstudien zu falschen Ergebnissen führen kann. Die Kombination hoher räumlicher Auflösung mit einer schnellen Datenaufnahme erlaubte die Analyse der Transportdynamik innerhalb des Golgi-Apparates von Säugerzellen. In mehreren Zeitserien zweifarbiger Aufnahmen wurde der Transport des Frachtproteins VSVG relativ zum Trans-Golgi-Marker GalT untersucht. Dabei zeigte sich, dass das Trans-Golgi-Kompartiment in einigen Fällen durch eine deutliche Formänderung auf die Ankunft eines VSVG-Transportpulses reagierte und sich insgesamt wesentlich dynamischer verhielt als der Transportpuls selbst. Diese Beobachtung bestätigt tendenziell Transportmodelle, die den Golgi-Apparat nicht als statisches, sondern als dynamisches, aktiv am Transport beteiligtes Organell beschreiben. Die hier vorgestellten Experimente stellen die ersten Untersuchungen zur Verteilung von Golgi-Enzymen sowie zur Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit einer dreidimensionalen Auflösung im Bereich von 100-200 nm dar. Wie am Beispiel von 2 OST gezeigt, ist es mit dem MMM-4Pi-Mikroskop allgemein möglich, die Lokalisation von Golgi-Enzymen wesentlich präziser als bisher zu bestimmen. Bei der Untersuchung dynamischer Prozesse ist in naher Zukunft eine Steigerung der Leistungsfähigkeit der Methode zu erwarten. Zum einen werden CCD-Kameras mit kürzeren Auslesezeiten und einer elektronischen Verstärkung des Signals die Datenaufnahme weiter beschleunigen. Zum anderen könnte durch die Entwicklung eines parallelisierten Mikroskops mit Einphotonen-Anregung das Bleichen konsekutiver Aufnahmen verringert werden, wodurch längere Aufnahmeserien möglich sein werden.

Virus-Wirt-Interaktionen bei Hepatitis-B-Virus-Infektionen: Die Rolle von Gamma2-Adaptin

Mit etwa 350 Millionen chronisch-infizierten Menschen gehört die Hepatitis-B neben der Tuberkulose und AIDS zu den häufigsten Infektionskrankheiten der Welt. Der einzig sichere Schutz vor dem bis zur Leberzirrhose persistierenden Virus bietet eine vorbeugende Impfung. Eine angemessene Therapie chronisch-erkrankter Patienten ist durch die Unkenntnis über viele Bereiche des HBV-Lebenszyklus nur eingeschränkt möglich. Gegenstand dieser Arbeit war vor allem etwas Licht in das Wechselspiel zwischen HBV und der Wirtszelle zu bringen und zelluläre Komponenten und Mechanismen zu identifizieren, die am Sortierungs- und Transportmechanismus viraler Substrukturen zur sogenannten Assembly-Plattform beteiligt sind, um dort die Freisetzung des Virus zu initiieren. Mit der vorliegenden Arbeit habe ich Methoden der Zellbiologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und Virologie vereint, um neue Einblicke in den HBV-Lebenszyklus zu gewinnen. Für die Ausschleusung von HBV wird seither der konstitutive Weg der Sekretion angenommen. In Anlehnung an den Mechanismus umhüllter RNA-Viren kann die Hypothese aufgestellt werden, dass das MVB (Multivesicular Body) im Prozess der HBV-Freisetzung beteiligt sein könnte. Die Freisetzung des Hepatitis-B-Virus aus einer infizierten Zelle ist ein streng organisierter Prozess, der sowohl das HBV-Coreprotein als auch die HBV-Hüllproteine zu benötigen scheint. (max. 5.000 Zeichen)Inhaltszusammenfassung in einer weiteren Sprache deutschenglischfranzösischrussischmehrsprachigsonst.Ausgangspunkt der Arbeit war eine spezifische Interaktion des großen HBV-Hüllproteins (L) mit einem neuen Mitglied der Adaptor-Protein-Komplex-Familie (AP-Komplex), dem g2?Adaptin (Hartmann-Stühler und Prange, 2001), das mutmaßlich an endosomalen Sortierungs- und Transportprozessen beteiligt ist. In Analogie zur Funktionsweise von Adaptin-Molekülen wurde vom g2-Adaptin eine Rolle in der Initiation und Steuerung der Sprossung und Freisetzung von HBV vermutet. Die im Rahmen dieser Arbeit erweiterte Charakterisierung der g2/L-Interaktion zeigte zum einen, dass die Ohrdomäne des Adaptins für die Interaktion essentiell ist und zum anderen, dass die Rekrutierung des Adaptins durch das L-Protein zu cis-Golgi-Strukturen innerhalb kleiner Transportvesikel entlang des Nukleus (perinukleär) erfolgt. Erste Ergebnisse dieser Arbeit deuteten bereits an, dass das virale Coreprotein mit demselben Adaptorprotein zu interagieren vermag. Für die g2/Core-Interaktion erwies sich in Folgearbeiten die Kopfregion des g2-Adaptins als die entscheidende Bindungsdomäne (Rost et al., 2006). Sowohl eine funktionelle Inaktivierung des g2-Adaptins durch RNA-Interferenz als auch eine g2-Adaptin- Überexpression störten die Virusmontage in späten Phasen der Morphogenese. Während ein g2-Adaptin-Überschuss die HBV-Produktion indirekt durch die Induktion dysfunktioneller endosomaler Kompartimente blockierte, verhinderte der siRNA-induzierte g2-Adaptin-Verlust die späte Ausschleusung des Virus aus der Zelle. Das Silencing von g2-Adaptin zeigte dabei weder einen Einfluss auf endosomale Strukturen noch auf die Freisetzung subviraler Partikel (Viren ohne Genom). Demzufolge scheinen sich die Mechanismen der Produktion von subviralen und viralen HBV-Partikeln bezüglich ihrer Anforderungen an Zellfunktionen und Transportwegen deutlich voneinander zu unterscheiden. Es konnten erste Hinweise darauf gefunden werden, dass die Virusmontage an endosomalen Kompartimenten (zum Beispiel dem MVB) erfolgen könnte, was durch bereits weitergeführte Untersuchungen bestätigt werden konnte (Lambert et al., J Virol, epub ahead of print). Darüber hinaus ist inzwischen bekannt, dass das Hepatitis-B-Virus für den Zusammenbau und die Freisetzung nicht nur das Adaptor-verwandte g2-Adaptin, sondern auch die endosomale Ubiquitin Ligase Nedd4, wahrscheinlich in Zusammenhang mit Ubiquitin selbst (Rost et al., 2006), benötigt. Eine Untersuchung dieser weiterführenden Aspekte war jedoch nicht mehr Inhalt dieser Arbeit. Insgesamt weisen die Daten darauf hin, dass die Sortierung und der Transport der Substrukturen des Hepatitis-B-Virus durch den MVB-Komplex zu erfolgen scheint. Dabei könnte das g2-Adaptin mit Hilfe einer Reihe von Kofaktoren (wie zum Beispiel Nedd4, Ubiquitin, etc.) eine entscheidende Rolle an der Sortierung und Anbindung des viralen L- und Coreproteins an die Assembly-Plattform spielen. Doch der genaue Mechanismus, welcher große Ähnlichkeit mit dem umhüllter RNA-Viren (wie zum Beispiel HIV-1) aufweist, bleibt noch ungeklärt. Ob weitere zelluläre Kofaktoren an der HBV-Sprossung und Freisetzung beteiligt sind, bleibt ebenfalls unbekannt und bedarf weiterer Untersuchungen.

EPR spectroscopic investigation of membrane protein structure and folding on light harvesting complex LHCIIb

Structure and folding of membrane proteins are important issues in molecular and cell biology. In this work new approaches are developed to characterize the structure of folded, unfolded and partially folded membrane proteins. These approaches combine site-directed spin labeling and pulse EPR techniques. The major plant light harvesting complex LHCIIb was used as a model system. Measurements of longitudinal and transversal relaxation times of electron spins and of hyperfine couplings to neighboring nuclei by electron spin echo envelope modulation(ESEEM) provide complementary information about the local environment of a single spin label. By double electron electron resonance (DEER) distances in the nanometer range between two spin labels can be determined. The results are analyzed in terms of relative water accessibilities of different sites in LHCIIb and its geometry. They reveal conformational changes as a function of micelle composition. This arsenal of methods is used to study protein folding during the LHCIIb self assembly and a spatially and temporally resolved folding model is proposed. The approaches developed here are potentially applicable for studying structure and folding of any protein or other self-assembling structure if site-directed spin labeling is feasible and the time scale of folding is accessible to freeze-quench techniques.

Der enzymatische und anti-oxidative Mechanismus des anti-atherogenen Enzyms Paraoxonase-2

Das humane Enzym PON2 ist in eine Vielzahl pathophysiologischer Prozesse involviert und ist durch zwei Funktionen gekennzeichnet - eine enzymatische Laktonase-Aktivität und eine anti-oxidative Aktivität. Durch die Laktonase-Aktivität hydrolysiert PON2 vorwiegend das bakterielle Signalmolekül 3oxoC12. PON2 ist als Bestandteil des angeborenen Immunsystems anzusehen und trägt wahrscheinlich zur Immunabwehr gegen Infektionen mit den human-pathogenen Pseudomonas aeruginosa Bakterien bei. Durch die anti-oxidative Aktivität vermindert PON2 oxidative Schäden und verringert redox-abhängige pro-apoptotische Stimulation. Diese einzigartige Funktion von PON2 ist jedoch ambivalent zu betrachten, da hohe PON2-Spiegel zwar Arteriosklerose reduzieren können, aber im Verdacht stehen Tumorzellen zu stabilisieren.rnIn dieser Arbeit wurden die noch unbekannten Mechanismen und der Zusammenhang der enzymatischen und der anti-oxidativen Aktivität analysiert. In diesem Rahmen wurde gezeigt, dass PON2 spezifisch die Superoxidfreisetzung an Komplex I und III der Atmungskette in der inneren Mitochondrienmembran reduzieren kann. PON2 veränderte dabei weder die Aktivitäten der Superoxiddismutasen noch die Cytochrom C-Expression. Weiterhin konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass PON2 O2- nicht direkt abbaut, sondern vielmehr dessen Bildung verhindert. Diese Erkenntnisse implizieren, dass PON2 die anti-oxidative Aktivität über eine Beeinflussung des Quinon-Pools vermittelt. Anhand von verschiedenen Punktmutationen konnte gezeigt werden, dass die Histidinreste-114 und -133 für die Laktonase-Aktivität essentiell sind. Weiterhin wurden die Glykosylierungsstellen von PON2 identifiziert und gezeigt, dass die Glykosylierung, nicht aber der natürliche Polymorphismus Ser/Cys311 für die Laktonase-Aktivität von Bedeutung ist. Von besonderer Bedeutung ist, dass keine dieser Mutationen die anti-oxidative Aktivität beeinflusste, wodurch erstmals die Unabhängigkeit der beiden Funktionen von PON2 gezeigt werden konnte. rnEs war bekannt, dass PON2 gegen intrinsische und ER-Stress-induzierte Apoptose schützt. Die Spezifität der anti-oxidativen / anti-apoptotischen Wirkung wurde hier an einem weiteren pathophysiologischen Modell untersucht. 7-Ketocholesterol (7-KC) ist der Hauptbestandteil des pro-arteriosklerotischen oxLDL und verursacht in Zellen des Gefäßsystems ER-Stress, oxidativen Stress und Apoptose. Unerwarteterweise konnte PON2 Endothelzellen nicht gegen den 7-KC-induzierten Zelltod schützen. Mehrere unabhängige experimentelle Ansätze belegen, dass 7-KC in Endothelzellen im Gegensatz zu Gefäßmuskelzellen den Zelltod über Autophagie und nicht über ER-Stress oder intrinsische Apoptose bewirkt. Weiterhin führt 7-KC, wie auch 3oxoC12 und Thapsigargin zu einem Abbau der PON2-mRNA, die über die 5’UTR der PON2-mRNA vermittelt wird. Diese Arbeit vermittelt detaillierte mechanistische Einsichten in die Funktionen von PON2, die für ihre Rolle bei Arteriosklerose, in der körpereigenen Immunabwehr und bei Krebs entscheidend sind.rn