The role of Caulobacter crescentus XerC and XerD recombinases in site-specific recombination

XerC et XerD, deux recombinases impliquées dans la recombinaison site spécifique, résolvent les multimères d’ADN en monomères. Cette réaction se produit au niveau du site dif du chromosome, et nécessite le domaine C-terminale de la protéine de division cellulaire FtsK. Caulobacter crescentus est une bactérie aquatique de type Gram-négative qui se retrouve dans plusieurs environnements. Elle présente un cycle cellulaire asymétrique avec deux types de cellules distinctes. Cette propriété peut être utilisée pour synchroniser la croissance d’une population bactérienne pour permettre l’étude de l’expression de gènes à travers le temps et les liens entre le cycle cellulaire et le développement de la bactérie. La liaison à l’ADN et la capacité de former des complexes covalents (phosphotyrosyl) avec le site dif de C. crescentus (ccdif) ont été testé pour les recombinases de C. crescentus (ccXerC et ccXerD). Les deux recombinases ont eu une meilleure liaison au demi-site gauche de ccdif et sont incapable d’effectuer une liaison coopérative, contrairement à ce qui se produit au niveau du site dif de E. coli. La formation de complexes covalents a été testé en utilisant des «substrats suicides avec bris» marqués à la fluorescence ainsi que des protéines de fusion (marquées ou non à la fluorescence). Des complexes ADN-protéines résistants à la chaleur et au SDS ont été observé lors de la réaction de ccXerC et ccXerD de type sauvage avec ccdif, mais pas lors de la réaction de mutants avec le même ADN. Des complexes covalents phosphotyrosine sont formés de façon plus efficace sur les substrats suicides avec un bris au niveau du brin supérieur que ceux ayant un bris au niveau du brin inférieur. Dans les deux cas, c’est ccXerC qui est resté lié de façon covalente à l’ADN de ccdif.

Caractérisation des recombinases XerC et XerD de Proteus mirabilis

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Cloning and characterization of xerC gene of Streptococcus suis

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation des recombinases XerC et XerD de Proteus mirabilis

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Cloning and characterization of xerC gene of Streptococcus suis

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation moléculaire du rôle de facteurs accessoires ArgR et PepA au niveau de la recombinaison spécifique sur le site cer

Mon projet de recherche avait pour but de caractériser le rôle de deux protéines, ArgR et PepA, qui agissent en tant que facteurs accessoires de la recombinaison au niveau de deux sites cer du plasmide ColE1 présent dans la bactérie Escherichia coli. Ces deux protéines, couplées aux deux recombinases à tyrosine XerC et XerD, permettent la catalyse de la recombinaison site spécifique au niveau de la séquence cer, convertissant les multimères instables de ColE1 en monomères stables. Cette étude a principalement porté sur la région C-terminale de la protéine ArgR. Cette région de la protéine ArgR possède une séquence en acides-aminés et une structure similaire à celle de la protéine AhrC de Bacillus subtilis. De plus, AhrC, le répresseur de l’arginine de cette bactérie, est capable de complémenter des Escherichia coli mutantes déficientes en ArgR. Les régions C-terminales de ces protéines, montrent une forte similarité. De précédents travaux dans notre laboratoire ont démontré que des mutants d’ArgR comprenant des mutations dans cette région, en particulier les mutants ArgR149, une version tronquée d’ArgR de 149 acides-aminés, et ArgR5aa, une version comprenant une insertion de cinq acides-aminés dans la partie C-terminale, perdaient la capacité de permettre la recombinaison au niveau de deux sites cer présents dans le plasmide pCS210. Malgré cette incapacité à promouvoir la réaction de recombinaison en cer, ces deux mutants étaient toujours capables de se lier spécifiquement à l’ADN et de réprimer une fusion argA :: lacZ. Dans ce travail, les versions mutantes et sauvages d’ArgR furent surexprimées en tant que protéines de fusion 6-histidine. Des analyses crosslinking ont montré que la version sauvage et ArgR5aa pouvaient former des hexamères in-vitro de manière efficace, alors qu’ArgR149 formait des multimères de plus faible poids moléculaire. Des formes tronquées d’ArgR qui comportaient 150 acides-aminés ou plus, étaient encore capables de permettre la recombinaison en cer. Les mutants par substitution ArgRL149A et ArgRL151A ont tous montré que les substitutions d’un seul acide-aminé au sein de cette région avaient peu d’effets sur la recombinaison en cer. Les expériences de crosslinking protéine-à-protéine ont montré que le type sauvage et les formes mutantes d’ArgR étaient capables d’interagir avec la protéine accessoire PepA, également impliquée dans la recombinaison en cer. Les expériences de recombinaison in-vitro utilisant la forme sauvage et les formes mutantes d’ArgR combinées avec les protéines PepA, XerC et XerD purifiées, ont montré que le mutant ArgR149 ne soutenait pas la recombinaison, mais que le mutant ArgR5aa permettait la formation d’une jonction d’Holliday. Des expériences de topologie ont montré que PepA était capable de protéger l’ADN de la topoisomérase 1, et d’empêcher ArgRWt de se lier à l’ADN. Les deux mutants ArgR149 et ArgR5aa protègent aussi l’ADN avec plus de surenroulements. Quand on ajoute PepA, les profils de migration montrent un problème de liaison des deux mutants avec PepA. D’autres expériences impliquant le triplet LEL (leucine-acide glutamique-leucine) et les acides-aminés alentour devraient être réalisés dans le but de connaitre l’existence d’un site de liaison potentiel pour PepA.

Système de recombinaison Xer chez Staphylococcus aureus

Le système de recombinaison Xer est impliqué dans la monomerisation des réplicons bactériens, comme les plasmides et les chromosomes, dans une grande variété de bactéries. Ce système est un système de recombinaison site-spécifique composé de deux tyrosine recombinases, soit XerC et XerD. Ils agissent ensemble afin de convertir les chromosomes dimériques en monomères en agissant à un site spécifique près du terminus de la réplication, appelé le site dif. Les gènes Xer et leur site d’action sont identifiés dans plusieurs bactéries gram positives et gram négatives. Staphylococcus aureus représente une bactérie gram positive qui contient un système XerCD/dif. Elle est impliqué dans plusieurs maladies humaines, tels que des infections cutanées, des gastroentérites, et le syndrome de choc toxique, pour en nommer quelques unes. Bien que les gènes codant les protéines XerC et XerD ont été identifiés, il y a beaucoup d’inconnu sur leur mode d’action au site dif. Des mutations dans XerC ont été obtenues, mais aucune dans XerD, suggérant que ce gène pourrait être essentiel pour cet organisme. Les études présentées dans ce mémoire ont permis de commencer à mieux caractériser XerD de S. aureus, en séquençant le gène et en faisant des tests de liaison à l’ADN. Elles ont montré que la recombinase XerD se lie au site dif d’Eschericia coli seul et de façon coopérative avec la recombinase XerC d’E. coli. XerD de S. aureus est, aussi, efficace dans la complémentation de XerD muté d’E. coli dans la réaction de recombinaison chromosomique. Cependant, elle ne démontre pas cette même capacité de complémentation lors de la recombinaison plasmidique aux sites cer.

Le système de recombinaison site-spécifique dif/Xer de Campylobacter jejuni

Chez les bactéries à chromosome circulaire, la réplication peut engendrer des dimères que le système de recombinaison site-spécifique dif/Xer résout en monomères afin que la ségrégation des chromosomes fils et la division cellulaire se fassent normalement. Ses composants sont une ou deux tyrosines recombinases de type Xer qui agissent à un site de recombinaison spécifique, dif, avec l’aide de la translocase FtsK qui mobilise l’ADN au septum avant la recombinaison. Ce système a été d’abord identifié et largement caractérisé chez Escherichia coli mais il a également été caractérisé chez de nombreuses bactéries à Gram négatif et positif avec des variantes telles que les systèmes à une seule recombinase comme difSL/XerS chez Streptococcus sp et Lactococcus sp. Des études bio-informatiques ont suggéré l’existence d’autres systèmes à une seule recombinase chez un sous-groupe d’ε-protéobactéries pathogènes, dont Campylobacter jejuni et Helicobacter pylori. Les acteurs de ce nouveau système sont XerH et difH. Dans ce mémoire, les premières recherches in vitro sur ce système sont présentées. La caractérisation de la recombinase XerH de C. jejuni a été entamée à l’aide du séquençage de son gène et de tests de liaison et de clivage de l’ADN. Ces études ont montré que XerH pouvait se lier au site difSL de S. suis de manière non-coopérative : que XerH peut se lier à des demi-sites de difSL mais qu’elle ne pouvait, dans les conditions de l’étude effectuer de clivage sur difSL. Des recherches in silico ont aussi permis de faire des prédictions sur FtsK de C. jejuni.

Les systèmes Xer à une seule recombinase

Les dimères chromosomiques se produisant lors de la réparation de chromosomes circulaires peuvent être dommageables pour les bactéries en bloquant la ségrégation des chromosomes et le bon déroulement de la division cellulaire. Pour remédier à ce problème, les bactéries utilisent le système Xer de monomérisation des chromosomes. Celui-ci est composé de deux tyrosine recombinases, XerC et XerD, qui vont agir au niveau du site dif et procéder à une recombinaison qui aura pour effet de séparer les deux copies de l’ADN. Le site dif est une séquence d’ADN où deux répétitions inversées imparfaites séparées par six paires de bases permettent la liaison de chacune des recombinases. Cette recombinaison est régulée à l’aide de FtsK, une protéine essentielle de l’appareil de division. Ce système a été étudié en profondeur chez Escherichia coli et a aussi été caractérisée dans une multitude d’espèces variées, par exemple Bacillus subtilis. Mais dans certaines espèces du groupe des Streptococcus, des études ont été en mesure d’identifier une seule recombinase, XerS, agissant au niveau d’un site atypique nommée difSL. Peu de temps après, un second système utilisant une seule recombinase a été identifié chez un groupe des epsilon-protéobactéries. La recombinase fut nommée XerH et le site de recombinaison, plus similaire à difSL qu’au site dif classique, difH. Dans cette thèse, des résultats d’expériences in vitro sur les deux systèmes sont présentés, ainsi que certains résultats in vivo. Il est démontré que XerS est en mesure de se lier de façon coopérative à difSL et que cette liaison est asymétrique, puisque XerS est capable de se lier à la moitié gauche du site prise individuellement mais non à la moitié droite. Le clivage par XerS est aussi asymétrique, étant plus efficace au niveau du brin inférieur. Pour ce qui est de XerH, la liaison à difH est beaucoup moins coopérative et n’a pas la même asymétrie. Par contre, le clivage est asymétrique lui aussi. La comparaison de ces deux systèmes montrent qu’ils ne sont pas homologues et que les systèmes Xer à seule recombinase existent sous plusieurs versions. Ces résultats représentent la première découverte d’un espaceur de 11 paires de bases chez les tyrosine recombinases ainsi que la première étude in vitro sur XerH.

A site-specific recombinase is required for competitive root colonization by Pseudomonas fluorescens WCS365

A colonization mutant of the efficient root-colonizing biocontrol strain Pseudomonas fluorescens WCS365 is described that is impaired in competitive root-tip colonization of gnotobiotically grown potato, radish, wheat, and tomato, indicating a broad host range mutation. The colonization of the mutant is also impaired when studied in potting soil, suggesting that the defective gene also plays a role under more natural conditions. A DNA fragment that is able to complement the mutation for colonization revealed a multicistronic transcription unit composed of at least six ORFs with similarity to lppL, lysA, dapF, orf235/233, xerC/sss, and the largely incomplete orf238. The transposon insertion in PCL1233 appeared to be present in the orf235/233 homologue, designated orf240. Introduction of a mutation in the xerC/sss homologue revealed that the xerC/sss gene homologue rather than orf240 is crucial for colonization. xerC in Escherichia coli and sss in Pseudomonas aeruginosa encode proteins that belong to the λ integrase family of site-specific recombinases, which play a role in phase variation caused by DNA rearrangements. The function of the xerC/sss homologue in colonization is discussed in terms of genetic rearrangements involved in the generation of different phenotypes, thereby allowing a bacterial population to occupy various habitats. Mutant PCL1233 is assumed to be locked in a phenotype that is not well suited to compete for colonization in the rhizosphere. Thus we show the importance of phase variation in microbe–plant interactions.

Circles: The replication-recombination-chromosome segregation connection

Crossing over by homologous recombination between monomeric circular chromosomes generates dimeric circular chromosomes that cannot be segregated to daughter cells during cell division. In Escherichia coli, homologous recombination is biased so that most homologous recombination events generate noncrossover monomeric circular chromosomes. This bias is lost in ruv mutants. A novel protein, RarA, which is highly conserved in eubacteria and eukaryotes and is related to the RuvB and the DnaX proteins, γ and τ, may influence the formation of crossover recombinants. Those dimeric chromosomes that do form are converted to monomers by Xer site-specific recombination at the recombination site dif, located in the replication terminus region of the E. coli chromosome. The septum-located FtsK protein, which coordinates cell division with chromosome segregation, is required for a complete Xer recombination reaction at dif. Only correctly positioned dif sites present in a chromosomal dimer are able to access septum-located FtsK. FtsK acts by facilitating a conformational change in the Xer recombination Holliday junction intermediate formed by XerC recombinase. This change provides a substrate for XerD, which then completes the recombination reaction.