Efeito de micobactéria ambiental (Mycobacterium avium) na imunidade induzida pela vacina gênica para tuberculose (pVAXhsp65)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Efeito da vacina gênica para tuberculose(pVAXhsp65) na encefalite autoimune experiemtal

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Efeito modulador de estratégias vacinais para tuberculose na encefalite autoimune experimental (EAE)

Pós-graduação em Doenças Tropicais - FMB

Proposição de estratégias para controle profilático e terapêutico da encefalite autoimune experimental baseadas no efeito imunorregulador da hsp65

Pós-graduação em Doenças Tropicais - FMB

Efeito modulador da estratégia vacinal BCG/DNAhsp65 na encefalite autoimune experimental(EAE)

Tanto o BCG (Bacilo de Calmette-Guérin) quanto a DNAhsp65 são vacinas contra tuberculose, porém além da atividade protetora desejável ambas apresentam atividade imunomoduladora. Seguindo a linha de pesquisa de nosso laboratório que investiga a atividade da DNAhsp65 sobre doenças autoimunes, avaliamos o efeito da associação destas vacinas sob a forma de uma estratégia vacinal tipo prime-boost (priming com BCG seguida de booster com DNAhsp65), sobre o desenvolvimento da Encefalite Autoimune Experimental (EAE), que é modelo animal de esclerose múltipla. Ratos Lewis fêmeas foram divididos em grupos de 5 a 6 animais (salina, BCG, EAE, BCG/EAE, BCG/vetor/EAE e BCG/vacina/EAE) e imunizados em intervalos de 15 dias. Os animais receberam um primming com 2 - 10 x 105 unidades formadoras de colônias de BCG subcutâneo seguido de dois boosters com 300 g de pVAXhsp65 numa solução de sacarose 25% por via intramuscular. A EAE foi induzida 15 dias após a última imunização, por inoculação de 25 g de proteína básica de mielina (MBP) associada ao Adjuvante Completo de Freund contendo Mycobacterium butyricum. Aqueles que não receberam os inóculos descritos foram injetados com salina, exceto o grupo BCG/vetor/EAE que recebeu 300 g de pVAX (vetor plasmidial vazio) também em solução de sacarose. Os animais foram acompanhados diariamente até serem submetidos à eutanásia, 3 semanas mais tarde, durante a fase de recuperação da doença para avaliação da resposta imune, escore clínico e presença de infiltrado inflamatório no SNC. A evolução clínica da EAE foi similar entre animais vacinados e não vacinados, mas a análise histopatológica revelou que a imunização prévia com BCG ou BCG/DNAhsp65 diminui o processo inflamatório. No cérebro foi observada redução acentuada do processo inflamatório nos grupos BCG/EAE, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Avaliação na linhagem endotelial tEnd dos efeitos diretos da transferência gênica de IFNbeta e p19arf e efeitos parácrinos mediados pela linhagem B16 transduzida pelos mesmos vetores adenovirais

A vascularização tem um papel central na progressão tumoral e representa um alvo terapêutico de grande interesse. A inibição da angiogênese tem potencial de retardar a progressão tumoral e inibir metástase. Em decorrência disto, terapias anti-angiogênicas têm demonstrado ser promissora no controle do crescimento tumoral. Segundo a literatura, interferon-? (IFN?, ativador do sistema imune inato e adaptativo) e p19Arf (supressor de tumor e parceiro funcional de p53), quando estudados individualmente, alteram a vasculatura tumoral. Nosso grupo construiu e utilizou vetores adenovirais recombinantes portadores dos cDNAs de INFbeta e p19Arf e observou que a transferência desta combinação de genes induziu morte celular e diminuiu progressão tumoral, resultados foram observados em modelos murinos de melanoma B16 de terapia genica in situ, vacina profilática e vacina terapêutica. Neste trabalho, exploramos a ideia que a combinação dos vetores adenovirais portadores de INFbeta e p19Arf proporcionam efeitos anti-angiogênicos através de seu impacto em células endoteliais. Para averiguarmos essa hipótese, células endoteliais murinas (tEnd) foram transduzidas com os vetores adenovirais, revelando que o vetor Ad-p19 confere inibição da proliferação, formação de tubos, migração e induz aumento na expressão de genes relacionados a via de p53 e morte celular. O vetor Ad-IFNbeta sozinho ou adicionado em combinação com Ad-p19, não teve impacto significante nestes ensaios. Alternativamente, a influencia indireta, ou parácrina, nas células tEnd cultivadas juntamente com as células B16 transduzidas com os vetores adenovirais também foi investigada. Quando as células B16 foram transduzidas com Ad-IFNbeta ou a co-transdução Ad-IFNbeta+Ad-p19 em co-cultura com a linhagem tEnd, houve inibição da proliferação. Não observamos efeito inibitório na tEnd da co-cultura quando as células da B16 foram transduzidas somente com Ad-p19. Seguindo o ensaio de co-cultura, produzimos meio condicionado da B16 transduzida com os vetores e aplicamos esses meios nas células tEnd. Observamos que Ad-IFN, sozinho ou em combinação com Ad-19, diminuiu a viabilidade, proliferação e levou a morte das células tEnd. Neste trabalho, constamos que inibição de células endoteliais pode ser realizada por transdução direta com Ad-19 ou quando estas células são expostas ao ambiente modulado por células tumorais transduzidas com o vetor Ad-IFNbeta. Mesmo que a transferência gênica de ambos IFNbeta e p19Arf não demonstrou ser uma abordagem superior à aplicação dos genes isolados, observamos que nossa abordagem pode ter um impacto importante na inibição da angiogênese pelas células endoteliais

Desarrollo de nanopartículas sólidas lipídicas como sistemas de administración de ADN para terapia génica

290 p. (Bibliogr. 257-290) Correo electrónico de la autora: ana.delpozo@ehu.es

Avaliações econômicas do uso da vacina contra o Papilomavírus Humano (HPV) em meninas adolescentes: uma revisão sistemática

O câncer de colo do útero persiste como um importante problema de saúde em todo o mundo, em particular nos países em desenvolvimento. Duas vacinas contra o papilomavirus humano (HPV) encontram-se atualmente disponíveis e aprovadas para uso em meninas adolescentes, antes do início da vida sexual: uma bivalente, contra os sorotipos 16 e 18 e outra quadrivalente, contra os sorotipos 6, 11, 16 e 18. Estes imunobiológicos têm por objetivo induzir uma imunidade contra o papilomavírus e, desta forma, atuar na prevenção primária do câncer do colo de útero. As avaliações econômicas podem ser um elemento que auxiliem nos processos de tomada de decisão sobre a incorporação da vacina em programas de imunização nacionais. Estas avaliações foram o objeto central deste trabalho, que teve como objetivo sintetizar as evidências procedentes de uma revisão sistemática da literatura de estudos de avaliação econômica da utilização da vacina contra o HPV em meninas adolescentes e pré-adolescentes. Foi realizada uma busca na literatura nas bases MEDLINE (via Pubmed), LILACS (via Bireme) e National Health Service Economic Evaluation Database (NHS EED) ate junho de 2010. Dois avaliadores, de forma independente, selecionaram estudos de avaliação econômica completa, que tivessem como foco a imunização para HPV em mulheres com as vacinas comercialmente disponíveis direcionada à população adolescente. Após a busca, 188 títulos foram identificados; destes, 39 estudos preencheram os critérios de elegibilidade e foram incluídos na revisão. Por tratar-se de uma revisão de avaliações econômicas, não foi realizada uma medida de síntese dos valores de relação incremental entre custos e efetividade. Os 39 artigos incluídos envolveram 51 avaliações econômicas em 26 países. Predominaram estudos de custo-utilidade (51%). Do ponto de vista da perspectiva da análise, predominou o dos sistemas de saúde (76,4%). A maioria dos trabalhos (94,9%) elegeu meninas, com idade entre 9 e 12 anos, como sua população alvo e desenvolveu simulações considerando imunidade para toda a vida (84,6%). Os modelos utilizados nos estudos foram do tipo Markov em 25 análises, de transmissão dinâmica em 11 e híbridos em 3. As análises de sensibilidade revelaram um conjunto de elementos de incerteza, uma parte significativa dos quais relacionados a aspectos vacinais: custos da vacina, duração da imunidade, necessidade de doses de reforço, eficácia vacinal e cobertura do programa. Estes elementos configuram uma área de especial atenção para futuros modelos que venham a ser desenvolvidos no Brasil para análises econômicas da vacinação contra o HPV.

Desenvolvimento e manutenção de memória imunológica após imunização contra Neisseria meningitidis B com a vacina VA-MENGOC-BC

Neisseria meningitidis é uma das principais causas de meningite bacteriana e septicemia em todo o mundo, acometendo principalmente crianças menores de 4 anos. Atualmente, não existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A imunidade protetora contra o meningococo caracteriza-se pela presença e persistência de anticorpos bactericidas, porém pouco se sabe sobre os mecanismos de desenvolvimento desta memória sorológica. Avaliamos em modelo animal e em humanos, a geração e manutenção das células secretoras de anticorpos (ASC) e dos linfócitos B de memória (LBm) após vacinação contra MenB. Utilizamos como referência a vacina diftérica (dT ou DTP), considerada ter ótima eficácia em humanos. Para o estudo em modelo animal, grupos de 6 a 8 camundongos suíços, fêmeas, de 5 a 6 semanas, foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC ou DTP, via intramuscular, com intervalo de 2 semanas entre as doses. Aproximadamente 2, 4 ou 6 meses após a última dose, os animais receberam a dose reforço. A vacina anti-MenB induziu uma resposta primária de ASC maior que a resposta à dose reforço. Ao contrário, a resposta de ASC à vacina dT foi maior após o booster. A resposta de LBm anti-MenB permaneceu constante (média de 1%) ao longo de todo o estudo, mas a resposta ao toxóide diftérico (TD) foi maior após o booster (média de 1,9%) que após a imunização primária. A concentração de IgG, anticorpos bactericidas e opsonizantes contra MenB foi dose-dependente e foi reativada após a administração das doses reforços. Esses resultados sugerem que os LBm presentes no baço foram responsáveis pela forte resposta de anticorpos observada após a dose reforço. Para o TD, ambos ASC e LBm foram importantes na manutenção da memória sorológica. Para o estudo em humanos, seis voluntários foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC, via intramuscular, com intervalo de 6 a 7 semanas entre as doses. Seis meses após a imunização primária, os indivíduos receberam uma dose reforço. Outro grupo de voluntários (n = 5) foi imunizado com uma dose reforço da vacina dT. Somente após a terceira dose da vacina anti-MenB foi possível detectar a presença de LBm em todos os indivíduos. Seis meses após a imunização primária, a frequência de LBm voltou ao seu nível basal e não foi reativada após a dose booster. A vacina dT também induziu uma resposta de LBm heterogênea, mas esta foi 5 vezes maior que a induzida por VA-MENGOC-BC. A resposta de anticorpos funcionais anti-MenB foi de curta duração com pequena reativação após a dose reforço. As duas vacinas induziram diferentes frequências de LT de memória central (TCM) e de memória efetora (TEM) após a vacinação primária e após o booster. A resposta à dose booster foi caracterizada pelo aumento da população de linfócitos TCM e diminuição de TEM. A população de linfócitos TCM apresentou maior ativação (CD69+) que os linfócitos TEM, especialmente após a vacinação contra MenB. Concluindo, os dados desta tese indicam que a administração de 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC teve uma eficiência limitada em humanos e sugerem que a baixa eficácia da vacina, quando utilizada na década de 90 em São Paulo e no Rio de Janeiro, pode estar relacionada à deficiência na geração e manutenção de LBm específicos.

Otimização do ciclo de liofilização de uma vacina viral

A liofilização - ou secagem a frio (freeze drying em inglês) - é um complexo processo multiestágios, onde o produto é primeiramente congelado e sua secagem feita através de sublimação. Devido a esta forma de secagem a liofilização se torna um processo atrativo particularmente importante para a estabilização de componentes orgânicos hidratados e lábeis, de origem biológica. O processo de liofilização é amplamente empregado na indústria farmacêutica, porém em termos de gestão de processo, deve-se evitar a liofilização a todo custo, pois o processo possui diversas desvantagens como: equipamentos de alto investimento, alta demanda energética, processo que demanda tempos longos e produtos com facilidade de hidratar e frágeis, necessitando ser cuidadosamente embalados e armazenados. Este trabalho tem como objetivo a diminuição do ciclo de liofilização de uma vacina viral e analisar a possibilidade de carregamento desse produto no liofilizador a temperaturas negativas, de forma a possibilitar o aumento de produtividade. Para tal, foram realizados três experimentos com ciclos de liofilização com 17 e 20h a menos que o ciclo de liofilização da vacina comercial. Os experimentos foram realizados com a mesma formulação do lote comercial e utilizando um liofilizador piloto. As modificações foram realizadas nas propriedades físicas do ciclo de liofilização atual (temperatura, pressão e tempo) e na temperatura de carga do produto, sem alteração na formulação da vacina ou embalagem primária. Amostras do produto liofilizado experimental foram analisadas quanto ao seu aspecto, desempenho, umidade residual, potência e termoestabilidade acelerada segundo os Mínimos Requerimentos da Organização Mundial da Saúde. Todos os resultados analisados estiveram dentro das especificações e próximos ou melhores quando comparados aos lotes comerciais de origem

Análise da variabilidade gênica de antígenos de T. cruzi com aplicação para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas

A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. Testes tradicionais de diagnóstico estão sendo gradualmente substituídos por métodos inovadores. A utilização de antígenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e várias combinações foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clínicas de diferentes regiões da América Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade genética dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antígenos comumente utilizados em diagnóstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonômicos e de diferentes regiões foram analisadas para avaliar o impacto da variação antigênica em testes de diagnóstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com epítopos de outros agentes patogênicos deve permitir a concepção de melhores testes rápidos. Num primeiro passo, DNA genômico foi extraído das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificação dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antígenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expressão e detecção dos antígenos recombinantes. Na etapa final, análises de estruturas secundárias e terciárias, a última apenas para o antígeno 1F8, visualizaram as diferenças nas sequências de aminoácidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antígeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequência de aminoácidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antigênico desta proteína em todos os tripanosomatídeos que apresentaram alta similaridade com o antígeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presença de epítopos específicos de T. cruzi. O antígeno 1F8 pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da doença de Chagas e que será necessário aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antigênicos para futuramente elaborar poli-epítopos sintéticos adaptados de um maior número possível de antígenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnóstico sorológico e de teste rápido da doença de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimização de antígenos recombinantes para o diagnóstico da doença de Chagas.

Efeitos pleiotrópicos da telmisartana nos tecidos adiposos branco e marrom: aumento da expressão gênica e proteica pan-PPAR em camundongos obesos

Receptores ativadores de proliferação perixossomal(PPARs) são fatores de transcrição envolvidos com a oxidação dos ácidos graxos e proliferação celular, mediando diversas vias, o que representa uma estratégia promissora para enfrentar as características da síndrome metabólica. Existem três isoformas de PPARs(PPARalfa, beta/delta e gama), que são diferencialmente expressos em diferentes tecidos.No presente estudo, objetivou-se avaliar os efeitos pleiotrópicos da telmisartana, um anti-hipertensivo, bloqueador do receptor AT1 da angiotensina e agonista parcial PPAR gama, no tecido adiposo branco (TAB) e marrom (TAM) em camundongos obesos induzido por dieta.Camundongos machos, da linhagem C57BL/6 foram alimentados com uma dieta padrão (standard-chow, 10% da energia proveniente de lipídios) ou com uma dieta com alto teor lipídico (high fat, 49% de energia proveniente de lipídios) durante 10 semanas. Em seguida, os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos: SC, SC-T, HF e HF-T (n=10). O fármaco foi administrado (10mg/kg de dieta) durante 4 semanas para os grupos SC-T e HF-T.O grupo HF apresentou sobrepeso, hipertensão arterial sistêmica, perfil de adipocinas pró-inflamatórias, resistência insulínica, diminuição do gasto energético, comprometimento do metabolismo da glicose e distribuição anormal da massa adiposa. Além disso, a obesidade ocasionou diminuição da expressão de PPARalfa, beta/delta e gama noTAB e TAM, resultando na inadequação da captação de glicose e termogênese insuficiente. Por outro lado,a ativação das três isoformas de PPARs, a melhora do perfil inflamatório das adipocinas, o aumento da sensibilidade à insulina e a melhora da captação de glicose, foi vistaapós o tratamento com telmisartana. A ativação dos PPARs no TAB trouxe muitos benefícios. No TAM, resultados surpreendentes foram que a telmisartana provocou o aumento da expressão do recepetor adrenérgico beta 3 (RAβ3), induzido pela ativação de PPARbeta/delta e maior termogênese comaumento da expressão da proteína desacopladora1 (UCP1). Em conclusão, nossos resultados mostram que telmisartanaaumenta a expressão gênica e proteica PAN-PPAR no TAB e TAM em camundongos obesos induzidos por dieta. Nossas observações mostram que, apesar do grupo HF-T ter reduzido a ingestão energética, os efeitossão explicados pela ativação PAN-PPAR da telmisartana, causando a ativação da termogênese e resultando num balanço energético negativo.

Caracterização da expressão gênica dos receptores colinérgicos nicotínicos (CHRNs) no epitélio esofágico normal e em carcinoma epidermóide de esôfago

O câncer de esôfago (CE) é uma doença extremamente agressiva e é um dos tumores mais incidentes e letais no Brasil e no mundo, sendo o carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) o principal subtipo histológico, apresentando como principais fatores de risco o etilismo e o tabagismo na população ocidental. A exposição concomitante desses dois fatores representa um risco multiplicador para o desenvolvimento de CEE, sendo que o fumo parece ter um papel importante tanto na iniciação quanto na promoção do tumor, enquanto o álcool teria um papel mais relevante na promoção. Componentes do tabaco, como a nicotina e as nitrosaminas são potentes carcinógenos e agonistas de alta afinidade dos receptores colinérgicos nicotínicos (CHRNs), podendo atuar ativando vias de sinalização celular fundamentais para a progressão tumoral. Pouco se sabe sobre a expressão e regulação dos CHRNs na mucosa esofágica e no processo de carcinogênese desse tecido. Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar a expressão gênica dos CHRNs no epitélio esofágico normal e em CEE, bem como sua regulação pelos fatores de risco associados ao tumor. Foi observado que as subunidades α3, α5, α7 e β4 são expressas no epitélio esofágico saudável humano enquanto as subunidades α1, α4, α9 e α10 apresentaram baixa ou nenhuma expressão nesse mesmo tecido. Além disso, foram encontradas diferenças de expressão das subunidades α3 e α7 em indivíduos etilistas e tabagistas quando comparados com indivíduos não-etilistas (subunidade α3) e não-tabagistas (subunidade α7). Nas amostras de CEE, as subunidades CHRNA5 e CHRNA7 foram encontradas superexpressas no tumor quando comparado ao tecido normal adjacente e observou-se diferença de expressão da subunidade α7 no tumor comparado com o tecido saudável e a subunidade β4 apresentou-se mais expressa no tecido tumoral e no tecido normal adjacente ao tumor do que no epitélio esofágico saudável. Entretanto, não foram encontradas diferenças de expressão de nenhuma das subunidades avaliadas nas linhagens CEE quando submetidas a tratamento com nicotina ou etanol. Os resultados obtidos sugerem uma participação dos CHRNs na fisiologia do epitélio esofágico e que os fatores de risco associados ao desenvolvimento de CEE parecem ser capazes de afetar a expressão desses receptores no epitélio esofágico.

Comparação do uso de noradrenalina, nitroprussiato e levosimendan na terapia do choque hipovolêmico: efeitos sobre a microcirculação e expressão gênica renal

Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos sistêmicos, microcirculatórios assim como mudanças na expressão gênica renal, causados pela ação da noradrenalina, nitropussiato de sódio e levosimendan no tratamento do choque hemorrágico. Nesse estudo foi utilizado o modelo da câmara dorsal.Os animais foram sujeitos a choque hemorrágico e após, foram aleatoriamente divididos em quatro grupos. Os grupos foram: CTRL, recebeu apenas ringer lactato; NPS recebeu ringer lactato com nitroprussiato de sódio; NA recebeu ringer lactato com noradrenalina e LEV, recebeu ringer lactato com levosimendan. Foram avaliados parâmetros sistêmicos, assim como parâmetros microcirculatórios (comparados como percentual em relação ao momento basal). Além disso, foi avaliada a expressão gênica renal de eNOS, HIF-1α, ICAM e caspase-3. O grupo NPS apresentou uma recuperação sustentada do diâmetro arteriolar ( 89 12 %) e DCF (125 114 %) ao final do tratamento. Houve recuperação da velocidade de hemácias nos grupos CTRL e NPS. Não houve diferença em relação ao número de leucócitos aderidos e/ou rolantes ao final do tratamento. A expressão gênica renal de eNOS e caspase-3 entre os grupos não apontou diferenças, entretanto houve diferença significativa na expressão renal de HIF- 1α no grupo NA (0,65 0,08, UA) em relação ao grupo CTRL (0,44 0,06, UA) e LEV (0,45 0,06, UA). Todos os grupos tiveram uma maior expressão de ICAM (0,65 0,12; 0,7 0,12; 0,069 0,06; 0,65 0,12, UA) em relação ao grupo SHAM (0,50 0,05, UA). Ringer lactato puro ou associado com noradrenalina ou levosimendan não foram suficientes para recuperar e sustentar os parâmetros microvasculares. O tratamento com nitroprussiato de sódio foi o que apresentou os melhores resultados, com recuperação dos diâmetros arteriolar, da DCF e velocidade de hemácias.

Validação dos processos envolvidos na obtenção do polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b conjugado com toxóide tetânico utilizado para produção de vacina

Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é a principal causa de pneumonia bacteriana e meningite em crianças com menos de 5 anos de idade. A doença pode ser prevenida através da vacinação com uma vacina conjugada polissacarídeo-proteína, uma vez que a vacina de polissacarídeo não é eficaz. Desde 1999, o Ministério da Saúde incluiu a vacina conjugada Hib na rotina do calendário de imunização para crianças rotineiramente. Sendo este um processo de grande importância para as pessoas e demanda de produção significativa para o governo brasileiro, é necessário que os processos estejam de acordo com as normas nacionais e internacionais de regulamentação e devem ser validados. Uma operação validada assegura a produção de lotes uniformes que atendem as especificações exigidas, consequentemente, garantindo ao fabricante a capacidade de proporcionar um produto de qualidade. O trabalho propõe o desenvolvimento de uma metodologia que evidencie e garanta o processo de produção de um conjugado de polissacarídeo-proteína pelo método de conjugação química e que será produzido de forma consistente e de acordo com as suas especificações pré-definidas. Os atributos de qualidade garantem o não desabastecimento da vacina Haemophilus influenzae tipo b por desvios de processo, o que contribui com aumento do valor agregado ao produto em questão. Portanto, a metodologia de validação foi aplicada ao estudo de validação. O estudo baseou-se em três etapas. A primeira foi baseada em análise de parâmetros do processo de conjugação química para mapear e estabelecer intervalos críticos de controle quanto a estes parâmetros, a segunda fase foi realizada com a produção de três lotes consecutivos, em escala industrial, com monitorização regular dos parâmetros críticos mapeados anteriormente. A fase final consistiu em amostras recolhidas, em tempo pré-determinado, durante o processo de produção e de controle do produto final em tamanho 50% a mais que na rotina de produção. Estas amostras foram analisadas utilizando os métodos de análise que foram anteriormente validados, a fim de garantir a reprodutibilidade dos resultados. A robustez do processo foi assegurada uma vez que todos os parâmetros do processo avaliados apresentaram resultados dentro do padrão de conformidade com os resultados de controle determinados durante o processo, e no produto final para a população de amostragem dentro de especificações definidas pelas metodologias analíticas validadas garantindo os resultados. O trabalho proposto assegura status de processo validado para o conjugado polissacarídeo-proteína com excepcionais rendimentos obtidos, combinado com características químicas bem definidas