Subnuclear localization of the active variant surface glycoprotein gene expression site in Trypanosoma brucei

In Trypanosoma brucei, transcription by RNA polymerase II and 5′ capping of messenger RNA are uncoupled: a capped spliced leader is trans spliced to every RNA. This decoupling makes it possible to have protein-coding gene transcription driven by RNA polymerase I. Indeed, indirect evidence suggests that the genes for the major surface glycoproteins, variant surface glycoproteins (VSGs) in bloodstream-form trypanosomes, are transcribed by RNA polymerase I. In a single trypanosome, only one VSG expression site is maximally transcribed at any one time, and it has been speculated that transcription takes place at a unique site within the nucleus, perhaps in the nucleolus. We tested this by using fluorescence in situ hybridization. With probes that cover about 50 kb of the active 221 expression site, we detected nuclear transcripts of this site in a single fluorescent spot, which did not colocalize with the nucleolus. Analysis of marker gene-tagged active expression site DNA by fluorescent DNA in situ hybridization confirmed the absence of association with the nucleolus. Even an active expression site in which the promoter had been replaced by an rDNA promoter did not colocalize with the nulceolus. As expected, marker genes inserted in the rDNA array predominantly colocalize with the nucleolus, whereas the tubulin gene arrays do not. We conclude that transcription of the active VSG expression site does not take place in the nucleolus.

Mechanisms Mediating Antigenic Variation in Trypanosoma brucei

Antigenic variation in Trypanosoma brucei is a highly sophisticated survival strategy involving switching between the transcription of one of an estimated thousand variant surface glycoprotein (VSG) genes. Switching involves either transcriptional control, resulting in switching between different VSG expression sites; or DNA rearrangement events slotting previously inactive VSG genes into an active VSG expression site. In recent years, considerable progress has been made in techniques allowing us to genetically modify infective bloodstream form trypanosomes. This is allowing us to reengineer VSG expression sites, and look at the effect on the mechanisms subsequently used for antigenic variation. We can now begin a dissection of a highly complicated survival strategy mediated by many different mechanisms operating simultaneously.

Untersuchungen zur Lokalisation und Expression des respiratorischen Proteins Neuroglobin bei Säugetieren

In der vorliegenden Arbeit wurde Neuroglobin (Ngb), ein evolutiv altes und in Metazoen konserviertes respiratorisches Protein, funktionell untersucht. Mittels des induzierbaren Tet on / Tet off Systems wurde Ngb ektopisch in der murinen Leber und im Gehirn überexprimiert. Die Transkriptome von Leber und Gehirnregionen Ngb-transgener Mäuse wurden mittels Microarrays und RNA-Seq im Vergleich zum Wildtyp analysiert, um Auswirkungen der Ngb-Überexpression zu ermitteln. Die Transkriptom-Analyse in Leber und Gehirn zeigte eine nur geringe Anzahl differenziell regulierter Gene und Stoffwechselwege nach Ngb-Überexpression. Ngb transgene Mäuse wurden CCl4-induziertem ROS-Stress ausgesetzt und die Leberfunktion untersucht. Zudem wurden primäre Hepatozyten-Kulturen etabliert und in diesen in vitro die extrinsische Apoptose induziert. Die Stressversuche zeigten: (i) Die Ngb-Überexpression hat keine protektive Wirkung in der Leber in vivo. (ii) In Leberzellen in vitro hingegen verminderte eine Ngb-Überexpression effizient die Aktivierung der apoptotischen Kaskade. Eine protektive Wirkung von Ngb ist vermutlich von betrachtetem Gewebe und dem verwendeten Stressor abhängig und keine generelle, selektierte Funktion des Proteins.rnWeiterhin wurde eine Ngb-KnockOut-Mauslinie mit einem LacZ-KnockIn-Genotyp etabliert. Hierbei zeigten die KO-Mäuse keinen offensichtlichen Phänotyp in ihrer Entwicklung, Fortpflanzung und Retina-Funktion. Unter Verwendung des LacZ-Knockin-Konstrukts konnten kontrovers diskutierte Ngb-Expressionsorte im adulten Mausgehirn (Hippocampus, Cortex und Cerebellum) sowie in Testes experimentell bestätigt werden. Parallel wurden öffentlich verfügbare RNA-Seq Datensätze ausgewertet, um die regionale Ngb-Expression systematisch ohne Antikörper-assoziierte Spezifitätsprobleme zu charakterisieren. Eine basale Ngb-Expression (RPKM: ~1-5) wurde im Hippocampus, Cortex und Cerebellum, sowie in Retina und Testes ermittelt. Eine 20-40fach höhere, starke Expression (RPKM: ~160) wurde im Hypothalamus bzw. im Hirnstamm nachgewiesen. Die „digitale“ Expressionsuntersuchung wurde mittels qRT-PCR und Western Blot bestätigt. Dieses Expressionsprofil von Ngb in der Maus weist auf eine besondere funktionelle Bedeutung von Ngb im Hypothalamus hin. Eine Funktion von Ngb in der Sauerstoffversorgung der Retina und eine generelle Funktion von Ngb in der Protektion von Neuronen sind mit dem beobachteten Expressionsspektrum weniger gut vereinbar.

Compartmentalised expression of meprin in small intestinal mucosa: enhanced expression in lamina propria in coeliac disease

Epithelial cells in the human small intestine express meprin, an astacin-like metalloprotease, which accumulates normally at the brush border membrane and in the gut lumen. Therefore, meprin is targeted towards luminal components. In coeliac disease patients, peptides from ingested cereals trigger mucosal inflammation in the small intestine, disrupting epithelial cell differentiation and function. Using in situ hybridisation on duodenal tissue sections, we observed a marked shift of meprin mRNA expression from epithelial cells, the predominant expression site in normal mucosa, to lamina propria leukocytes in coeliac disease. Meprin thereby gains access to the substrate repertoire present beneath the epithelium.

Étude des mécanismes moléculaires influençant la variation de phase des adhésines P, F1651 et CS31A présentes chez des souches d'Escherichia coli pathogènes.

F1651, les pili Pap et l’antigène CS31A associé aux antigènes de surface K88 sont tout trois des membres de la famille de type P des facteurs d’adhérence jouant un rôle prépondérant lors de l’établissement d’une maladie causée par des souches Escherichia coli pathogènes, en particulier des souches d’E. coli pathogènes extra-intestinales (ExPEC, Extra-intestinal pathogenic E. coli). Leur expression est sous le contrôle d’un mécanisme de régulation transcriptionnel dépendant de l’état de méthylation de l’ADN, résultant dans l’existence de deux populations définies, l’une exprimant l’adhésine (population ON) et l’autre ne l’exprimant pas (population OFF). Malgré de fortes identités de séquences, ces trois systèmes diffèrent l’un de l’autre, principalement par le pourcentage de cellules ON rencontrées. Ainsi, quand CS31A est systématiquement orienté vers un état considéré comme OFF, F1651 présente une phase ON particulièrement élevée et Pap montre deux états OFF et ON bien distincts, selon le phénotype de départ. La protéine régulatrice sensible à la leucine (Lrp, Leucine-responsive regulatory protein) joue un rôle essentiel dans la réversibilité de ce phénomène épigénétique et il est supposé que les différences de séquences au niveau de la région régulatrice modifient la localisation à ces sites de fixation de Lrp; ce qui résulte, en final, aux différences de phase existant entre CS31A, F1651 et Pap.À l’aide de divers techniques parmi lesquelles l’utilisation de gènes rapporteurs, mutagénèses dirigées et d’analyse des interactions ADN-protéines in vitro, nous montrons dans ce présent projet que la phase OFF prédominante chez CS31A est principalement due à une faible interaction de Lrp avec la région distale de l’opéron clp, et que la présence d’un homologue du régulateur local PapI joue un rôle également clef dans la production de CS31A. Dans le cas de F1651, nous montrons dans cette étude que le taux élevé de cellules en phase ON est dû à une altération dans le maintien de Lrp sur les sites répresseurs 1-3. Ceci est dû à la présence de deux nucléotides spécifiques, situé de part et d’autre du site répresseur 1, qui défavorisent la fixation de Lrp sur ce site précis. Tout comme dans le cas de CS31A, la formation d’un complexe, activateur ou répresseur de la phase ON, dépend également de l’action de du régulatuer local FooI, qui favorise alors le déplacement de Lrp des sites répresseurs 1-3 vers les sites activateurs 4-6.

Rôle de la tolérance centrale et périphérique des lymphocytes T autoréactifs dans deux nouveaux modèles murins double transgéniques

Les maladies autoimmunes sont des affections chroniques, le plus souvent invalidantes, qui touchent plus de 5% de la population dans les pays développés. L’autoimmunité résulte de la rupture des mécanismes de tolérance du système immunitaire vis-à-vis des autoantigènes exprimés par les tissus de l’organisme, entraînant la destruction d’un ou de plusieurs organes-cibles par les lymphocytes T et/ou B. L’hépatite autoimmune et le diabète autoimmun se caractérisent par la destruction sélective des hépatocytes et des cellules beta pancréatiques, respectivement. De plus en plus d’arguments suggèrent une implication des lymphocytes T CD8+ dans le déclenchement, la progression et la régulation des réponses associées à plusieurs maladies autoimmunes. Dans ce projet, nous avons suivi l’évolution de clones de lymphocytes T CD8+ spécifiques à un antigène particulier dont le site d’expression différait. Pour ce faire, nous avons développé deux nouveaux modèles murins double transgéniques par croisement entre une lignée de souris exprimant un TCR transgénique spécifique à la nucléoprotéine (NP) du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), et une souris exprimant cette NP-LCMV : 1) uniquement dans les hépatocytes (modèle d’hépatite autoimmune), ou 2) simultanément dans le thymus et le pancréas (modèle de diabète autoimmun). L’avidité fonctionnelle des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP chez les souris TCR transgéniques était inversement proportionnelle au niveau d’expression du TCR. Le répertoire lymphocytaire dans le thymus, la rate, les ganglions et le sang périphérique a été caractérisé pour chacune des lignées de souris double transgéniques, de même que la capacité fonctionnelle et le phénotype (marqueurs d’activation/mémoire) des lymphocytes T CD8+ autoréactifs. Chacun des deux nouveaux modèles présentés dans cette étude ont montré que les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP sont aptes à briser la tolérance centrale et périphérique et à provoquer une réaction d’autoimmunité spontanée. Dans le modèle d’hépatite autoimmune, où l’expression de l’autoantigène était restreinte au foie, la surexpression du TCR transgénique a entraîné une délétion thymique quasi-totale des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP prévenant le développement d’une hépatite spontanée. alors qu’un niveau de TCR comparable à celui d’une souris de type sauvage a permis une sélection positive des lymphocytes autoréactifs qui se sont accumulés dans le foie où ils se sont activés pour provoquer une hépatite autoimmune spontanée. Dans le modèle de diabète autoimmun, où l’autoantigène était exprimé dans le pancréas et le thymus, les souris des deux lignées double transgéniques ont montré une délétion thymique partielle, peu importe le niveau d’expression du TCR. Seuls les mâles adultes développaient un diabète spontané et une partie de leurs lymphocytes T CD8+ exprimaient une combinaison particulière de marqueurs d’activation/mémoire (CD44, CD122, PD-1). Cette population lymphocytaire était absente chez les souris femelles et les mâles sains. L’étude de la tolérance des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans nos deux nouveaux modèles murins double transgéniques a permis d’identifier des mécanismes alternatifs possiblement impliqués dans la tolérance et l’activation, et de mieux comprendre le rôle des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans le processus autoimmun menant à l’hépatite autoimmune et au diabète autoimmun. Ces découvertes seront utiles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les lymphocytes T CD8+ autoréactifs.

Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Ovastacins in vivo und in vitro

Die Metalloprotease Ovastacin, ein Vertreter der Astacin-Familie, wurde erstmals 2004 beschrieben. Im Ovar von Säugetieren ist Ovastacin-mRNA im Zeitfenster vom Stadium der Sekundärfollikel bis kurz nach der Befruchtung der Eizelle zu finden. Der Expressionsort und -zeitpunkt sowie die Sequenzähnlichkeit von über 60% mit sogenannten „Schlüpfenzymen“ (engl. hatching enzymes), die man in den Eizellen und Zygoten niederer Wirbeltiere und Wirbelloser gefunden hatte, ließen die Vermutung aufkommen, es könnte sich hier um das Säugerhomolog dieser Proteasen handeln. Generell lösen hatching Enzyme die derben embryonalen Hüllstrukturen (bei Säugern die Zona pellucida, ZP) beim Schlüpfvorgang auf. Die essentielle Bedeutung des Ovastacins für die Befruchtung wird durch die um ca. 30% reduzierte Fruchtbarkeit von Ovastacin defizienten Mäusen belegt. Hochinteressant war in diesem Zusammenhang die Entdeckung des Ovastacins in den Cortikalgranula der Oocyten sowie seine Fähigkeit, das Zona pellucida Protein 2 zu schneiden. Die dadurch bewirkte Verhärtung der Zona pellucida verhindert das Eindringen weiterer Spermien, das heißt sie baut eine Barriere gegen Polyspermie auf. Ziel dieser Arbeit war es, Belege für die physiologische Funktion des Ovastacins zu finden. Vor allem galt es, potentielle Aktivatoren zu identifizieren, da das Enzym wie alle Astacine als inaktive Vorstufe gebildet wird, die proteolytisch aktiviert werden muss. Zu diesem Zweck exprimierte ich rekombinantes Pro-Ovastacin in Insektenzellen. Aktivierungsstudien in vitro zeigten, dass ein saures Milieu zu einer Aktivierung führt, ohne die Abspaltung des Propeptids zu bewirken. Sequenzalignments und ein homologes Strukturmodell des Ovastacins wiesen auf Trypsin- oder Elastase-ähnliche Serinproteasen als potentielle Aktivierungsenzyme hin. Tatsächlich konnte mit diesen beiden Proteasetypen zum ersten Mal aktives Ovastacin aus Pro-Ovastacin erzeugt werden. Trypsin kommt als physiologischer Aktivator allerdings nicht in Betracht, da es bisher in keinem der Gewebe nachgewiesen werden konnte, in dem Ovastacin exprimiert wird. Die neutrophile Elastase dagegen konnte in der Leber, im Herz sowie im Blutplasma nachgewiesen werden. Mit Hilfe spezifischer Antikörper konnte das Herz als Expressionsort für Ovastacin bestätigt werden. Somit wäre Elastase ein potentieller physiologischer Aktivator von Ovastacin. Die Identifikation des Ovastacins in Geweben wie Leber, Herz, Nabelschnur und im Blutplasma weist auf eine Rolle der Protease in proteolytischen Netzwerken außerhalb der Spermien-Ei-Interaktion hin. Die Bedeutung der biologischen Kontrolle des Ovastacins bei der Befruchtung der Säugereizelle wird durch die Beobachtung untermauert, dass das Leberprotein Fetuin B als physiologischer Ovastacininhibitor fungiert und dadurch eine vorzeitige Verhärtung der Zona pellucida verhindert, die andernfalls die Penetration von Spermien prinzipiell verhindern würde.

Detailed analysis of sequence changes occurring during vlsE antigenic variation in the mouse model of Borrelia burgdorferi infection.

Lyme disease Borrelia can infect humans and animals for months to years, despite the presence of an active host immune response. The vls antigenic variation system, which expresses the surface-exposed lipoprotein VlsE, plays a major role in B. burgdorferi immune evasion. Gene conversion between vls silent cassettes and the vlsE expression site occurs at high frequency during mammalian infection, resulting in sequence variation in the VlsE product. In this study, we examined vlsE sequence variation in B. burgdorferi B31 during mouse infection by analyzing 1,399 clones isolated from bladder, heart, joint, ear, and skin tissues of mice infected for 4 to 365 days. The median number of codon changes increased progressively in C3H/HeN mice from 4 to 28 days post infection, and no clones retained the parental vlsE sequence at 28 days. In contrast, the decrease in the number of clones with the parental vlsE sequence and the increase in the number of sequence changes occurred more gradually in severe combined immunodeficiency (SCID) mice. Clones containing a stop codon were isolated, indicating that continuous expression of full-length VlsE is not required for survival in vivo; also, these clones continued to undergo vlsE recombination. Analysis of clones with apparent single recombination events indicated that recombinations into vlsE are nonselective with regard to the silent cassette utilized, as well as the length and location of the recombination event. Sequence changes as small as one base pair were common. Fifteen percent of recovered vlsE variants contained "template-independent" sequence changes, which clustered in the variable regions of vlsE. We hypothesize that the increased frequency and complexity of vlsE sequence changes observed in clones recovered from immunocompetent mice (as compared with SCID mice) is due to rapid clearance of relatively invariant clones by variable region-specific anti-VlsE antibody responses.

Detailed analysis of sequence changes occurring during vlsE antigenic variation in the mouse model of Borrelia burgdorferi infection.

Lyme disease Borrelia can infect humans and animals for months to years, despite the presence of an active host immune response. The vls antigenic variation system, which expresses the surface-exposed lipoprotein VlsE, plays a major role in B. burgdorferi immune evasion. Gene conversion between vls silent cassettes and the vlsE expression site occurs at high frequency during mammalian infection, resulting in sequence variation in the VlsE product. In this study, we examined vlsE sequence variation in B. burgdorferi B31 during mouse infection by analyzing 1,399 clones isolated from bladder, heart, joint, ear, and skin tissues of mice infected for 4 to 365 days. The median number of codon changes increased progressively in C3H/HeN mice from 4 to 28 days post infection, and no clones retained the parental vlsE sequence at 28 days. In contrast, the decrease in the number of clones with the parental vlsE sequence and the increase in the number of sequence changes occurred more gradually in severe combined immunodeficiency (SCID) mice. Clones containing a stop codon were isolated, indicating that continuous expression of full-length VlsE is not required for survival in vivo; also, these clones continued to undergo vlsE recombination. Analysis of clones with apparent single recombination events indicated that recombinations into vlsE are nonselective with regard to the silent cassette utilized, as well as the length and location of the recombination event. Sequence changes as small as one base pair were common. Fifteen percent of recovered vlsE variants contained "template-independent" sequence changes, which clustered in the variable regions of vlsE. We hypothesize that the increased frequency and complexity of vlsE sequence changes observed in clones recovered from immunocompetent mice (as compared with SCID mice) is due to rapid clearance of relatively invariant clones by variable region-specific anti-VlsE antibody responses.

Transcriptional regulation of the Borrelia burgdorferi antigenically variable VlsE surface protein.

The Lyme disease agent Borrelia burgdorferi can persistently infect humans and other animals despite host active immune responses. This is facilitated, in part, by the vls locus, a complex system consisting of the vlsE expression site and an adjacent set of 11 to 15 silent vls cassettes. Segments of nonexpressed cassettes recombine with the vlsE region during infection of mammalian hosts, resulting in combinatorial antigenic variation of the VlsE outer surface protein. We now demonstrate that synthesis of VlsE is regulated during the natural mammal-tick infectious cycle, being activated in mammals but repressed during tick colonization. Examination of cultured B. burgdorferi cells indicated that the spirochete controls vlsE transcription levels in response to environmental cues. Analysis of PvlsE::gfp fusions in B. burgdorferi indicated that VlsE production is controlled at the level of transcriptional initiation, and regions of 5' DNA involved in the regulation were identified. Electrophoretic mobility shift assays detected qualitative and quantitative changes in patterns of protein-DNA complexes formed between the vlsE promoter and cytoplasmic proteins, suggesting the involvement of DNA-binding proteins in the regulation of vlsE, with at least one protein acting as a transcriptional activator.

Efficient use of a small genome to generate antigenic diversity in tick-borne ehrlichial pathogens

Ehrlichiae are responsible for important tick-transmitted diseases, including anaplasmosis, the most prevalent tick-borne infection of livestock worldwide, and the emerging human diseases monocytic and granulocytic ehrlichiosis. Antigenic variation of major surface proteins is a key feature of these pathogens that allows persistence in the mammalian host, a requisite for subsequent tick transmission. In Anaplasma marginale pseudogenes for two antigenically variable gene families, msp2 and msp3, appear in concert. These pseudogenes can be recombined into the functional expression site to generate new antigenic variants. Coordinated control of the recombination of these genes would allow these two gene families to act synergistically to evade the host immune response.

Complex regulation of human inducible nitric oxide synthase gene transcription by Stat 1 and NF-κB

The human inducible nitric oxide synthase (hiNOS) gene is expressed in several disease states and is also important in the normal immune response. Previously, we described a cytokine-responsive enhancer between −5.2 and −6.1 kb in the 5′-flanking hiNOS promoter DNA, which contains multiple nuclear factor κβ (NF-κB) elements. Here, we describe the role of the IFN-Jak kinase-Stat (signal transducer and activator of transcription) 1 pathway for regulation of hiNOS gene transcription. In A549 human lung epithelial cells, a combination of cytokines tumor necrosis factor-α, interleukin-1β, and IFN-γ (TNF-α, IL-1β, and IFN-γ) function synergistically for induction of hiNOS transcription. Pharmacological inhibitors of Jak2 kinase inhibit cytokine-induced Stat 1 DNA-binding and hiNOS gene expression. Expression of a dominant-negative mutant Stat 1 inhibits cytokine-induced hiNOS reporter expression. Site-directed mutagenesis of a cis-acting DNA element at −5.8 kb in the hiNOS promoter identifies a bifunctional NF-κB/Stat 1 motif. In contrast, gel shift assays indicate that only Stat 1 binds to the DNA element at −5.2 kb in the hiNOS promoter. Interestingly, Stat 1 is repressive to basal and stimulated iNOS mRNA expression in 2fTGH human fibroblasts, which are refractory to iNOS induction. Overexpression of NF-κB activates hiNOS promoter–reporter expression in Stat 1 mutant fibroblasts, but not in the wild type, suggesting that Stat 1 inhibits NF-κB function in these cells. These results indicate that both Stat 1 and NF-κB are important in the regulation of hiNOS transcription by cytokines in a complex and cell type-specific manner.

Targeting dsRNA-specific single-chain Fv antibody fragments to different cellular locations in Nicotiana tabacum L.

Expression of antibodies or antibody fragments in plants is a useful tool for producing active antibody derivatives for diagnostic or pharmaceutical purposes as well as for immunomodulation. We investigated the effect of cellular expression site on the stability and yield of double-stranded RNA (dsRNA)-specific single-chain Fv-fragments (scFv) in transgenic tobacco. Two antibodies (J2 and P6) belonging to the V23(J558) heavy chain variable gene family but differing in the light chain variable domain were used. scFvs were targeted to the cytoplasm – with or without anchoring them in the plasma membrane –, into the endoplasmic reticulum (ER) and to the apoplast. Although high mRNA concentrations were detected in all cases, scFv proteins accumulated only when scFvs were made ER-resident by appropriate signal sequences. When the ER retention signal was removed to allow scFv-secretion to the apoplast, no scFv-proteins were detected. Despite the strong homology of the VH-sequences of J2 and P6 antibodies, only P6 provided a stable scFv scaffold for intracytoplasmic expression. J2-scFv could not be stabilised neither by adding a C-terminal stabilisation signal nor by anchoring the protein at the cytoplasmic side of the plasma membrane (PM). It was found that dsRNA-specific J2-scFvs are active in vivo and enhance Potato Virus Y induced symptoms in infected tobacco. This is the first report describing the expression and biological effect of RNA-specific antibodies in plants.

Improved Production of Genetically Modified Fetuses with Homogeneous Transgene Expression After Transgene Integration Site Analysis and Recloning in Cattle

Animal cloning by nuclear transfer (NT) has made the production of transgenic animals using genetically modified donor cells possible and ensures the presence of the gene construct in the offspring. The identification of transgene insertion sites in donor cells before cloning may avoid the production of animals that carry undesirable characteristics due to positional effects. This article compares blastocyst development and competence to establish pregnancies of bovine cloned embryos reconstructed with lentivirus-mediated transgenic fibroblasts containing either random integration of a transgene (random integration group) or nuclear transfer derived transgenic fibroblasts with known transgene insertion sites submitted to recloning (recloned group). In the random integration group, eGFP-expressing bovine fetal fibroblasts were selected by fluorescence activated cell sorting (FACS) and used as nuclei donor cells for NT. In the recloned group, a fibroblast cell line derived from a transgenic cloned fetus was characterized regarding transgene insertion and submitted to recloning. The recloned group had higher blastocyst production (25.38 vs. 14.42%) and higher percentage of 30-day pregnancies (14.29 vs. 2.56%) when compared to the random integration group. Relative eGFP expression analysis in fibroblasts derived from each cloned embryo revealed more homogeneous expression in the recloned group. In conclusion, the use of cell lines recovered from transgenic fetuses after identification of the transgene integration site allowed for the production of cells and fetuses with stable transgene expression, and recloning may improve transgenic animal yields.