Resisting infection by Plasmodium berghei increases the sensitivity of the malaria vector Anopheles gambiae to DDT

BACKGROUND The evolution of insecticide resistance threatens current malaria control methods, which rely heavily on chemical insecticides. The magnitude of the threat will be determined by the phenotypic expression of resistance in those mosquitoes that can transmit malaria. These differ from the majority of the mosquito population in two main ways; they carry sporozoites (the infectious stage of the Plasmodium parasite) and they are relatively old, as they need to survive the development period of the malaria parasite. This study examines the effects of infection by Plasmodium berghei and of mosquito age on the sensitivity to DDT in a DDT-resistant strain of Anopheles gambiae. METHODS DDT-resistant Anopheles gambiae (ZANU) mosquitoes received a blood meal from either a mouse infected with Plasmodium berghei or an uninfected mouse. 10 and 19 days post blood meal the mosquitoes were exposed to 2%, 1% or 0% DDT using WHO test kits. 24 hrs after exposure, mortality and Plasmodium infection status of the mosquitoes were recorded. RESULTS Sensitivity to DDT increased with the mosquitoes' age and was higher in mosquitoes that had fed on Plasmodium-infected mice than in those that had not been exposed to the parasite. The latter effect was mainly due to the high sensitivity of mosquitoes that had fed on an infected mouse but were not themselves infected, while the sensitivity to DDT was only slightly higher in mosquitoes infected by Plasmodium than in those that had fed on an uninfected mouse. CONCLUSIONS The observed pattern indicates a cost of parasite-resistance. It suggests that, in addition to the detrimental effect of insecticide-resistance on control, the continued use of insecticides in a population of insecticide-resistant mosquitoes could select mosquitoes to be more susceptible to Plasmodium infection, thus further decreasing the efficacy of the control.

Genomic structure and ecdysone regulation of the prophenoloxidase 1 gene in the malaria vector Anopheles gambiae

Prophenoloxidase, a melanin-synthesizing enzyme, is considered to be an important arthropod immune protein. In mosquitoes, prophenoloxidase has been shown to be involved in refractory mechanisms against malaria parasites. In our study we used Anopheles gambiae, the most important human malaria vector, to characterize the first arthropod prophenoloxidase gene at the genomic level. The complete nucleotide sequence, including the immediate 5′ flanking sequence (−855 bp) of the prophenoloxidase 1 gene, was determined. The gene spans 10 kb and is composed of five exons and four introns coding for a 2.5-kb mRNA. In the 5′ flanking sequence, we found several putative regulatory motifs, two of which were identified as ecdysteroid regulatory elements. Electrophoretic mobility gel-shift assays and supershift assays demonstrated that the Aedes aegypti ecdysone receptor/Ultraspiracle nuclear receptor complex, and, seemingly, the endogenous Anopheles gambiae nuclear receptor complex, was able to bind one of the ecdysteroid response elements. Furthermore, 20-hydroxyecdysone stimulation was shown to up-regulate the transcription of the prophenoloxidase 1 gene in an A. gambiae cell line.

The role of detoxification in the mosquito Anopheles gambiae response to Plasmodium infection

Rute C. Félix PALAVRAS-CHAVE: Malária, mosquito vector, Anopheles gambiae, parasita, Plasmodium berghei, infecção, enzimas de detoxificação, citocromos P450, tubulinas A malária, uma das doenças mais devastadoras que ocorrem em África é causada por um parasita do género Plasmodium e é transmitida aos humanos por mosquitos vectores do género Anopheles durante a refeição de sangue. Apesar da resposta do mosquito à infecção por Plasmodium ter vindo a ser intensamente estudada nos últimos anos, as interacções entre o mosquito vector e o parasita são muito complexas e, estão longe de serem completamente compreendidas. Este estudo tem como objectivo principal contribuir para o conhecimento da resposta do mosquito à infecção por Plasmodium, focando-se no papel das enzimas de detoxificação. Para atingir este objectivo realizouse uma análise transcriptómica com microarrays, com o intuito de identificar alterações de transcrição de enzimas de detoxificação no mosquito Anopheles gambiae em resposta à infecção por Plasmodium. Esta análise permitiu identificar alterações na expressão de 254 genes de destoxificação no estômago e corpo gordo de A. gambiae durante a invasão do intestino médio pelos oocinetos e durante a libertação dos esporozoítos do oocisto. Os resultados mostraram que a invasão do intestino médio pelos oocinetos causou alterações num maior número de genes em ambos os tecidos estudados, sendo o intestino médio do mosquito o tecido mais afectado nas duas fases da infecção do parasita. De todos os genes de destoxificação com expressão alterada, as tubulinas e os citocromos P450 destacaram-se e foram escolhidos para continuar o estudo. As tubulinas foram seleccionadas porque estão associadas à invasão do epitélio do intestino médio e a sua função na resposta à invasão do Plasmodium ainda não está bem definida. Os citocromos P450 foram seleccionados porque já foram descritos como tendo a expressão alterada em resposta ao Plasmodium e a outras infecções. Para identificar e caracterizar o papel das tubulinas durante a infecção pelo parasita e a sua possível associação com os citocromos P450 foi utilizado o silenciamento génico por RNA de interferência e a injecção de inibidores químicos de tubulinas. O silenciamento e co-silenciamento das tubulinas causaram um aumento da taxa e intensidade da infecção. No entanto, apesar de o aumento ser consistente não foi significativo. Por outro lado, a injecção de paclitaxel, um inibidor de tubulinas, aumentou significativamente a taxa e intensidade da infecção, fortalecendo a hipótese do envolvimento das tubulinas na resposta à infecção por Plasmodium. Este trabalho também mostrou que o co-silenciamento da tubulina A e tubulina B e a injecção do inibidor de tubulinas colchicine causam alterações significativas na expressão da CYP6Z2, sendo este proposto como um possível elo de ligação entre as tubulinas e os citocromos P450. Finalmente, uma análise comparativa foi realizada para estudar as regiões promotoras dos citocromos P450: CYP6M2 e o CYP6Z1. Este estudo obteve novos dados sobre compostos que activam estes citocromos e quais os possíveis factores de transcrição envolvidos. Dos diferentes estímulos utilizados, a exposição a insecticidas e a bactérias foram os que mais afectaram estes citocromos. O conjunto total das diferentes abordagens utilizadas neste trabalho contribuiu para aumentar o conhecimento do papel das enzimas de destoxificação durante a passagem do parasita da malária pelo mosquito vector.

Identification and characterization of differentially expressed cDNAs of the vector mosquito, Anopheles gambiae

The isolation and study of Anopheles gambiae genes that are differentially expressed in development, notably in tissues associated with the maturation and transmission of the malaria parasite, is important for the elucidation of basic molecular mechanisms underlying vector–parasite interactions. We have used the differential display technique to screen for mRNAs specifically expressed in adult males, females, and midgut tissues of blood-fed and unfed females. We also screened for mRNAs specifically induced upon bacterial infection of larval stage mosquitoes. We have characterized 19 distinct cDNAs, most of which show developmentally regulated expression specificity during the mosquito life cycle. The most interesting are six new sequences that are midgut-specific in the adult, three of which are also modulated by blood-feeding. The gut-specific sequences encode a maltase, a V-ATPase subunit, a GTP binding protein, two different lectins, and a nontrypsin serine protease. The latter sequence is also induced in larvae subjected to bacterial challenge. With the exception of a mitochondrial DNA fragment, the other 18 sequences constitute expressed genomic sequence tags, 4 of which have been mapped cytogenetically.

Transglutaminases do mosquito Anopheles gambiae: Caracterização genética, bioquímica e funcional durante a infecção por Plasmodium berghei

A malária constitui um problema de saúde pública, que tem vindo a agravar-se, sendo crescente a necessidade de estratégias renovadas para o seu controlo, como a interrupção do ciclo esporogónico. Deste modo, é essencial compreender as respostas imunológicas de Anopheles anti-Plasmodium. Demonstrou-se anteriormente, que a inibição de transglutaminases, enzimas que participam em vários processos biológicos ao catalisarem a formação de ligações covalentes entre péptidos, agrava a infecção em mosquitos pelo parasita. O presente trabalho tem por objectivo caracterizar as transglutaminases AGAP009098 e AGAP009100 de Anopheles gambiae. Os métodos utilizados para este efeito foram: a sequenciação de regiões dos genes AGAP009098 e AGAP009100; a clonagem molecular de fragmentos da região codificante do gene AGAP009098, usando o vector plasmídico pET–28a(+) e Escherichia coli como sistema de expressão; e PCR em Tempo Real para analisar a expressão relativa dos genes AGAP009098 e AGAP009100 nos diferentes os estádios de desenvolvimento. AGAP009098 é expressa ubiquamente e AGAP009100 a partir do estádio pupa. Estes resultados apontam para a conclusão de que AGAP009098 e AGAP009100 poderão desempenhar funções em processos biológicos relevantes, por exemplo na defesa imunitária, ou no desenvolvimento. Os péptidos recombinantes, obtidos a partir da clonagem com sucesso de fragmentos da região codificante do gene AGAP009098, constituem uma ferramenta importante para averiguar a função destas TGases, no futuro.

Transglutaminases de Anopheles gambiae: caracterização molecular, bioquímica e histológica.

A malária é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium spp, a sua transmissão aos humanos deve-se à picada infecciosa de mosquitos fêmea do género Anopheles spp, sendo Anopheles gambiae o vector mais eficiente de malária em todo o mundo. O intestino médio do mosquito representa um dos ambientes mais desafiantes à sobrevivência e desenvolvimento do parasita, e é, portanto, também um dos locais mais atraentes para novas estratégias de controlo da malária, pois é onde se observa uma diminuição acentuada na população de parasitas invasores. A transglutaminase (TGM) desempenha um papel importante e diversificado em mamíferos, tais como a coagulação e a formação da barreira epitelial, catalisando o “crosslinking” entre proteínas. Em invertebrados, como Drosophila sp, a proteína TGM mostrou estar envolvida na defesa imunitária. O mosquito A. gambiae tem codificado no seu genoma três TGMs, o gene AGAP009099, já caracterizado, é expresso exclusivamente nas MAGs (glândulas auxiliares masculinas). Os genes AGAP009098 e AGAP009100, cujas funções não foram ainda clarificadas, são expressos ubiquamente e em baixos níveis. No presente trabalho, propõe-se a caracterização das duas proteínas codificadas por estes genes, de forma a identificar o modo como estas proteínas interagem dentro do mosquito, a esclarecer o seu papel na invasão do intestino médio de A. gambiae por Plasmodium spp., o que permitirá averiguar o seu envolvimento ao nível da imunidade inata do mosquito. Foi produzida e purificada a proteína recombinante AgTGM98-1, que se utilizou para a produção de um anticorpo anti-AgTGM98. A atividade de TGM no mosquito não se mostrou estatisticamente significativa entre os estadios larvares, pupas e adultos. A caracterização bioquímica de AgTGM98 e AgTGM100 revelou a possível existência de proteínas do tipo TGM. Através de western blotting, verificou-se uma diminuição de AgTGM98, comparando mosquitos não infetados com infetados por P. berghei, o que sugere alterações na expressão desta proteína face à invasão pelo parasita, o que pode significar o seu envolvimento direto na infeção. Caracterizou-se, por imunohistoquímica (IHC) a localização de AgTGM98 e AgTGM100 em intestinos médios de mosquitos. A proteína AgTGM98 apresentou uma localização membranar, na parte basal do intestino médio e com distribuição ao longo deste. Contrariamente, a AgTGM100 tem uma localização intracelular e uma distribuição presente apenas no proventrículo e zona mais apical do intestino médio durante uma fase da sua existência, sendo com o passar do tempo detectada em todo o intestino médio.

Resistência a insecticidas em Anopheles gambiae s.l. na Região de Luanda, Angola

Em Angola, a malária é a principal causa de morbilidade e de mortalidade infantil. O controlo de vectores com recurso aos insecticidas representa uma parte importante da estratégia actual para a prevenção da doença. Em Anopheles gambiae s.s., principal vector de malária em África, estão identificadas duas mutações pontuais no gene que codifica os canais de sódio das membranas das células do sistema nervoso, conferindo resistência knockdown (kdr) aos insecticidas piretróides e ao DDT. Também se encontra descrita para esta espécie uma mutação no gene acetilcolinesterase-1 (ace-1), associada à resistência a carbamatos e organofosfatos. Este trabalho teve como principal objectivo avaliar o nível de resistência aos insecticidas em An. gambiae da província de Luanda, Angola e determinar a frequência destas mutações. Foram realizadas colheitas entomológicas em 2009 e 2010, através da prospeção de criadouros larvares. Os insectos capturados foram criados até a emergência do adulto e sujeitos a ensaios de susceptibilidade a insecticidas, através de testes da OMS. A identificação de espécies e formas moleculares do complexo An. gambiae, bem como a pesquisa de mutações no gene ace-1 foram feitas por PCR-RFLP. A pesquisa de mutações no gene kdr foi realizada por PIRA-PCR. Amostras selecionadas de mosquitos (incluindo uma amostra proveniente de uma colheita de adultos) foram ainda genotipadas para 11 loci microssatélites. Os níveis de resistência para a permetrina, DDT e -cialotrina foram elevados, com taxas de mortalidade inferiores a 70% em ambos os anos. Em contraste, as taxas de mortalidade foram sempre acima de 98% para bendiocarb e fenitrotião, indicadoras de susceptibilidade a estes insecticidas. Todas as amostras processadas foram identificadas como An. gambiae s.s., forma molecular M e não se observou a mutação no gene ace-1 associada à resistência. Em ambos os anos, foi detectada apenas a mutação L1014F no locus kdr e a frequência do alelo mutante (TTT) foi bastante elevada. Em 2009, observou-se uma associação entre genótipos homozigóticos para o alelo 1014F e o fenótipo resistente, para os insecticidas piretróides e para o DDT. O polimorfismo dos loci microssatélites analisados foi elevado, com a riqueza alélica a variar entre 5 (45C1) e 20 (H128) e a heterozigotia esperada entre 0,529 (H577) e 0,862 (H249). A análise genética não revelou um grau de parentesco entre os indivíduos que constituíram as amostras estudadas. Este resultado sugere que os elevados níveis de resistência observados não foram influenciados pelo método de colheita de mosquitos que, em certas condições, poderia contribuir para a amostragem de indivíduos aparentados.

Papel da Coagulação na Resposta do Mosquito Anopheles Gambiae ao Parasita da malária Plasmodium Berghei

Malária é uma doença parasitária infecciosa aguda ou crónica, causada pelo protozoário do género Plasmodium que é transmitido ao homem através de picada de mosquitos fêmeas do género Anopheles. Causa a morte a milhões de pessoas por ano, na sua maioria crianças até aos 5 anos de idade. A inexistência de estratégias eficazes, contra a transmissão da malária, deve-se sobretudo à falta de conhecimento de moléculas cruciais ao desenvolvimento do parasita no vector. Mecanismos de reconhecimento do parasita e a resposta imune do mosquito à infecção são claramente alvos de novas estratégias de controlo da malária. O ciclo natural de transmissão de Plasmodium requer a conclusão com sucesso, do ciclo esporogónico no intestino médio e nas glândulas salivares do mosquito Anopheles, um processo que demora cerca de duas semanas. Este processo de desenvolvimento pode ser bloqueado pelo sistema imune inato do mosquito, resultando assim na eliminação do parasita do vector. A resposta imunológica envolve vários mecanismos como a fagocitose, encapsulação, nodulação, síntese de péptidos antimicrobianos e coagulação, que são acompanhadas pela activação proteolítica da pró-fenoloxidase presente na hemolinfa.O sistema imune é um factor determinante da capacidade vectorial do mosquito, pelo que vários estudos têm sido feitos para melhor compreender as respostas do mosquito Anopheles, principal vector da malária, ao parasita Plasmodium. Uma das principais respostas desencadeadas pelo sistema imune do mosquito é a coagulação. Estudos recentes demonstram que a coagulação da hemolinfa de Anopheles requer actividade da fenoloxidase e difere de Drosophila s.p na formação, estrutura e composição. O objectivo deste trabalho é estudar o papel da coagulação na resposta do mosquito Anopheles gambiae ao parasita da malária Plasmodium berghei, através do estudo da transglutaminase. Para tal foi feita a caracterização dos genes que codificam para a transglutaminases em A. gambiae, através da sequenciação destes genes e dos seus transcritos, verificando-se alguns polimorfismos quando comparada com a sequência do genoma disponível na base de dados. Para caracterizar do papel desta enzima durante a infecção com P. berghei, foi feita a inibição da actividade enzimática dos genes AGAP009097 e AGAP009098 que codificam para a transglutaminases. Foi feita a descrição da dinâmica de transcrição durante a infecção e o silenciamento destes mesmos genes usando dsRNA. Observou-se um aumento da taxa de infecção e do número médio de oocistos por intestino médio nos mosquitos em que as transglutaminases foram inibidas quimicamente bem como naqueles que possuíam os genes silenciados, quando comparados com os grupos controlo. Com este trabalho espera-se ter contribuído para uma melhor compreensão do funcionamento da capacidade imunológica dos mosquitos na resposta ao parasita da malária e a possibilidade de manipular o sistema imune dos mesmos de modo a eliminar o parasita e contribuir para a diminuição/irradicação da malária, uma das principais doença e causa de morte a nível mundial.

Molecular immune responses of the mosquito Anopheles gambiae to bacteria and malaria parasites

Immune responses of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae were monitored systematically by the induced expression of five RNA markers after infection challenge. One newly isolated marker encodes a homologue of the moth Gram-negative bacteria-binding protein (GNBP), and another corresponds to a serine protease-like molecule. Additional previously described markers that respond to immune challenge encode the antimicrobial peptide defensin, a putative galactose lectin, and a putative serine protease. Specificity of the immune responses was indicated by differing temporal patterns of induction of specific markers in bacteria-challenged larvae and adults, and by variations in the effectiveness of different microorganisms and their components for marker induction in an immune-responsive cell line. The markers exhibit spatially distinct patterns of expression in the adult female mosquito. Two of them are highly expressed in different regions of the midgut, one in the anterior and the other in the posterior midgut. Marker induction indicates a significant role of the midgut in insect innate immunity. Immune responses to the penetration of the midgut epithelium by a malaria parasite occur both within the midgut itself and elsewhere in the body, suggesting an immune-related signaling process.

Eight novel families of miniature inverted repeat transposable elements in the African malaria mosquito, Anopheles gambiae

Eight novel families of miniature inverted repeat transposable elements (MITEs) were discovered in the African malaria mosquito, Anopheles gambiae, by using new software designed to rapidly identify MITE-like sequences based on their structural characteristics. Divergent subfamilies have been found in two families. Past mobility was demonstrated by evidence of MITE insertions that resulted in the duplication of specific TA, TAA, or 8-bp targets. Some of these MITEs share the same target duplications and similar terminal sequences with MITEs and other DNA transposons in human and other organisms. MITEs in A. gambiae range from 40 to 1340 copies per genome, much less abundant than MITEs in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Statistical analyses suggest that most A. gambiae MITEs are in highly AT-rich regions, many of which are closely associated with each other. The analyses of these novel MITEs underscored interesting questions regarding their diversity, origin, evolution, and relationships to the host genomes. The discovery of diverse families of MITEs in A. gambiae has important practical implications in light of current efforts to control malaria by replacing vector mosquitoes with genetically modified refractory mosquitoes. Finally, the systematic approach to rapidly identify novel MITEs should have broad applications for the analysis of the ever-growing sequence databases of a wide range of organisms.

Pantropic retroviral vectors integrate and express in cells of the malaria mosquito, Anopheles gambiae.

The lack of efficient mechanisms for stable genetic transformation of medically important insects, such as anopheline mosquitoes, is the single most important impediment to progress in identifying novel control strategies. Currently available techniques for foreign gene expression in insect cells in culture lack the benefit of stable inheritance conferred by integration. To overcome this problem, a new class of pantropic retroviral vectors has been developed in which the amphotropic envelope is completely replaced by the G glycoprotein of vesicular stomatitis virus. The broadened host cell range of these particles allowed successful entry, integration, and expression of heterologous genes in cultured cells of Anopheles gambiae, the principle mosquito vector responsible for the transmission of over 100 million cases of malaria each year. Mosquito cells in culture infected with a pantropic vector expressing hygromycin phosphotransferase from the Drosophila hsp70 promoter were resistant to the antibiotic hygromycin B. Integrated provirus was detected in infected mosquito cell clones grown in selective media. Thus, pantropic retroviral vectors hold promise as a transformation system for mosquitoes in vivo.

Investigating the role of glutathione and glutathione biosynthetic genes in the adaptation of Anopheles gambiae to insecticides

Malaria remains a serious public health challenge in the tropical world, with 584,000 deaths globally in 2013, of which 90% occurred in Africa, and mostly in pregnant women and children under the age of five. Anopheles gambiae (An. gambiae) is the principal malaria vector in Africa, where vector control measures involve the use of insecticides in the forms of long-lasting insecticide-treated nets (LLINs) and indoor residual spraying (IRS). The development of insecticides resistance mitigates these approaches. Glutathione (GSH) is widely distributed among all living organisms, and is associated with detoxification pathways, especially the Glutathione S-transferases (GSTs). Its direct involvement and relevance in insecticide resistance in An. gambiae has not been determined. Thus, this work examines the contribution of GSH, its biosynthetic genes (GCLM, GCLC) and their possible transcriptional regulator Nrf2 in insecticide resistance in An. gambiae sampled from agricultural setting (areas of intensive agriculture) and residential setting (domestic area). Bioinformatics analysis, W.H.O. adult susceptibility bioassays and molecular techniques were employed to investigate. Total RNA was first isolated from the adults An. gambiae mosquitoes raised from agricultural and residential field-caught larvae which had been either challenged or unchallenged with insecticides. Semi-quantitative RT-PCR using gel image densitometry was used to determine the expression levels of GCLM, GCLC genes and Nrf2. Bioinformatics’ results established the presence of putative AGAP010259 (AhR) and AGAP005300 (Nf2e1) transcription factor binding sites in An. gambiae GCLC and GCLM promoters in silico. An. gambiae s.l. studied here were highly resistant to DDT and permethrin but less resistant to bendiocarb. Both knockdown resistance (kdr) mutation variants L1014S and L1014F that confers resistance to pyrethroid insecticides were identified in both An. coluzzii and An. arabiensis sampled from northern Nigeria. The L1014F was much associated with An. coluzzii. A significant positive correlation (P=0.04) between the frequency of the L1014F point mutation and resistance to DDT and permethrin was observed. However, a weak or non-significant correlation (P=0.772) between the frequency of the L1014S point mutation and resistance was also found. L1014S and L1014F mutations co-occurred in both agricultural and residential settings with high frequencies. However, the frequencies of the two mutations were greater in the agricultural settings than in the residential settings. The levels of total, reduced and oxidized GSH were significantly higher in mosquitoes from agricultural sites than those from residential sites. Increased oxidized GSH levels appears to correlate with higher DDT resistance. The expression levels of GCLM, GCLC and Nrf2 were also significantly up-regulated in adults An. gambiae raised from agricultural and residential field-caught larvae when challenged with insecticide. However, there was higher constitutive expression of GCLM, GCLC and Nrf2 in mosquitoes from agricultural setting. The increased expression levels of these genes and also GSH levels in this population suggest their roles in the response and adaptation of An. gambiae to insecticide challenges. There exists the feasibility of using GSH status in An. gambiae to monitor adaptation and resistance to insecticides.

Short report: historical analysis of a near disaster: Anopheles gambiae in Brazil

Attributed to human-mediated dispersal, a species of the Anopheles gambiae complex invaded northeastern Brazil in 1930. This event is considered unique among the intercontinental introductions of disease vectors and the most serious one: "Few threats to the future health of the Americas have equalled that inherent in the invasion of Brazil, in 1930, by Anopheles gambiae." Because it was only in the 1960s that An. gambiae was recognized as a species complex now including seven species, the precise species identity of the Brazilian invader remains a mystery. Here we used historical DNA analysis of museum specimens, collected at the time of invasion from Brazil, and aimed at the identification of the Brazilian invader. Our results identify the arid-adapted Anopheles arabiensis as being the actual invading species. Establishing the identity of the species, in addition to being of intrinsic historical interest, can inform future threats of this sort especially in a changing environment. Furthermore, these results highlight the potential danger of human-mediated range expansions of insect disease vectors and the importance of museum collections in retrieving historical information

Lineage divergence detected in the malaria vector Anopheles marajoara (Diptera: Culicidae) in Amazonian Brazil

Background: Cryptic species complexes are common among anophelines. Previous phylogenetic analysis based on the complete mtDNA COI gene sequences detected paraphyly in the Neotropical malaria vector Anopheles marajoara. The ""Folmer region"" detects a single taxon using a 3% divergence threshold. Methods: To test the paraphyletic hypothesis and examine the utility of the Folmer region, genealogical trees based on a concatenated (white + 3' COI sequences) dataset and pairwise differentiation of COI fragments were examined. The population structure and demographic history were based on partial COI sequences for 294 individuals from 14 localities in Amazonian Brazil. 109 individuals from 12 localities were sequenced for the nDNA white gene, and 57 individuals from 11 localities were sequenced for the ribosomal DNA (rDNA) internal transcribed spacer 2 (ITS2). Results: Distinct A. marajoara lineages were detected by combined genealogical analysis and were also supported among COI haplotypes using a median joining network and AMOVA, with time since divergence during the Pleistocene (< 100,000 ya). COI sequences at the 3' end were more variable, demonstrating significant pairwise differentiation (3.82%) compared to the more moderate 2.92% detected by the Folmer region. Lineage 1 was present in all localities, whereas lineage 2 was restricted mainly to the west. Mismatch distributions for both lineages were bimodal, likely due to multiple colonization events and spatial expansion (similar to 798 - 81,045 ya). There appears to be gene flow within, not between lineages, and a partial barrier was detected near Rio Jari in Amapa state, separating western and eastern populations. In contrast, both nDNA data sets (white gene sequences with or without the retention of the 4th intron, and ITS2 sequences and length) detected a single A. marajoara lineage. Conclusions: Strong support for combined data with significant differentiation detected in the COI and absent in the nDNA suggest that the divergence is recent, and detectable only by the faster evolving mtDNA. A within subgenus threshold of >2% may be more appropriate among sister taxa in cryptic anopheline complexes than the standard 3%. Differences in demographic history and climatic changes may have contributed to mtDNA lineage divergence in A. marajoara.

Stream-bank shade and larval distribution of the Philippine malaria vector Anopheles flavirostris

The principal malaria vector in the Philippines, Anopheles flavirostris (Ludlow) (Diptera: Culicidae), is regarded as 'shade-loving' for its breeding sites, i.e. larval habitats. This long-standing belief, based on circumstantial observations rather than ecological analysis, has guided larval control methods such as 'stream-clearing' or the removal of riparian vegetation, to reduce the local abundance of An. flavirostris . We measured the distribution and abundance of An. flavirostris larvae in relation to canopy vegetation cover along a stream in Quezon Province, the Philippines. Estimates of canopy openness and light measurements were obtained by an approximation method that used simplified assumptions about the sun, and by hemispherical photographs analysed using the program hemiphot(C) . The location of larvae, shade and other landscape features was incorporated into a geographical information system (GIS) analysis. Early larval instars of An. flavirostris were found to be clustered and more often present in shadier sites, whereas abundance was higher in sunnier sites. For later instars, distribution was more evenly dispersed and only weakly related to shade. The best predictor of late-instar larvae was the density of early instars. Distribution and abundance of larvae were related over time (24 days). This pattern indicates favoured areas for oviposition and adult emergence, and may be predictable. Canopy measurements by the approximation method correlated better with larval abundance than hemispherical photography, being economical and practical for field use. Whereas shade or shade-related factors apparently have effects on larval distribution of An. flavirostris , they do not explain it completely. Until more is known about the bionomics of this vector and the efficacy and environmental effects of stream-clearing, we recommend caution in the use of this larval control method.