Structure-fonction de MARCH1, une E3 ubiquitine ligase régulant la présentation antigénique par le CMH II

Les molécules classiques du CMH de classe II sont responsables de la présentation de peptides exogènes par les cellules présentatrices d’antigène aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation antigénique est essentielle à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la reconnaissance d’auto-antigènes ainsi que l’élimination des cellules du Soi sont des problèmes à l’origine de nombreuses maladies auto-immunes. Notamment, le diabète et la sclérose en plaque. D’éventuels traitements de ces maladies pourraient impliquer la manipulation de la présentation antigénique chez les cellules dont la reconnaissance et l’élimination engendrent ces maladies. Il est donc primordial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne les mécanismes de régulation de la présentation antigénique. La présentation antigénique est régulée tant au niveau transcriptionnel que post-traductionnel. Au niveau post-traductionnel, diverses cytokines affectent le processus. Parmi celles-ci, l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, cause une rétention intracellulaire des molécules du CMH II. Son mécanisme d’action consiste en l’ubiquitination de la queue cytoplasmique de la chaîne bêta des molécules de CMH II. Cette modification protéique est effectuée par MARCH1, une E3 ubiquitine ligase dont l’expression est restreinte aux organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à tout récemment, il y avait très peu de connaissance concernant la structure et les cibles de MARCH1. Considérant son impact majeur sur la présentation antigénique, nous nous sommes intéressé à la structure-fonction de cette molécule afin de mieux caractériser sa régulation ainsi que les diverses conditions nécessaires à son fonctionnement. Dans un premier article, nous avons étudié la régulation de l’expression de MARCH1 au niveau protéique. Nos résultats ont révélé l’autorégulation de la molécule par formation de dimères et son autoubiquitination. Nous avons également démontré l’importance des domaines transmembranaires de MARCH1 dans la formation de dimères et l’interaction avec le CMH II. Dans un second article, nous avons investigué l’importance de la localisation de MARCH1 pour sa fonction. Les résultats obtenus montrent la fonctionnalité des motifs de localisation de la portion C-terminale de MARCH1 ainsi que la présence d’autres éléments de localisation dans la portion N-terminale de la protéine. Les nombreux mutants utilisés pour ce projet nous ont permis d’identifier un motif ‘‘VQNC’’, situé dans la portion cytoplasmique C-terminale de MARCH1, dont la valine est requise au fonctionnement optimal de la molécule. En effet, la mutation de la valine engendre une diminution de la fonction de la molécule et des expériences de BRET ont démontré une modification de l’orientation spatiale des queues cytoplasmiques. De plus, une recherche d’homologie de séquence a révélé la présence de ce même motif dans d’autres ubiquitines ligases, dont Parkin. Parkin est fortement exprimée dans le cerveau et agirait, entre autre, sur la dégradation des agrégats protéiques. La dysfonction de Parkin cause l’accumulation de ces agrégats, nommés corps de Lewy, qui entraînent des déficiences au niveau du fonctionnement neural observé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. La valine comprise dans le motif ‘’VQNC’’ a d’ailleurs été identifiée comme étant mutée au sein d’une famille où cette maladie est génétiquement transmise. Nous croyons que l’importance de ce motif ne se restreint pas à MARCH1, mais serait généralisée à d’autres E3 ligases. Ce projet de recherche a permis de caractériser des mécanismes de régulation de MARCH1 ainsi que de découvrir divers éléments structuraux requis à sa fonction. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de contrôle de la présentation antigénique par les molécules de CMH II.

Phosphorylation et régulation de l’E3 ubiquitine ligase MDM2 par la protéine kinase RSK dans les mélanomes

La voie de signalisation Ras/MAPK (Ras/mitogen-activated protein kinase) régule une variété de protéines intracellulaires qui jouent un rôle important dans la croissance et la prolifération cellulaire. La régulation inappropriée de cette voie de signalisation conduit au développement de nombreux cancers comme le mélanome, qui est caractérisé par des mutations activatrices au niveau des gènes NRAS et BRAF. La protéine kinase RSK (p90 ribosomal S6 kinase) est un composant central de la voie Ras/MAPK, mais son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire n’est pas bien compris. RSK a été montrée pour participer à la résistance des mélanomes aux chimiothérapies, mais le mécanisme moléculaire reste encore à élucider. Nous montrons à l’aide d’un anticorps phospho-spécifique que MDM2 est phosphorylée en réponse à des agonistes et des mutations oncogéniques activant spécifiquement la voie Ras/MAPK. En utilisant des méthodes in vitro et in vivo, nous avons constaté que RSK phosphoryle directement MDM2 sur les Sérines 166 et 186, ce qui suggère que MDM2 est un substrat de RSK. La mutagénèse dirigée envers ces sites nous indique que ces résidus régulent l’ubiquitination de MDM2, suggérant que RSK régule la stabilité de MDM2 et de p53. De plus, nous avons observé que l’inhibition de RSK conduit à une augmentation du niveau protéique de p53 après un dommage à l’ADN dans les cellules de mélanomes. En conclusion, nos travaux suggèrent un rôle important de la protéine kinase RSK dans la régulation de MDM2 et de sa cible, p53. L’étude de ces mécanismes moléculaires aidera à mieux définir le rôle de RSK dans la croissance tumorale, mais également dans la résistance aux agents chimiothérapeutiques.

La modulation du métabolisme cellulaire par l'E3 Ubiquitine Ligase MARCH-1

La relocalisation et la dégradation médiée par ubiquitination sont utilisées par la cellule pour contrôler la localisation et l’expression de ses protéines. L’E3 ubiquitine ligase MARCH1 est impliqué dans la régulation post-traductionnelle de CMH-II et de CD86. Dans ce mémoire, on propose un rôle additionnel à MARCH1. Nos résultats expérimentaux nous portent à croire que MARCH1 pourrait moduler le métabolisme cellulaire en favorisant la relocalisation et la dégradation d’enzymes impliquées dans la glycolyse. La grande majorité des cellules utilise la phosphorylation oxydative pour générer de l’ATP en présence d’oxygène. Dans un environnement hypoxique, cette dernière est non fonctionnelle et la cellule doit utiliser la glycolyse anaérobique pour produire son ATP. Une cellule cancéreuse à des besoins énergétiques supérieurs en raison de l’augmentation de sa biomasse et de sa prolifération incontrôlée. Pour subvenir à ces besoins, elle maximise sa production d’énergie en modifiant son métabolisme; c’est l’effet Warburg. On retrouve dans les cellules immunitaires des modifications similaires au métabolisme cellulaire suite à un signal d’activation. Ici, nous montrons que la respiration mitochondriale maximale, la réserve respiratoire et la glycolyse maximale sont diminuées dans les cellules présentatrice d’antigènes qui expriment MARCH1. Nous avons montré que MARCH1 était localisable au niveau de la mitochondrie, ce qui lui permet d’interagir avec les enzymes de la glycolyse. Finalement, nous avons quantifié l’expression de Eno1 et de LDHB par Western Blot, pour montrer une augmentation de l’expression de ces enzymes en absence de MARCH1. À la lumière de ces résultats, nous discutons des avantages que procure la diminution de l’expression de MARCH1 dans un contexte inflammatoire, suite à l’activation des cellules présentatrices d’antigènes. Ce phénomène permettrait une présentation antigénique plus efficace, une augmentation de la production d’énergie et une meilleure résistance aux ROS produits lors de la réponse inflammatoire.

Neuronal expression of the ubiquitin ligase Nedd4-2 in rat dorsal root ganglia: modulation in the SNI model of neuropathic pain

La douleur neuropathique est une forme de douleur chronique apparaissant suite à des lésions du système nerveux somato-sensoriel. Caractérisée par une plasticité neuronale inadapté, elle est très souvent intense, invalidante, associe des symptômes comme l'allodynie ou l' hyperalgésie et reste difficile à traiter avec les agents thérapeutiques actuels. Le thème de mon travail de thèse se concentre sur des mécanismes moléculaires de modulation des canaux sodiques voltage-dépendants suite à une lésion du nerf périphérique. Dans l'article présenté en annexe, j'ai focalisé mon travail sur une protéine, Nedd4-2, qui est une ligase ubiquitine. Elle a pour rôle de réguler et d'internaliser dans la cellule des protéines membranaires dont les canaux sodiques. Suite aux lésions du système nerveux périphérique, il existe une hyperexcitabilité neuronale engendrée notamment par un surplus et une dysrégulation des canaux sodiques à la membrane cellulaire. Dans 1 'hypothèse que l'ubiquitine ligase Nedd4-2 soit présente dans les neurones sensitifs primaires et ait un rôle dans la régulation des canaux sodiques, nous avons identifié cette protéine dans les neurones nociceptifs primaires du rat. En utilisant des techniques de Western Blot et d'immunohistochimie, j'ai trouvé que Nedd4-2 est présente dans presque 50% des neurones du ganglion spinal et ces neurones sont principalement des neurones nociceptifs. Dans un modèle expérimental de douleur neuropathique (SN I, pour spared nerve injury), Nedd4-2 se retrouve significativement diminuée dans le tissu du ganglion spinal. J'ai également investigué 1' expression de 2 isoformes des canaux sodiques connues pour leur implication dans la douleur, Navl.7 et Navl.8, et ces 2 isoformes se retrouvent dans les mêmes neurones que Nedd4-2. La caractérisation détaillée est décrite dans le manuscrit: «Neuronal expression of the ubiquitin ligase Nedd4-2 in rat dorsal root ganglia: modulation in the SNI model of neuropathic pain; Cachemaille M, Laedermann CJ, Pertin M, Abriel H, Gasselin RD, Decosterd 1.» Les résultats obtenus indiquent que Nedd4-2, en étant downrégulé après une lésion nerveuse, pourrait ainsi contribuer à une augmentation des canaux sodiques fonctionnels à la membrane. Ainsi Nedd4-2 pourrait être proposée comme cible thérapeutique de manière alternative aux bloqueurs de canaux sodiques. Ce travail a permis l'initiation d'autres expériences. J'ai contribué activement à la construction de vecteurs viraux type adéno-associé recombinant (rAA V2/6) et surexprimé la protéine in vivo dans les ganglions spinaux. Cette partie de mon travail se trouve intégrée dans d'autres travaux de mon laboratoire d'accueil qui a pu démontrer les effets fonctionnels de cette approche sur les courants sodiques enregistrés par électrophysiologie et une diminution de la douleur neuropathique chez la souris. - Abstract-Neuronal hyperexcitability following peripheral nerve lesions may stem from altered activity of voltagegated sodium channels (VGSCs), which gives rise toallodynia or hyperalgesia. In vitro, the ubiquitin ligase Nedd4-2 is a negative regulator of VGSC a-subunits (Nav), in particular Nav1.7, a key actor in nociceptor excitability. We therefore studied Nedd4-2 in rat nociceptors, its co-expression with Nav1.7 and Nav1.8, and its regulation in pathology. Adult rats were submitted to the spared nerve injury (SNI) model of neuropathic pain or injected with complete Freund's adjuvant (CFA), a model of inflammatory pain. L4 dorsal root ganglia (DRG) were analyzed in shamoperated animals, seven days after SNI and 48 h after CFA with immunofluorescence and Western blot. We observed Nedd4-2 expression in almost 50% of DRG neurons, mostly small and medium-sized. A preponderant localization is found in the non-peptidergic sub-population. Additionally, 55.7± 2.7% and 55.0 ±3.6% of Nedd4-2-positive cells are co-labeled with Nav1.7 and Nav1.8 respectively. SNI significantly decreases the proportion of Nedd4-2-positive neurons from 45.9± 1.9% to 33.5± 0.7% (p < 0.01) and the total Nedd4-2 protein to 44%± 0.13% of its basal level (p <0.01, n = 4 animals in each group, mean± SEM). In contrast, no change in Nedd4-2 was found after peripheral inflammation induced by CFA. These results indicate that Nedd4-2 is present in nociceptive neurons, is downregulated after peripheral nerve injury, and might therefore contribute to the dysregulation of Navs involved in the hyperexcitability associated with peripheral nerve injuries.

ROQUIN/RC3H1 alterations are not found in angioimmunoblastic T-cell lymphoma.

Angioimmunoblastic T-cell Lymphoma (AITL) is one of the most frequent T-cell lymphoma entities. Follicular helper T lymphocytes (TFH) are recognized as the normal cellular counterpart of the neoplastic component. Despite a clonal T-cell feature and few described recurrent cytogenetic abnormalities, a driving oncogenic event has not been identified so far. It has been recently reported that in mice, heterozygous inactivation of Roquin/Rc3h1, a RING type E3 ubiquitine ligase, recapitulates many of the clinical, histological, and cellular features associated with human AITL. In this study we explored whether ROQUIN alterations could be an initial event in the human AITL oncogenic process. Using microarray and RT-PCR analyses, we investigated the levels of ROQUIN transcripts in TFH tumor cells purified from AITL (n = 8) and reactive tonsils (n = 12) and found similar levels of ROQUIN expression in both. Moreover, we also demonstrated that ROQUIN protein was expressed by AITL TFH (PD1+) cells. We then analysed ROQUIN coding sequence in 12 tumor cell-rich AITL samples and found no mutation in any of the samples. Finally, we analysed the expression of MiR101, a putative partner of ROQUIN involved in the modulation of ICOS expression and found similar levels of expression in tumor and reactive TFH. Altogether, this study shows that neither alteration of ROQUIN gene nor deregulation of miR101 expression is likely to be a frequent recurrent event in AITL.

Regulation of the NaCI cotransporter by the SGK1-Nedd4-2 pathway

SummaryRegulation of renal Na+ transport is essential for controlling blood pressure, as well as Na+ and K+ homeostasis. Aldosterone stimulates Na+ reabsorption in the aldosterone-sensitive distal nephron (ASDN), via the Na+-CI" cotransporter (NCC) in the distal convoluted tubule (DCT), and the epithelial Na+ channel (ENaC) in the late DCT, connecting tubule and collecting duct. Importantly, aldosterone increases NCC protein expression by an unknown post-translational mechanism. The ubiquitin-protein ligase Nedd4-2 is expressed along the ASDN and regulates ENaC: under aldosterone induction, the serum/glucocorticoid-regulated kinase SGK1 phosphorylates Nedd4-2 on S328, thus preventing the Nedd4-2/ENaC interaction, ubiquitylation and degradation of the channel. Here, we present evidence that Nedd4-2 regulates NCC. In transfected HEK293 cells, Nedd4-2 co-immunoprecipitates with NCC and stimulates NCC ubiquitylation at the cell surface. In Xenopus laevis oocytes, co- expression of NCC with wild-type Nedd4-2, but not its catalytically inactive mutant, strongly decreases NCC activity and surface expression. This inhibition is prevented by SGK1 in a kinase-dependent manner. Moreover, we show that NCC expression is up-regulated in inducible renal tubule-specific Nedd4-2 knockout mice and in mDCT15 cells silenced for Nedd4-2. On the other hand, in inducible renal tubule-specific SGK1 knockout mice, NCC expression is down-regulated.Interestingly, in contrast to ENaC, Nedd4-2-mediated NCC inhibition is independent of a PY motif in NCC. Moreover, whereas single mutations of Nedd4-2 S328 or S222 to alanine do not interfere with SGK1 action, the double mutation enhances Nedd4-2 activity and abolishes SGK1-dependent inhibition. These results indicate that NCC expression and activity is controlled by a regulatory pathway involving SGK1 and Nedd4-2, and provides an explanation for the well-known aldosterone-induced increase in NCC protein expression.RésuméLa régulation du transport de sodium est cruciale dans le maintien de la pression artérielle. L'aldostérone stimule la réabsorption de Na+ dans la partie du néphron sensible à l'aldostérone (ASDN), via le co-transporteur Na+-CI" (NCC) au niveau du tubule contourné distale et via le canal à sodium (Epithelial Na+ Channel ; ENaC) dans la deuxième partie du tubule contourné distale, dans le tube connecteur et le tube collecteur. L'aldostérone augmente l'expression de NCC au niveau protéique par un mécanisme non élucidé. La protéine ubiquitine ligase Nedd4-2 est exprimée tout le long du néphron sensible à l'aldostérone. ENaC est connu pour être régulé par Nedd4-2. Suite à une stimulation par l'aldostérone, la kinase Ser/Thr SGK1 phosphoryle Nedd4-2, ce qui empêche l'interaction entre Nedd4-2 et ENaC. Dans des cellules HEK293 transfectées, nous avons montré que Nedd4-2 interagit avec le co-transporteur NCC et stimule l'ubiquitylation de NCC à la surface. Nous avons montré dans les oocytes de Xenopus laevis que l'expression de NCC avec Nedd4-2 diminue l'activité du co-transporteur. Cette diminution n'est pas observée lorsqu'on exprime NCC avec le mutant inactif de Nedd4-2. Cette inhibition de NCC est contrée par SGK1. L'effet de SGK1 sur NCC dépend de son activité kinase. Nous avons montré dans des souris knock-out pour Nedd4-2, dans le néphron et de manière inductible, que l'expression de NCC est augmentée. Nous avons également montré que la suppression de la protéine Nedd4-2 dans les cellules mDCT15 provoque l'augmentation de NCC. Au contraire dans les souris knock-out pour la kinase SGK1, dans le néphron et de manière inductible, nous observons une diminution de la protéine NCC. Contrairement à ce qui a été montré pour le canal ENaC l'inhibition de NCC par Nedd4-2 est indépendante des motifs PY. De plus, La mutation des sérines 328 ou 222 sur Nedd4-2 en alanine n'interfère pas avec l'action de SGK1 pour prévenir l'inhibition. Par contre, la double mutation, les sérines 222 et 328 mutées en alanine, augmente l'action de Nedd4-2 sur l'activité de NCC et prévient l'effet de SGK1. Ces résultats montrent que l'expression et l'activité de NCC sont contrôlées par une voie de régulation impliquant Nedd4-2-SGK1 et nous fournissent une explication pour l'augmentation de NCC observé après une induction avec l'aldostérone.Résumé large publicOn estime que des millions de personnes seraient hypertendues. L'hypertension artérielle est responsable d'environ 8 millions de décès par ans dans le monde. L'hypertension est responsable de la moitié environs des accidents cardiaques, mais aussi des accidents vasculaires cérébraux. Il est très important de comprendre les mécanismes qui se trouvent derrière cette pathologie.Le co-transporteur NCC joue un grand rôle dans le maintien de la balance sodique. Il a été montré que des perturbations dans l'expression de NCC pouvaient engendrer de l'hypertension.Le co-transporteur NCC est exprimé dans la partie distale du néphron, l'unité fonctionnelle du rein. Plusieurs études ont montrées que NCC était sous le contrôle de l'hormone aldostérone.Le travail de cette thèse consiste à étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de NCC. On a ainsi pu montrer que NCC interagit avec la protéine ubiquitine ligase Nedd4-2. La protéine Nedd4-2 diminue l'expression de NCC à la surface cellulaire et aussi son activité Nous avons également montré que la kinase SGK1 pouvait prévenir l'interaction entre Nedd4-2 et NCC par phosphorylation de Nedd4-2. Nous avons montré dans des souris deletée pour Nedd4-2, dans le néphron, que l'expression de NCC est augmentée. Nous avons également montré que la suppression de la protéine Nedd4-2 dans les cellules mDCT15 provoque l'augmentation de NCC. Au contraire, dans les souris deletée pour la kinase SGK1, dans le néphron, nous observons une diminution de la protéine NCC. La connaissance des processus impliqués dans la régulation du co-transporteur NCC pourrait amener au développement de nouveau médicaments pour soigner l'hypertension.

Characterization of the expression, regulation and function of Sorting Nexin 9 and Sorting Nexin 18

Summary : Sorting nexin (SNX) family members play important roles in intracellular protein and membrane trafficking, The membrane-tubulating SNX9 protein has been shown to interact with multiple components of the endocytic machinery and to participate in clathrin-mediated endocytosis of cell surface receptors. It has not been investigated if SNX9 may also participate in other protein sorting pathways that involve vesicular transport, specifically the biogenesis of lysosome-related organelles (LROs). Closely related to SNX9 is SNXl8, whose function is largely unknown. In this work, we have characterized the expression of SNX9 and SNXl8 in LRO-containing cells and investigated their role in protein trafficking during the formation of LROs. Our results indicate that SNX9 and SNXl8 are not essential for the formation of LROs, nor for the sorting of melanosomal proteins. We investigated how the level of intracellular SNX9 protein is regulated and found that it is a substrate of the ubiquitin ligase Itch, a member of the NEDD4 family of E3 ubiquitin ligases. Itch ubiquitylates SNX9 and regulates SNX9 levels by enhancing its degradation. Using ? truncated proteins we found that the interaction with SNX9 is mediated by the proline-rich domain of Itch, a domain distinct from the conventional WW recognition domain, and the SH3 domain of SNX9. Interaction with the PRD of Itch is essential for SNX9 ubiquitylation and degradation. We further showed that Itch binding is not affected by tyrosine phosphorylation of SNX9. Using lentivector-mediated siRNA techniques, we found that Itch regulates the level of melanosomal proteins, while knock-down of SNX9 does not alter their level. Interestingly, we revealed that silencing of SNXIS affects the amount of the melanosomal protein Melan-A, but also of SNX9, and that SNXl8 can interact with SNX9. Taken together, our results highlight that the pool of substrates of NEDD4 family E3 ligases extends to proteins containing SH3 domains and provide insight into the potential functions of SNXI8. Résumé : Les membres de la famille des Sorting Nexins (SNX) jouent des rôles importants dans le trafic intracellulaire de protéines et membranes. Il a été démontré que la protéine SNX9, qui génère les tubules membranaires, interagit avec plusieurs composants de la machinerie d'endocytose et participe à l'endocytose des récepteurs de surface mediée par la clathrine. Aucune étude n'a investigué si SNX9 pourrait aussi participer à d'autres voies de trafic de protéines tel que le transport vésiculaire, et plus particulièrement la biogenèse des organites lysosomaux ("lysosome-related organelles", LR©s). SNXl8 est similaire à SNX9, mais sa fonction est largement inconnue. Dans ce travail, nous avons caractérisé l'expression de SNX9 et SNX18 dans des cellules contenants des LROs et investigué leur rôle dans le trafic de protéines pendant la formation des LROS. Nos résultats indiquent que SNX9 et SNXI8 ne sont essentiels ni pour la formation des LR©s, ni pour le trafic de protéines mélanosomales. Nous avons examiné la régulation du niveau intracellulaire de la protéine SNX9 et avons trouvé qu'elle est un substrat de l'ubiquitine ligase Itch, un membre de la famille NEDD4 des ubiquitine ligases E3. Itch ubiquitine SNX9 et régule les niveaux de SNX9 en augmentant sa dégradation. En utilisant des protéines mutées nous avons découvert que l'interaction avec SNX9 est médiée par le domaine riche en proline de Itch, qui est différent du domaine conventionnel de reconnaissance WW, et par le domaine SH3 de SNX9. L'interaction avec le domaine riche en proline de Itch est essentielle pour l'ubiquitination et la dégradation de SNX9. De plus, nous avons montré que cette liaison n'est pas affectée par la phosphorylation des résidus tyrosine de SNX9. En utilisant des vecteurs lentiviraux exprimant des siARN, nous avons trouvé que Itch régule les niveaux de protéines mélanosomales, alors que l'extinction de l'expression de SNX9 ne change pas leurs niveaux. En autre, nous avons révélé que la diminution de SNXl8 affecte le niveau de la protéine mélanosomale Melan-A et de SNX9, et aussi que SNXl8 peut interagir avec SNX9. En résumé, nos résultats démontrent que l'ensemble des substrats de la famille NEDD4 des ubiquitine ligases E3 s'élargit aux protéines contenant des domaines SH3 et ouvrent des perspectives sur les fonctions potentielles de SNXl8.

Role of β-TrCP1, variant and homologue in HIV-1 life cycle

Summary The CD4 molecule plays a key role in AIDS pathogenesis, it is required for entry of the virus into permissive cells and its subsequent down-modulation of the cell surface is a hallmark of HN-1 infected cells. The virus encodes no less than three proteins that participate in this process: Nef, Vpu and Env. Vpu protein interacts with CD4 within the endoplasmic reticulum of infected cells, where it targets CD4 for degradation through the interaction with a cellular protein named ß-TrCP1. This F-box protein functions as the substrate recognition subunit of the SCF ß-Trcr E3 ubiquitin ligase, which normally induce the ubiquitination and subsequent degradation of various proteins such as ß-catenin and IxBa. Mammals possess a homologue of ß-TrCP1, HOS, also named ß-TrCP2 which has a cytoplasmic subcellular distribution. Structural analysis of the ligand-binding domain of both homologues shows striking surface similarities. Both F-box proteins have a redundant role in a number of cellular processes; however the potential role of ß-TrCP2 in HIV-1 infected cells has not been evaluated. In the present study, we assessed the existence of génetic variants of BRTC, encoding ß-TrCP1, and evaluated whether these variants would affect CD4 down-modulation. Additionally, we determined whether ß-TrCP2 shares with its homologue structural and functional properties that would allow it to bind Vpu, modulate CD4 expression, and thus participate in HN-1 pathogenesis. We identified a single nucleotide polymorphism present in the human population with an allelic frequency of 0.03 that leads to the substitution of alanine 507 by a serine. However, we showed by transient transfection in HeLa CD4+ cells that this variant behaves as ß-TrCP1 with respect to CD4 down-modulation. We established transient expression systems in HeLa CD4+ cells to test whether ß-TrCP2 is implicated in Vpu-mediated CD4 down-modulation. We show by coimmunoprecipitation experiments that ß-TrCP2 binds Vpu and is able to induce CD4 down-modulation as efficiently as ß-TrCP1. In two different cell lines, HeLa CD4+ and Jurkat, Vpu-mediated CD4 down-modulation could not be completely reversed through the silencing of endogenous ß-TrCP 1 or ß-TrCP2 individually, but required both genes to be silenced simultaneously. We evaluated the role of ß-TrCP1 and ß-TrCP2 in HIV-1 life cycle using silencing prior to actual viral infection. Both ß-TrCP1 and ß-TrCP2 contributed to CD4 down-modulation during aone-cycle viral infection iri Ghost cells. In addition, the combined silencing of both homologues in the absence of env and nef reversed CD4 down-modulation, showing that ß-TrCP 1 and ß-TrCP2 represent the main and additive effectors of HIV-1 encoded Vpu. In addition, we showed that silencing of ß-TrCPI but not ß-TrCP2 induced a decrease of HIV-1 LTR-driven expression. In a transient transfection system with Tat and a LTR luciferase reporter, both homologues modulated LTR-driven expression. The present study revealed that ß-TrCP2 represents a novel protein participating in HIV-1 cycle and complete comprehension of the complex interplay occurring between the two F-Box will improve our understanding of HIV-1 infection. Résumé La molécule CD4 joue un rôle clef dans la pathogenèse du SIDA ; elle est requise pour l'entrée du virus dans les cellules permissives et la diminution de sa concentration au niveau de la surface cellulaire est une importante caractéristique des cellules infectées par le VIH-1. Le virus encode pas moins de trois protéines qui participent à ce processus Nef, Vpu et Env. La protéine Vpu lie CD4 au niveau du réticulum endoplasmique et induit sa dégradation en interagissant avec une protéine cellulaire nommée ß-TrCP 1. Cette protéine de type F-Box est une sous unité du complexe ubiquitine-ligase E3 SCFß-TrCP. Elle permet la reconnaissance du substrat par le complexe qui induit l'ubiquitination et la subséquente dégradation de diverses protéines cellulaires comme la ß-catenin ou IκBα. Les mammifères possèdent un homologue à ß-TrCP1appelé ß-TrCP2 (ou HOS). L'analyse comparative du domaine permettant la reconnaissance des substrats des deux homologues montre de frappantes similarités. Le rôle de ß-TrCP2 dans le cycle viral du VIH-1 n'a pas encore été évalué. Lors de cette étude, nous avons recherché l'existence de variants génétique de BTRC (codant pour ß-TrCP1) et nous avons évalué si ces variants pourraient affecter la dégradation des molécules CD4 induite par le virus. Nous avons ainsi identifié un polymorphisme présent dans la population humaine avec une fréquence allélique de 0.03 qui consiste en une substitution de l'alanine 507 par une sérine. Nous avons cependant montré par transfection dans des cellules HeLa CD4+ que ce variant se comporte comme ß-TrCP 1 en ce qui concerne la modulation de CD4. De plus, nous avons déterminé si ß-TrCP2 partageait avec son homologue des propriétés structurelles et fonctionnelles qui lui permettraient de lier Vpu, moduler la concentration de CD4 et ainsi prendre part à la pathogenèse du SIDA. Pour ce faire, nous avons établi un système d'expression temporaire dans des cellules HeLa CD4+. Par co-immunoprécipitation, nous avons montré que ß-TrCP2 lie Vpu et est capable d'induire la dégradation de CD4 aussi efficacement que ß-TrCP1. Dans deux différentes lignées cellulaires, HeLa CD4+ et Jurkat, la dégradation de CD4 n'a pu être complètement inhibée par le silencing individuel de ß-TrCP 1 ou ß-TrCP2, mais nécessitait le silencing simultané des 2 gènes. Nous avons évalué le rôle des deux homologues dans le cycle viral du VIH-1 en infectant des cellules Ghost avec le virus après avoir effectué un silencing des deux protéines. Nous avons ainsi montré que ß-TrCP 1 et ß-TrCP2 contribuent de manière additive à la dégradation de CD4 induite par une infection du VIH-1. Le silencing combiné des deux homologues inhiba complètement cette dégradation en l'absence de env et nef, prouvant qu'aucune autre voie ne participe à ce processus: En outre, nous avons montré que le silencing de ß-TrCP 1 mais pas celui de ß-TrCP2 induisait une diminution de l'expression virale sous contrôle du LTR. Nous n'avons cependant pas été en mesure de reconstituer cet effet en exprimant Tat et un gène reporteur sous contrôle du LTR dans des cellules HeLa CD4+. Le présent travail révèle que ß-TrCP2 représente une nouvelle protéine participant dans le cycle viral du VIH-1. Une complète compréhension de l'effet de chacun des deux homologues sur le cycle viral permettra d'améliorer notre compréhension de l'infection par le VIH-1.

Profiling of signal transduction in human memory T cells

Résumé pour un large public: La vaccination a eu un impact énorme sur la santé mondiale. Mais, quel est le principe d'un vaccin? Il est basé sur la 'mémoire immunologique', qui est une particularité exclusive des systèmes immunitaires des organismes évolués. Suite à une infection par un pathogène, des cellules spécialisées de notre système immunitaire (les lymphocytes) le reconnaissent et initient une réaction immunitaire qui a pour but son élimination. Pendant cette réaction se développent aussi des cellules, appelées cellules lymphocytaires mémoire, qui persistent pour longue durée et qui ont la capacité de stimuler une réaction immunitaire très efficace immédiatement après une seconde exposition à ce même pathogène. Ce sont ces cellules mémoires (lymphocytes B et T) qui sont à la base de la 'mémoire immunologique' et qui sont stimulées lors de la vaccination. Chez l'homme, deux populations distinctes des lymphocytes T mémoires ont été identifiées: les cellules centrales (CM) et effectrices (EM) mémoires. Ces populations sont fonctionnellement hétérogènes et exercent des rôles distincts et essentiels dans l'immunité protectrice. Typiquement, les cellules effectrices mémoires sont capables de tuer immédiatement le pathogène tandis que les cellules centrales mémoires sont responsables d'initier une réponse immunitaire complète. Pourtant, les mécanismes biochimiques qui contrôlent les fonctions de ces cellules ont été jusqu'à présent peu étudiés à cause de la faible fréquence de ces cellules et de la quantité limitée de tissus humains disponibles pour les analyses. La compréhension de ces mécanismes est cruciale pour la réalisation de vaccins efficaces et pour le développement de nouveaux médicaments capables de moduler la réponse immunitaire lymphocytaire. Dans cette thèse, nous avons d'abord développé et amélioré une technologie appelée 'protéine array en phase inverse' qui possède un niveau de sensibilité beaucoup plus élevé par rapport aux technologies classiquement utilisées dans l'étude des protéines. Grâce à cette technique, nous avons pu comparer la composition protéique du système de transmission des signaux d'activation des cellules CM et EM humaines. L'analyse de 8 à 13 sujets sains a montré que ces populations des cellules mémoires possèdent un système de signalisation protéique différent. En effet, les cellules EM possèdent, par rapport aux cellules CM, des niveaux réduits d'une protéine régulatrice (appelée c-Cbl) que nous avons démontré comme étant responsable des fonctions spécifiques de ces cellules. En effet, en augmentant artificiellement l'expression de cette protéine régulatrice dans les cellules EM jusqu'au niveau de celui des cellules CM, nous avons induit dans les cellules EM des capacités fonctionnelles caractéristiques des cellules CM. En conclusion, notre étude a identifié, pour la première fois chez l'homme, un mécanisme biochimique qui contrôle les fonctions des populations des cellules mémoires. Résumé en Français: Les cellules mémoires persistent inertes dans l'organisme et produisent des réactions immunitaires rapides et robustes contre les pathogènes précédemment rencontrés. Deux populations distinctes des cellules mémoires ont été identifiées chez l'homme: les cellules centrales (CM) et effectrices (EM) mémoires. Ces populations sont fonctionnellement hétérogènes et exercent des rôles distincts et critiques dans l'immunité protectrice. Les mécanismes biochimiques qui contrôlent leurs fonctions ont été jusqu'à présent peu étudiés, bien que leur compréhension soit cruciale pour le développement des vaccins et des nouveaux traitements/médicaments. Les limites majeures à ces études sont la faible fréquence de ces populations et la quantité limitée de tissus humains disponibles. Dans cette thèse nous avons d'abord développé et amélioré la technologie de 'protéine array en phase inverse' afin d'analyser les molécules de signalisation des cellules mémoires CD4 et CD8 humaines isolées ex vivo. L'excellente sensibilité, la reproductibilité et la linéarité de la détection, ont permis de quantifier des variations d'expression protéiques supérieures à 20% dans un lysat équivalent à 20 cellules. Ensuite, grâce à l'analyse de 8 à 13 sujets sains, nous avons prouvé que les cellules mémoires CD8 ont une composition homogène de leur système de signalisation tandis que les cellules CD4 EM expriment significativement de plus grandes quantités de SLP-76 et des niveaux réduits de c-Cbl, Syk, Fyn et LAT par rapport aux cellules CM. En outre, l'expression réduite du régulateur négatif c-Cbl est corrélée avec l'expression des SLP-76, PI3K et LAT uniquement dans les cellules EM. L'évaluation des propriétés fonctionnelles des cellules mémoires a permis de démontrer que l'expression réduite du c-Cbl dans les cellules EM est associé à une diminution de leur seuil d'activation. En effet, grâce a la technique de transduction cytosolique, nous avons augmenté la quantité de c-Cbl des cellules EM à un niveau comparable à celui des cellules CM et constaté une réduction de la capacité des cellules EM à proliférer et sécréter des cytokines. Ce mécanisme de régulation dépend principalement de l'activité d'ubiquitine ligase de c-Cbl comme démontré par l'impact réduit du mutant enzymatiquement déficient de c-Cbl sur les fonctions de cellules EM. En conclusion, cette thèse identifie c-Cbl comme un régulateur critique des réponses fonctionnelles des populations de cellules T mémoires et fournit, pour la première fois chez l'homme, un mécanisme contrôlant l'hétérogénéité fonctionnelle des ces cellules. De plus, elle valide l'utilisation combinée des 'RPP arrays' et de la transduction cytosolique comme outil puissant d'analyse quantitative et fonctionnel des protéines de signalisation. Summary : Memory cells persist in a quiescent state in the body and mediate rapid and vigorous immune responses toward pathogens previously encountered. Two subsets of memory cells, namely central (CM) and effector (EM) memory cells, have been identified in humans. These subsets display high functional heterogeneity and assert critical and distinct roles in the control of protective immunity. The biochemical mechanisms controlling their functional properties remain so far poorly investigated, although their clarification is crucial for design of effective T-cell vaccine and drug development. Major limitations to these studies lie in the low frequency of memory T cell subsets and the limited amount of human specimen available. In this thesis we first implemented the innovative reverse phase protein array approach to profile 15 signalling components in human CD8 and CD4 memory T cells isolated ex vivo. The high degree of sensitivity, reproducibility and linearity achieved, allowed an excellent quantification of variations in protein expression higher than 20% in as few as 20-cell equivalent per spot. Based on the analysis of 8 to 13 healthy subjects, we showed that CD8 memory cells have a homogeneous composition of their signaling machinery while CD4 EM cells express statistically significant increased amounts of SLP-76 and reduced levels of c- Cbl, Syk, Fyn and LAT as compared to CM cells. Moreover, in EM but not CM cells, reduced expression of negative regulator c-Cbl correlated with the expression of SLP-76, PI3K and LAT. Subsequently, we demonstrated that the higher functional properties and the lower functional threshold of EM cells is associated with reduced expression of c-Cbl. Indeed, by increasing c-Cbl content of EM cells to the same level of CM cells using cytosolic transduction, we impaired their proliferation and cytokine production. This regulatory mechanism was primarily dependent on c-Cbl E3 ubiquitin ligase activity as evidenced by the weaker impact of enzymatically deficient c-Cbl C381A mutant on EM cell functions. Together, these results identify c-Cbl as a critical regulator of the functional responses of memory T cell subsets and provides, for the first time in humans, a mechanism controlling the functional heterogeneity of memory CD4 cells. Moreover it validates the combined use of RPP arrays and cytosolic transduction approaches as a powerful tool to quantitatively analyze signalling proteins and functionally assess their roles.

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

Régulation des chaperons de la présentation antigénique par ubiquitination

La chaîne invariante forme un complexe nonamérique avec les molécules classiques du CMH de classe II. HLA-DM et HLA-DO, des molécules non-classiques de classe II, sont aussi impliquées dans la présentation des peptides antigéniques aux lymphocytes T. Ces molécules chaperones de la présentation antigénique modulent la capacité d’une cellule à présenter des antigènes par les moloécules classiques du CMH de classe II. La régulation transcriptionnelle des molécules chaperones, tout comme celle des autres molécules du CMH de classe II, est assurée par le transactivateur CIITA. La molécule HLA-DR peut être régulée négativement de manière post-traductionnelle par ubiquitination grâce à l’enzyme E3 ubiquitine ligase MARCH1. Celle-ci est induite par l’interleukine-10 dans les monocytes. L’objectif de ce projet était de déterminer si l’ubiquitination par MARCH1 peut aussi réguler l’expression des molécules chaperones de la présentation antigénique. Les expériences furent réalisées dans le contexte de co-transfections en cellules HEK293T. L’expression des molécules fut évaluée par immunomarquages et cytométrie de flux. Il a été montré que l’isoforme p33 de la chaîne invariante est régulé négativement en présence de MARCH1 à partir de la surface cellulaire, causant ainsi sa dégradation. Tel que démontré par l’utilisation d’un mutant dépourvu de queue cytoplasmique, cette dernière région n’est pas indispensable à ce phénomène. Une hypothèse est qu’une molécule non-identifiée, associée à Ii, serait ubiquitinée par MARCH1, l’entraînant dans sa régulation négative. Il fut déterminer que cette molécule n’était pas CXCR2, un récepteur pouvant être impliqué, avec la chaîne invariante et CD44, en tant que récepteur de MIF (Macrophage Inhibitory Factor). Il fut aussi montré que HLA-DO peut être ciblé par MARCH1 mais ceci ne semble pas être un phénomène dominant; l’expression des complexes DO/DM n’étant pas affectée bien qu’ils entrent en interaction avec MARCH1. L’expression de HLA-DM n’est pas affectée par MARCH1. Il n’a toutefois pas été déterminé hors de tout doute si MARCH1 peut modifier DM; des résultats obtenus avec une queue cytoplasmique de DM possédant une lysine laissant suggérer qu’il est possible que MARCH1 interagisse avec DM. Dans l’ensemble, les travaux démontrent que l’ubiquitination par MARCH1 joue un rôle dans la régulation post-transcriptionnelle de la chaîne invariante p33 mais pas HLA-DO et HLA-DM.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

Analyse de la localisation génomique et identification de nouvelles fonctions des sous-unités Rpb4/Rpb7 de l’ARN polymérase II et des facteurs TFIIF, TFIIS et UBR5

Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription.

MARCH1 : new insights in the activation of B cells

L’implication des cellules B dans le développement de l’auto-immunité ne cesse d’être illustrée par de récentes publications. Les cellules présentent des peptides du soi aux cellules T auto-réactives ce qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’anticorps auto-réactifs. Dans le présent document, nous explorons la présentation antigénique et la modification post-traductionnelle du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH-II). MARCH1 est une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH-II et le relocalise le complexe vers les endosomes de recyclage. Ainsi, MARCH1 est un inhibiteur de la présentation d’antigènes exogènes. Ici, nous démontrons que MARCH1 est exprimé seulement dans la sous-population des cellules B folliculaires et que cette expression est perdue lors de l’entrée dans les centres germinatifs. Nous proposons que MARCH1 établie une barrière de formation de centres germinatifs. Nous démontrons le lien entre MARCH1 et la hausse de CMH-II à la surface des cellules B à la suite d’un traitement à l’IL-10. De plus, nous avons testé plusieurs stimuli activateurs des cellules B et démontrons que MARCH1 est régulé à la baisse dans tous les cas. De plus, nous mettons en valeurs le rôle de la voie canonique d’activation de NF-κB dans cette régulation de MARCH1. Finalement, nous avons développé un système de lentivirus exprimant MARCH1 qui nous permet de forcer l’expression de MARCH1 dans des cellules réfractaires à la transfection. Nous discutons de l’implication de cette régulation du CMH-II par MARCH1 dans le développement de maladies auto-immunes.

Mécanismes moléculaires de la réplication préférentielle du VIH-1 dans les cellules à polarisation Th1Th17 versus Th1 : rôle de PPARG dans la régulation négative de la réplication virale

Les cellules T CD4+ humaines sont hétérogènes du point de vue de la permissivité à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Notre laboratoire a préalablement démontré que les cellules Th1 à phénotype CXCR3+CCR6- sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 alors que les cellules Th1Th17 à phénotype CXCR3+CCR6+ y sont hautement permissives. La réplication du VIH dépend de plusieurs facteurs cellulaires de restriction ou de permissivité agissant à différentes étapes du cycle viral. Toutefois, malgré plusieurs avancées, la compréhension des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation de la réplication du VIH est encore limitée. L’objectif majeur de ce projet de maîtrise est de caractériser les mécanismes moléculaires de la permissivité et de la résistance au VIH respectivement dans les cellules Th1Th17 et Th1. Ce mémoire est divisé en quatre parties qui visent: (i) l’identification des voies canoniques et des fonctions biologiques différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 par l’analyse de leur transcriptome au niveau du génome entier; (ii) la validation de l’expression différentielle des gènes d’intérêt identifiés par biopuces au niveau des transcrits et des protéines; (iii) la caractérisation du rôle fonctionnel de certains de ces facteurs (i.e., PPARG, AhR) sur la réplication du VIH dans les cellules Th1Th17 versus Th1; et (iv) l’identification du niveau auquel ces facteurs interfèrent avec le cycle de réplication du VIH. Nos résultats d’analyse du transcriptome du génome entier par Gene Set Enrichment Analysis et Ingenuity Pathway Analysis indiquent que les cellules à profil Th1Th17 sont plus susceptibles à l’activation cellulaire et à l’apoptose, favorisent plus l’inflammation et expriment moins fortement les gènes liés à la dégradation protéosomale comparé aux cellules à profil Th1. Ces différences dans la régulation de diverses voies et fonctions biologiques permettent en partie d’expliquer la susceptibilité à l’infection par le VIH dans ces cellules. Nous avons ensuite confirmé l’expression différentielle de certains gènes d’intérêt dans les cellules Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) au niveau de l’ARNm et des protéines. Finalement, nous avons démontré le rôle des facteurs de transcription PPARG et AhR dans la régulation de la réplication du VIH. L’activation de la voie PPARG par la rosiglitazone induit la diminution importante de la réplication du VIH dans les cellules T CD4+, alors que l’activation de la voie AhR par les ligands exogènes TCDD et FICZ augmente de façon significative la réplication virale. Nous proposons que la voie PPARG agit comme un régulateur négatif de la réplication du VIH dans ces cellules, en interférant avec la polarisation Th17 et probablement en inhibant l’activité transcriptionnelle du facteur NF-kB. Les rôles des formes nucléaires versus cytoplasmiques du récepteur Ahr semblent être diamétralement opposés, dans la mesure où l’interférence ARN contre AhR s’associe également à l’augmentation de la réplication virale. Il est ainsi possible que la forme cytoplasmique d’AhR, connue par son activité E3 ligase, participe à la dégradation protéosomale des particules virales. Le mécanisme par lequel le AhR nucléaire versus cytoplasmique interfère avec la réplication virale est en cours d’étude au laboratoire. Cette étude représente la première caractérisation de l’expression différentielle de gènes au niveau du génome entier de sous-populations T CD4+ permissives versus résistantes à l’infection par le VIH. Nos résultats identifient de nouvelles cibles moléculaires pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4+ primaires.