Sistemas drug delivery aplicados a novos inibidores de topoisomerases estruturalmente derivados de toxinas bacterianas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante por ExoU de Pseudomonas aeruginosa

ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103∆exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103∆UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante

Determinação do perfil fenotípico e genotípico de amostras de Staphylococus aureus resistentes à meticilina (MRSA) e sensíveis a antibióticos não ß-lactâmicos em cinco hospitais no município do Rio de Janeiro

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um dos principais microrganismos envolvidos nas Infecções relacionadas à Assistência à Saúde (IrAS). Porém, um clone de MRSA, o CA-MRSA, emergiu na comunidade e atualmente vem sendo agente de IrAS. O objetivo desta dissertação é avaliar fenotípica e genotipicamente 111 amostras de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina e sensíveis a antibióticos não ß-lactâmicos de pacientes atendidos em cinco hospitais no município do Rio de Janeiro. Utilizando os critérios padronizados pelo CLSI 2012, foram determinadas as susceptibilidades a 11 antimicrobianos pelo método de disco difusão em ágar e concentração inibitória mínima para vancomicina e oxacilina pelo método da microdiluição em caldo. A multirresistência (resistência a 3 ou mais antimicrobianos não ß-lactâmicos) foi observada em 31,5% das amostras, sendo que 53,2% apresentaram resistência ao antimicrobiano clindamicina, uma das opções para o tratamento empírico das infecções de pele/tecidos moles. 86,4% apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina ≥ 1,0 g/mL ou seja, elevado percentual de amostras associadas ao fenômeno MIC creep, o qual está associado ao insucesso na terapia antimicrobiana anti-MRSA. Não foi observado até o momento nenhuma amostra com CIM ≥ 4cg/mL para vancomicina, entretanto, já há resistência à linezolida em quatro hospitais do estudo. A tipificação do SCCmec nos permitiu classificar 4,5% das amostras em HA-MRSA e 86,5% em CA-MRSA, nas quais a resistência heterogênea típica à oxacilina foi observada em 57,2%. A toxina de Panton-Valentine (PVL) foi identificada pela metodologia de PCR em 28% das amostras com genótipo CA-MRSA. Os fatores de riscos clássicos, da literatura, relacionados à infecção por HA-MRSA foram também observados nos pacientes com infecção por CA-MRSA portadoras de SCCmec IV e V. No intuito de verificar a existência de similaridades genéticas ou a presença de clone predominante entre as amostras dos cinco hospitais, foi realizada a técnica de eletroforese em gel sob campo pulsado (PFGE) e observou-se diversidade genética assim como a presença de amostras com padrões similares aos clones OSPC (18,5%) e USA400. Não foram encontradas amostras com padrões de eletroforese similares aos clones USA300, USA800 e CEB. É essencial a vigilância da resistência aos antimicrobianos não ß-lactâmicos no CA-MRSA, em especial à vancomicina. A mudança na epidemiologia deste microrganismo vem impactando os padrões característicos dos genótipos limitando os critérios de diferenciação entre eles. Neste contexto, as técnicas moleculares atuam como excelentes ferramentas de caracterização. O conhecimento do patógeno auxilia na elaboração e implementação de medidas preventivas, contribuindo para o controle da doença tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade.

Avaliação microbiológica, físico-química e detecção de resíduos de antimicrobianos em leite humano, bovino e caprino e pesquisa de toxinas em linhagens de Staphylococcus spp

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterização da anemia em cadelas com piometra

A piometra é uma condição mórbida caracterizada pela inflamação do útero com acúmulo de exsudatos, resultante de ações hormonais e geralmente associada à presença de bactérias no lúmen uterino. A anemia é a alteração hematológica mais frequentemente observada em cadelas com piometra e está associada à cronicidade da doença, diminuição da eritropoiese, devido ao efeito toxêmico na medula óssea, diminuição da disponibilidade de ferro ou perda de sangue para o útero. Adicionalmente, o efeito das toxinas bacterianas e os radicais livres gerados pelo metabolismo oxidativo dos neutrófilos podem resultar na modificação da estrutura antigênica da membrana do eritrócito, permitindo a ligação de imunoglobulinas em sua superfície e acelerando a destruição eritrocitária. Essa hipótese pode ser comprovada pela detecção de imunocomplexos na superfície eritrocitária de cadelas com piometra. O diagnóstico de piometra foi estabelecido em 33 cadelas atendidas no Serviço de Obstetrícia/Ginecologia do Hospital Veterinário da Universidade de São Paulo com base na anamnese, exame físico e exames subsidiários (ultrassonografia, hemograma e concentrações séricas de ureia e creatinina). As amostras sanguíneas foram coletadas em dois momentos. A primeira anterior a ovariosalpingohisterectomia (OSH) e a segunda, sete a dez dias após a OSH. A quantificação de hemácias com deposição de imunocomplexos IgG e IgM foi realizada utilizando-se anticorpos anti-IgG e anti-IgM (Bethyl®Laboratories) conjugadas a fluoresceína de isotiocianato (FITC), e a leitura realizada com citômetro de fluxo (FACS Calibur; Becton, Dickinson and Company© 2007 BD), sendo os resultados expressos em percentual de hemácias marcadas. Foram utilizados o Teste de Shapiro-Wilk para a avaliação da distribuição de dados e a comparação entre os grupos controle, pré e pós-OSH foi realizada valendo-se do Teste t ou Teste t pareado e Correlação de Pearson, e do Teste U de Mann-Whitney e Correlação de Spearman, para as variáveis com distribuição normal e não-normal, respectivamente. O valor de alfa estipulado foi de 0,05. Analisando os valores hematológicos de cada um dos cães incluídos no estudo, observa-se que 19 (57,6%) apresentavam anemia normocítica normocrômica não regenerativa no momento pré-OSH e cinco (15,2%) no momento pós-OSH. Em cães do grupo controle foram observadas 0,14 - 0,77% (0,43±0,18%) de hemácias marcadas com anticorpos anti-IgG FITC e 0,29 - 9,58% (0,68±0,29%) para anticorpos anti-IgM FITC. Já nos cães com piometra, foram encontradas 0,14 - 4,19% (0,96±0,86%) de hemácias marcadas com anticorpos anti-IgG FITC e 0,29 - 9,58% (1,37±1,71%) com anticorpos anti-IgM FITC, antecedendo a OSH. No momento pós-OSH observou-se 0,18 - 16,2% (2,77±3,67%) de hemácias marcadas para anticorpos anti-IgG FITC e 0,15 - 19,8% (4,01±4,46%) para anticorpos anti-IgM FITC. O percentual de hemácias marcadas com anticorpos anti-IgG FITC diferiu entre os grupos controle e piometra, pré-OSH (p<0,001) e pós-OSH (p<0,001). Em relação a anticorpos anti-IgM FITC, não foram observadas diferenças entre os grupos controle e pré-OSH (p=0,09), porém, após a OSH houve aumento na marcação de hemácias, quando comparado ao grupo controle (p<0,001). Apenas alguns animais apresentaram mais de 5% de hemácias marcadas, e isto ocorreu, principalmente, no momento pós-OSH. Entretanto, não resultou no agravamento da anemia, indicando que a piometra em cadelas está associada à deposição de imunoglobulinas G ou M na superfície das hemácias, sem, no entanto, promover hemólise ou agravamento da anemia

Espessura do assoalho da câmara pulpar de molares decíduos inferiores tratados pelo TRA, pulpotomia e pulpectomia

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Caracterização do gene chi_l555 e propriedades bioquímicas da quitinase de Bacillus thuringiensis

Pós-graduação em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) - FCAV

Síntese e aplicações de inibidores peptídicos de topoisomerases associados a sistemas de liberação controlada de fármacos

O uso de novas tecnologias para o desenvolvimento de medicamentos constitui uma estratégia promissora no campo da biotecnologia. Nesse sentido, peptídeos com efeito antimicrobiano, produzidos por plantas, animais e microrganismos estão sendo utilizados como modelos para o desenvolvimento de novos medicamentos com aplicações em saúde. Resultados promissores têm sido obtidos em relação à inibição da atividade das enzimas bacterianas DNA girase e topoisomerase IV por derivados peptídicos de toxinas bacterianas, comprovados em ensaios in vitro. Porém, ensaios in vivo não demonstraram reprodutibilidade, basicamente devido à baixa permeabilidade da célula bacteriana a estes compostos. Desta forma, o objetivo deste projeto consiste em aplicar sistemas eficientes para promover o acesso de moléculas peptídicas sintéticas derivadas de toxinas bacterianas, ao meio intracelular e, consequentemente, aos seus alvos intracelulares: as enzimas DNA girase e/ou topoisomerase IV. Com isso, pretendemos solucionar a barreira técnica em que se encontram as aplicações dessa classe de biomoléculas como precursores de novos agentes antibacterianos, o que certamente causaria um importante avanço nas pesquisas desenvolvidas pelo grupo

Isoeritrólise neonatal eqüina

Equine neonatal isoerythrolysis is a neonatal foals’ illness. Results from the incompatibility of blood type between the foal and the mare and mediated by maternal antibody absorbed by the colostrum against foal’s red blood cells. Characterized by a type ll hypersensitivity reaction, where the exhibition of the organism to a strange antigen, that it takes the sensitization of the lymphocytes B that after the removal of the antigens by the reticule-endothelial system the production of immunoglobulin is decreased, with the formation of cellular immunological will cause the occurrence of the illness in foal of sensitized mares. The most important clinical signs are severe anemia and jaundice, and this illness should be differentiated of other as: hemolysis induced by bacterial toxins, diseases of the hepatobiliary system, disseminated intravascular coagulation and incompatibility in blood transfusions. Like the sensitization happens during the previous incompatible foal’s birth, most cases occur in foals of multiparous mares. However during the first pregnancy the mare can generate a foal with neonatal 7 isoerythrolysis if she have developed placental anomaly in the beginning of the pregnancy which blood cells in her circulation

Estudos de permeação e liberação de peptídeos antimicrobianos estruturalmente derivados da toxina CCDB

O uso de peptídeos sintéticos para o desenvolvimento de novas drogas é uma estratégia promissora no campo da biotecnologia. Peptídeos derivados de toxinas bacterianas intracelulares, produzidas por sistemas de morte pós-segregacional (PKS) tais como CcdB e ParE são exemplos dessa estratégia. Porém, moléculas com estrutura peptídica derivadas de toxinas bacterianas apresentam sérios problemas na aplicação terapêutica por apresentarem baixa solubilidade e difícil permeabilidade em membranas bacterianas. O objetivo desse estudo consistiu no desenvolvimento e aprimoramento de sistemas nanoestruturados (lipossomas) que permita a imobilização de análogos peptídicos da toxina CcdB e sua consequente translocação no citosol bacteriano, permitindo que os mesmos atinjam seus alvos celulares, enzimas DNA girase e Topoisomerase IV. Lipossomas do tipo SUV (small unilamellar vesicles), foram preparados pela técnica de extrusão-evaporação variando-se suas formulações. Desta forma, pretendeu-se avaliar a eficiência de encapsulação dos peptídeos através de técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e espectroscopia de UV-Vis e fluorescência. Após testes de eficiência de encapsulação, os lipossomas contendo os análogos peptídicos encapsulados, foram submetidos a ensaio de inibição de crescimento em meio líquido para duas espécies bacterianas: Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Resultados demonstraram que a utilização de sistemas nanoestruturados é de grande importância para viabilizar a aplicação desta classe de biomoléculas em estudos terapêuticos, permitindo assim, que tais peptídeos possam ser utilizados como antibióticos promissores, se associados a sistemas de transporte e liberação controlada de moléculas peptídicas.

Síntese e estudos de sistemas de bioencapsulação associados a peptídeos antimicrobianos miméticos da toxina natural CcdB

Pós-graduação em Biotecnologia - IQ

Síntese, estrutura e atividade de peptídeos derivados de ParD, o antídoto do módulo toxina-antitoxina ParDE

Pós-graduação em Biotecnologia - IQ

Novos inibidores peptídicos de topoisomerases bacterianas estruturalmente derivados da proteína CcdB

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Endotoxinas bacterianas versus resposta inflamatória e alérgica

Endotoxinas bacterianas são lipopolissacáridos da membrana externa das bactérias Gram-negativas e são responsáveis pela libertação de citocinas no organismo humano. Estas citocinas podem exacerbar a sintomatologia de determinadas patologias, nomeadamente do foro pulmonar, agravando a sua situação clínica. A procura de melhor conforto habitacional, com a criação de micro ambientes "artificiais" dentro de casa, oferece bem-estar, mas por vezes arrasta consigo uma maior quantidade de poluentes aéreos indoor, nomeadamente bioaerossóis. A influência das bactérias Oram­ negativas em suspensão indoor nos níveis basais dos marcadores analíticos sanguíneos de resposta inflamatória e alérgica, é um ponto importante a ter em consideração quando se pretende elevar o grau de conforto de uma habitação sem implicações negativas para a saúde humana. Este estudo demonstra que a presença das endotoxinas bacterianas indoor, na ausência de patologia aguda, não prejudica o ser humano e a melhoria das condições habitacionais não degrada o estado fisiológico dos indivíduos. /Summary: Bacterial endotoxins are lipopolysaccharides found in the outer membrane of Gram­ negative bacteria and are responsible for the release of cytokines in the human body. These cytokines may exacerbate the symptoms of certain diseases, including pulmonary events, worsening their medical condition. The demand for better housing comfort with the creation of "artificial" micro-environments in the house, offers well-being, but often brings a greater quantity of indoor air pollutants, including bioaerosols. The influence of suspended indoor Gram-negative bacteria in basal levels of blood analytical markers of inflammatory and allergic rhinitis, is an important point to consider when attempting to raise the comfort level of a dwelling without negative implications for human health. This study proves that the presence of indoor bacterial endotoxin in the absence of acute pathology, do not affect humans and the improvement of living conditions does not degrade the physiological status of individuals.

Relação dos sistemas de reparo de DNA em Escherichia coli K-12 com resistência a antibióticos, características adesivas e formação de biofilme

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são geradas durante o metabolismo celular normal e podem produzir vários danos oxidativos no DNA, tais como lesões nas bases nitrogenadas ou sítios apurínico/apirimidínico (AP). Essas lesões podem acarretar acúmulo de sítios de mutações, caso esses danos não sejam reparados. Entretanto, as bactérias possuem vários mecanismos de defesa contra as ERO que desempenham um importante papel na manutenção da fisiologia. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar se sistemas enzimáticos, como o reparo por excisão de bases (BER), sistema SOS e SoxRS, interferem em respostas como a sensibilidade aos antibióticos, aderência das células bacterianas a superfícies bióticas ou abióticas e formação de biofilme. Os mutantes utilizados no presente estudo são todos derivados de Escherichia coli K-12 e os resultados obtidos mostraram que, dos mutantes BER testados, o único que apresentou diferença no perfil de sensibilidade aos antimicrobiamos em relação à cepa selvagem (AB1157) foi o mutante xthA- (BW9091), deficiente em exonuclease III. No teste de aderência qualitativo realizado com linhagem de células HEp-2 (originária de carcinoma de laringe humana) foi observado que onze cepas da nossa coleção, apresentaram um padrão denominando like-AA, contrastando com o que era esperado para as cepas de E. coli utilizadas como controle negativo, que apresentam aderência discreta sem padrão típico. A aderência manose-sensível via fímbria do tipo I avaliada nesse estudo mostrou que essa fimbria, possui um papel relevante na intensidade da aderência e filamentação nessas cepas estudas. A filamentação é uma resposta SOS importante para que o genoma seja reparado antes de ser partilhado pelas células filhas. Além disso, com relação à formação de biofilme, oito cepas apresentaram um biofilme forte sendo que essa resposta não foi acompanhada pelo aumento da intensidade de filamentação. Nossos resultados em conjunto sugerem o envolvimento de estresse oxidativo na definição de parâmetros como sensibilidade a antimicrobianos, padrão e intensidade de aderência, filamentação e formação de biofilme nas amostras de E. coli K-12 avaliadas neste trabalho. Sugerimos que a aderência gera estresse oxidativo causando danos no DNA, o que leva a indução do sistema SOS resultando na resposta de filamentação observada.