Terapia génica dirigida en una nuevo "sitio seguro" en células progenitoras hematopoyéticas humanas para su aplicación en anemia de Fanconi

La anemia de Fanconi es una enfermedad hereditaria de baja prevalencia, descrita por primera vez por el pediatra Guido Fanconi en 1927. Esta enfermedad se produce como consecuencia de mutaciones en cualquiera de los 19 genes de Fanconi descritos hasta la actualidad, y que participan en la ruta de Fanconi/BRCA. Esta ruta se encarga de la reparación de enlaces intercatenarios del ADN y de coordinar los distintos mecanismos de reparación de las dobles roturas en el ADN. La anemia de Fanconi está caracterizada por generar inestabilidad genómica, lo que da lugar a anomalías esqueléticas y predisposición al cáncer, si bien la principal causa de muerte de pacientes pediátricos es el fallo de médula ósea. Uno de los tratamientos alternativos al trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos de pacientes con anemia de Fanconi se basa en la reinfusión de células madre hematopoyéticas autólogas, tras su corrección con vectores lentivirales. Para limitar al máximo los riesgos de este tipo de terapias se están desarrollando nuevas tecnologías de edición génica basadas en la inserción dirigida de los genes terapéuticos. Esta nueva aproximación se fundamenta en la generación de dobles roturas en regiones específicas del genoma, cuya reparación por recombinación homóloga facilitaría la entrada de los genes terapéuticos aportados por ADNs donadores externos con homología por dicha región. En este trabajo se ha desarrollado una aproximación de edición génica en un nuevo “sitio seguro” del genoma denominado SH6. Para ello se ha trabajado con la línea celular HEK-293H, así como también con progenitores hematopoyéticos humanos purificados en base a la expresión del marcador CD34. Para su desarrollo se han utilizado nucleasas de edición, tales como meganucleasas y TALEN, en combinación con matrices donadoras portadoras del gen marcador EGFP (GM) o del gen terapéutico FANCA (TM). En todos los casos los genes marcadores y terapéuticos estaban regulados por el promotor EF1α, y flanqueados por dos brazos de homología para el sitio SH6. Estos plásmidos han servido como molde para realizar la terapia génica de edición en el sitio seguro SH6...

Clinical pharmacogenomic testing of KRAS, BRAF and EGFR mutations by high resolution melting analysis and ultra-deep pyrosequencing

BACKGROUND: Epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream factors KRAS and BRAF are mutated in several types of cancer, affecting the clinical response to EGFR inhibitors. Mutations in the EGFR kinase domain predict sensitivity to the tyrosine kinase inhibitors gefitinib and erlotinib in lung adenocarcinoma, while activating point mutations in KRAS and BRAF confer resistance to the anti-EGFR monoclonal antibody cetuximab in colorectal cancer. The development of new generation methods for systematic mutation screening of these genes will allow more appropriate therapeutic choices. METHODS: We describe a high resolution melting (HRM) assay for mutation detection in EGFR exons 19-21, KRAS codon 12/13 and BRAF V600 using formalin-fixed paraffin-embedded samples. Somatic variation of KRAS exon 2 was also analysed by massively parallel pyrosequencing of amplicons with the GS Junior 454 platform. RESULTS: We tested 120 routine diagnostic specimens from patients with colorectal or lung cancer. Mutations in KRAS, BRAF and EGFR were observed in 41.9%, 13.0% and 11.1% of the overall samples, respectively, being mutually exclusive. For KRAS, six types of substitutions were detected (17 G12D, 9 G13D, 7 G12C, 2 G12A, 2 G12V, 2 G12S), while V600E accounted for all the BRAF activating mutations. Regarding EGFR, two cases showed exon 19 deletions (delE746-A750 and delE746-T751insA) and another two substitutions in exon 21 (one showed L858R with the resistance mutation T590M in exon 20, and the other had P848L mutation). Consistent with earlier reports, our results show that KRAS and BRAF mutation frequencies in colorectal cancer were 44.3% and 13.0%, respectively, while EGFR mutations were detected in 11.1% of the lung cancer specimens. Ultra-deep amplicon pyrosequencing successfully validated the HRM results and allowed detection and quantitation of KRAS somatic mutations. CONCLUSIONS: HRM is a rapid and sensitive method for moderate-throughput cost-effective screening of oncogene mutations in clinical samples. Rather than Sanger sequence validation, next-generation sequencing technology results in more accurate quantitative results in somatic variation and can be achieved at a higher throughput scale.

Colorectal Cancer Classification and Cell Heterogeneity: A Systems Oncology Approach.

Colorectal cancer is a heterogeneous disease that manifests through diverse clinical scenarios. During many years, our knowledge about the variability of colorectal tumors was limited to the histopathological analysis from which generic classifications associated with different clinical expectations are derived. However, currently we are beginning to understand that under the intense pathological and clinical variability of these tumors there underlies strong genetic and biological heterogeneity. Thus, with the increasing available information of inter-tumor and intra-tumor heterogeneity, the classical pathological approach is being displaced in favor of novel molecular classifications. In the present article, we summarize the most relevant proposals of molecular classifications obtained from the analysis of colorectal tumors using powerful high throughput techniques and devices. We also discuss the role that cancer systems biology may play in the integration and interpretation of the high amount of data generated and the challenges to be addressed in the future development of precision oncology. In addition, we review the current state of implementation of these novel tools in the pathological laboratory and in clinical practice.

Adherencia a las guías de reanimación temprana dirigida por metas, en un hospital de Bogotá, Colombia

Introducción: El manejo temprano de los pacientes con sepsis severa y choque séptico en los servicios de urgencias bajo la “terapia temprana dirigida por metas”, propuesto por Rivers en su guía “Surviving Sepsis Campain”, parece relacionarce con la disminución de la mortalidad en los primeras 28 días posteriores a la atención médica. El presente estudio busca medir la adherencia a estas recomendaciones en un servicio de urgencias de un hospital de cuarto nivel. Metodología: Mediante un estudio observacional analítico de corte transversal, fueron revisadas las historias clínicas de un grupo de pacientes con sepsis severa y choque séptico, que ingresaron en el año 2013 al servicio de urgencias de un hospital de cuarto nivel de Bogotá, Colombia, con el fin de determinar la proporción de pacientes que recibió reanimación temprana guiada por metas de acuerdo a la guía internacional. Resultados: Se evaluaron 3000 registros clínicos, de los cuales fueron incluídos 130 pacientes. 15.4% recibió manejo de acuerdo a las guías internacionales de reanimación temprana. La mortalidad por sepsis severa y choque séptico fue del 10.7%. La mortalidad en pacientes atendidos de acuerdo a las guías fue del 15% comparada y del 10% en los no adherentes (p > 0.05). Conclusiones: El presente estudio muestra cifras bajas de adherencia a las recomendaciones internacionales propuestas por Rivers. Se deben realizar campañas de sensibilización y capacitación al personal médico y paramédico de los servicios de urgencias con el fin de mejorar la supervivencia en este grupo de pacientes.

Um estudo crítico das psicoterapias fenomenológico - existenciais: terapia centrada na pessoa e gestalt-terapia

Este estudo consiste em uma pesquisa teórica que objetiva desenvolver reflexões críticas sobre as bases epistemológicas da terapia centrada na pessoa e da gestaltterapia, configuradas nas matrizes conceituais elaboradas por Carl Rogers e por Frederick Perls. Analisa algumas reconfigurações teóricas dessas psicoterapias propostas por autores brasileiros a partir da articulação com determinados conceitos da fenomenologia de Martin Heidegger. As teorias psicoterápicas, de um modo geral, ainda mantêm uma concepção de sujeito abstrato e descontextualizado historicamente. O mundo hoje nos coloca diante de grandes desafios, em que são necessárias novas formas de compreensão da existência humana e um fazer clínico que dê suporte aos sofrimentos do homem contemporâneo. O percurso metodológico utilizado no estudo constou de: 1. Seleção de textos clássicos para compor as matrizes epistemológicas das psicoterapias centrada na pessoa e gestáltica; 2. Triagem de material produzido por autores que apresentam análise crítica referente ao tema; 3. Sistematização de categorias conceituais da matriz das respectivas psicoterapias; 4. Análise e discussão de alguns temas presentes em publicações nacionais que indicam pontos de re-configurações das matrizes. Dentre os indicativos apontados pelos autores investigados, foi possível destacar: a necessidade de incluir na teoria centrada na pessoa, o estranho, à falta, como condição de possibilidade da existência; superação do conceito de essência, na teoria gestáltica; ressonâncias da concepção heideggeriana de angústia para a prática clínica, já que esta não é concebida enquanto um sintoma psicopatológico a ser extinto ou um distúrbio funcional; assim como dos conceitos de abertura e cuidado, que possibilita pensar a função terapêutica como a de ajudar o cliente a interpretar-se a si mesmo, devolvendo-o ao seu próprio cuidado de maneira mais livre e responsável. Concluímos que, apesar da necessidade de mais estudos a respeito do tema, já há na atualidade um movimento por parte de alguns psicólogos em lançar um olhar contemporâneo sobre a terapia centrada na pessoa e gestáltica, afastando-se de uma concepção essencialista de sujeito e de uma subjetividade enclausurada.

Atención a las personas fumadoras : proceso asistencial integrado

Publicado en la página web de la Consejería de Salud y Bienestar Social: www.juntadeandalucia.es/salud (Consejería de Salud y Bienestar Social / Profesionales / Nuestro Compromiso por la Calidad / Procesos Asistenciales Integrados)

La onda de pletismografía y su correlación con la reposición de líquidos intraoperatorios en pacientes sometidos a anestesia general

Introducción: Se ha conocido la necesidad de la monitoria del estado hemodinámico de los pacientes quirúrgicos de forma dinámica, que permita realizar una valoración rápida, menos invasiva y confiable para un diagnóstico acertado y evaluar la respuesta a las conductas tomadas. El delta de pletismografía es una herramienta confiable, no invasiva y dinámica que logra cumplir con las características antes mencionadas y que además puede llegar a tener un papel preponderante en la terapia hídrica dirigida. Metodología: Estudio de correlación, se realizaron evaluaciones sistemáticas de la onda de pletismografía y las variables del paciente desde la inducción anestésica hasta el inicio del procedimiento quirúrgico, se determinó la correlación entre la variabilidad de la onda de pletismografía, el delta de pletismografía y el requerimiento de líquidos intraoperatorios. Se incluyeron pacientes adultos en el rango de 18 a 80 años, que cumplían los criterios de inclusión, programados para cirugía bajo anestesia general en la Fundación Cardioinfantil Instituto de Cardiología, hasta lograr la muestra calculada de 31 pacientes. Siguiendo los principios éticos de la declaración de Helsinki y la normatividad colombiana, este estudio no consideró la realización de ningún tipo de intervención en los pacientes lo que lo cataloga de bajo riesgo. Resultados: El 80.6% presentó variabilidad aumentada, con correlación entre la variabilidad de la onda del pulso, el delta POP y la cantidad de líquidos intraoperatorios (0.245 IC 95%). Disminución del delta POP en T3, sugiriendo respuesta a líquidos, correlación entre uso de vasopresores, analgesia y náuseas y vómito postoperatorio. Conclusión: Existe correlación entre la variabilidad de la onda de pletismografía, el delta de pletismografía y la reposición de líquidos endovenosos en los pacientes ventilados mecánicamente durante anestesia general. Además se encuentra asociación entre uso de vasopresores, analgesia y náuseas y vómito postoperatorio.

Identificação de alvos na terapia anti-cancerígena utilizando técnicas de modelação molecular

Miguel Fernandes

Investigação de genes de resistência a carbapenêmicos e aminoglicosídeos e tipagem molecular de amostras de Acinetobacter baumannii isoladas de pacientes internados em unidades de terapia intensiva de um hospital terciário

Pós-graduação em Microbiologia - IBILCE

Epidemiologia da colonização e infecção microbiana em Unidade de Terapia Intensiva Neonatal: abordagem clínica e molecular

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Novos complexos micelares de metais de transição para aplicação na terapia dirigida contra o cancro

O cancro é a segunda causa de mortalidade a nível mundial. Um dos problemas nos tratamentos atuais de quimioterapia relaciona-se com os efeitos secundários causados pela falta de seletividade dos fármacos utilizados. Assim, um dos desafios atuais é o desenvolvimento de sistemas terapêuticos que permitam potenciar o efeito dos fármacos e diminuir os seus efeitos nocivos. Neste contexto, neste trabalho, foram sintetizados complexos de Fe, Co e Zn com fórmula geral [M(bipy-R)3]x+, a partir dos quais foi possível obter sistemas micelares formados in situ pela adição de um copolímero de PLA-b-PEG ou por introdução de macroligandos poliméricos anfifílicos. Os resultados mostram que as nanopartículas formadas apresentam tamanho e características adequadas para aplicações na terapia dirigida contra o cancro. Os resultados preliminares de citotoxicidade na linha tumoral humana da mama MDAMB231 indicam que todos os compostos estudados apresentam atividade citotóxica relevante, sendo os compostos micelares os mais promissores; Abstract: New micellar transition metals complexes for targeted therapy of cancer Cancer is the second leading cause of mortality worldwide. One problem in the current chemotherapy treatments is related to the severe side effects caused by the lack of selectivity of the drugs in clinical use. Thus, one of the current challenges is the development of new therapeutic systems that allow maximizing the effect of the drugs and reducing their harmful effects. In this context, several Fe, Co and Zn compounds of the general formula [M (bipy-R)3]x+ were synthesized in order to obtain micellar systems, either by in situ addition of a PLA-b-PEG copolymer or by introducing amphiphilic macroligands. The results show that the formed nanoparticles have size and characteristics suitable for applications in targeted therapy against cancer. Preliminary results of cytotoxicity in human breast cancer line MDAMB231 indicate that all the studied compounds show significant cytotoxic activity, being the micellar compounds the most promising agents.

Structural and chemical basis for anticancer activity of a series of 'beta'-tubulin ligands: molecular modeling and 3D QSAR studies

An important approach to cancer therapy is the design of small molecule modulators that interfere with microtubule dynamics through their specific binding to the ²-subunit of tubulin. In the present work, comparative molecular field analysis (CoMFA) studies were conducted on a series of discodermolide analogs with antimitotic properties. Significant correlation coefficients were obtained (CoMFA(i), q² =0.68, r²=0.94; CoMFA(ii), q² = 0.63, r²= 0.91), indicating the good internal and external consistency of the models generated using two independent structural alignment strategies. The models were externally validated employing a test set, and the predicted values were in good agreement with the experimental results. The final QSAR models and the 3D contour maps provided important insights into the chemical and structural basis involved in the molecular recognition process of this family of discodermolide analogs, and should be useful for the design of new specific ²-tubulin modulators with potent anticancer activity.

Família, saúde e doença: intervenção dirigida aos pais

A ideia de que a família é um elemento crucial na equação descritiva e explicativa dos processos de saúde e doença de cada pessoa é hoje bastante consensual. A família, como determinante fundamental dos processos de desenvolvimento, adaptação e perturbação do sujeito, é chamada a explicar a aquisição de hábitos e estilos de vida saudáveis e de risco, a exposição a comportamentos de risco e as estratégias de confronto com esses riscos, os processos de adoecer, de aceitação do diagnóstico e adaptação à doença crónica ou prolongada, de adesão aos tratamentos e de vivência da doença terminal. Mas a saúde e doença de cada pessoa também são chamadas a explicar os processos de adaptação e perturbação da família que constituem, ou de cada um dos seus membros. Finalmente a família é, ela mesma, enquanto entidade dinâmica, possível de caracterizar como mais ou menos saudável, sendo que a saúde da família afecta, necessariamente, a saúde actual e futura dos seus membros. Assim é quase unanimemente aceite que a família é um determinante importante dos processos de saúde e doença quer o sujeito ocupe as posições de filho, irmão ou pai/mãe, sendo que a família mais alargada tem sido, enquanto tal, pouco estudada. O conceito de família, na literatura da psicologia da saúde, não é alvo de grande discussão, sendo reconhecidas as múltiplas formas da mesma, e valorizada a sua importância nas diferentes fases da vida. A família é definida como um grupo composto por membros com obrigações mútuas que fornecem uns aos outros uma gama alargada de formas de apoio emocional e material. Caracteriza-se por ter uma estrutura, funções e papéis definidos, formas de interacção, recursos partilhados, um ciclo de vida, uma história comum, mas também um conjunto de indivíduos com histórias, experiências e expectativas individuais e únicas.

Relatório de estágio em terapia manual ortopédica

No âmbito de completar o mestrado em Fisioterapia, opção Terapia Manual Ortopédica (TMO), foi realizado um estágio com carácter profissionalizante de modo a aplicar e explorar as novas teorias e técnicas adquiridas na parte curricular do mestrado. O estágio decorreu na Clínica Fisiátrica Alto Minho, localizada em Arcos de Valdevez, vila do distrito de Viana do Castelo, onde residia uma população maioritariamente idosa e rural. Tendo em conta a idade avançada da população da clínica, os casos mais frequentes eram de processos degenerativos próprios da idade – artrose. De modo a aplicar as técnicas de terapia manual leccionadas, foram, em conjunto com a direcção da clínica, seleccionados os casos em que as mesmas técnicas poderiam ser aplicadas, nomeadamente, casos do foro neuro-músculo-esqueléticos. A TMO é uma abordagem terapêutica dirigida para pacientes neuromúsculo- esqueléticos, e engloba essencialmente técnicas manuais de mobilização e manipulação, e exercícios terapêuticos, com vista a gerir a dor e proporcionar a recuperação do paciente, incidindo também na prevenção (IFOMT 2004). Ao longo do mestrado foram então adquiridos conhecimentos teóricos dos mecanismos da dor e teórico/práticos de osteopatia; de tensão neural; do conceito de Mulligan; do conceito de estabilidade dinâmica, assim como de exercícios terapêuticos. Várias técnicas de todas estas vertentes foram possíveis de aplicar em estágio, seguindo-se os princípios de uma avaliação subjectiva e objectiva dirigida para a selecção da melhor técnica a aplicar ou da melhor conjugação de técnicas, englobando o paciente como um membro activo da sua recuperação, ou seja, pondo-o a par da sua situação clínica, dos objectivos de tratamento e das metas a atingir e colaborando quer na clínica, quer em casa. De modo a consolidar os conhecimentos adquiridos foi apresentado um estudo de caso de lombocitalgia, sintomatologia com grande prevalência e incidência na população portuguesa (Direcção-Geral da Saúde 2004), assim como serão de seguida expostas diferentes Fichas Clínicas dos casos abordados, demonstrando a metodologia utilizada em estágio. O objectivo específico neste relatório é demonstrar a eficácia da TMO em casos específicos e a importância de um tratamento activo, com colaboração do paciente, na recuperação do mesmo.

Novas linhas celulares humanas para produção de adenovírus com aplicação em terapia génica

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia