Transcription factor PROX1 modifies Wnt signaling in colon cancer

PR0X1 est un facteur de transcription très conservé au cours de l'évolution. PROX1 joue un rôle essentiel dans de nombreuses étapes de l'embryogenèse, telles que le développement du système lymphatique ou la migration des hépatocytes. Récemment, il a été démontré que PROX1 contribue à la progression des tumeurs colorectales, en tant que gène cible de la voie de signalisation Wnt. En utilisant des approches de co- immunoprécipitation et de ligature de proximité, nous avons trouvé que PROX1 fait également partie du complexe transcriptionnel TCF/ß-catenin, à la fois dans les cellules humaines de cancer du colon et dans les cellules murines de l'épithélium de l'intestin, dans lesquelles la voie de signalisation Wnt est activée. Dans le but de comprendre le mécanisme d'action de PROX1, nous avons analysé le génome des cellules cancéreuses de colon à la recherche des sites de fixation de PROX1, TCF4 et ß-catenin. Nous avons ainsi pu montrer que TCF4, ß-catenin et PROX1 se fixent simultanément sur une sous- population d'amplificateurs génomiques, sur lesquels PROX1 agit comme répresseur. Ces résultats suggèrent que, spécifiquement dans le cadre du cancer du colon, PROX1 agit en tant que modificateur de la voie de transduction du signal Wnt/ß-catenin. De plus, nous proposons que ceci constitue un des mécanismes par lesquels la signalisation durable de Wnt, qui est observée dans la majorité des cancers du colon, transforme le programme génétique des progéniteurs intestinaux, initialement normal, en output spécifique de ce type de cancers, ce qui contribue plus tard à la croissance infinie de la tumeur, à son caractère invasif et à sa dissémination.

Wnt-3a and Wnt-3 differently stimulate proliferation and neurogenesis of spinal neural precursors and promote neurite outgrowth by canonical signaling

Wnt factors regulate neural stem cell development and neuronal connectivity. Here we investigated whether Wnt-3a and Wnt-3, expressed in the developing spinal cord, regulate proliferation and the neuronal differentiation of spinal cord neural precursors (SCNP). Wnt-3a promoted a sustained increase of SCNP proliferation, whereas Wnt-3 enhanced SCNP proliferation transiently and increased neurogenesis through β-catenin signaling. Consistent with this, Wnt-3a and Wnt-3 differently regulate the expression of Cyclin-dependent kinase inhibitors. Furthermore, Wnt-3a and Wnt-3 stimulated neurite outgrowth in SCNP-derived neurons through ß-catenin and TCF4-dependent transcription. GSK-3ß inhibitors mimicked Wnt signaling and promoted neurite outgrowth in established cultures. We conclude that Wnt-3a and Wnt-3 signal through the canonical Wnt/β-catenin pathway to regulate different aspects of SCNP development. These findings may be of therapeutic interest for the treatment of neurodegenerative diseases and nerve injury.

Signalling by neurotrophins and hepatocyte growth factor regulates axon morphogenesis by differential β-catenin phosphorylation

Tyrosine phosphorylation of ß-catenin, a component of adhesion complexes and the Wnt pathway, affects cell adhesion, migration and gene transcription. By reducing ßcatenin availability using shRNA-mediated gene silencing or expression of intracellular N-cadherin, we show that ß-catenin is required for axon growth downstream of Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) and Hepatocyte Growth Factor (HGF) signalling. We demonstrate that receptor tyrosine kinases (RTK) Trk and Met interact with and phosphorylate ß-catenin. Neurotrophins (NT) stimulation of Trk receptors results in phosphorylation of ß-catenin at residue Y654 and increased axon growth and branching. Conversely, pharmacological inhibition of Trk or a Y654F mutant blocks these effects. ß-catenin phospho(P)-Y654 colocalizes with the cytoskeleton at growth cones. However, HGF that also increases axon growth and branching, induces ß-catenin phosphorylation at Y142 and a nuclear localization. Interestingly, dominant negative ΔN-TCF4 abolishes the effects of HGF in axon growth and branching, but not of NT. We conclude that NT and HGF signalling differentially phosphorylate ß-catenin, targeting ß-catenin to distinct compartments to regulate axon morphogenesis by TCF4-transcription-dependent and independent mechanisms. These results place ß-catenin downstream of growth factor/RTK signalling in axon differentiation.

Keratinocyte transcriptional regulation of the human c-Myc promoter occurs via a novel Lef/Tcf binding element distinct from neoplastic cells

The proto-oncogene c-Myc is involved in early neoplastic transformations. Two consensus Lef/Tcf binding elements (TBE) were found to be prerequisite for transcriptional transactivation by the armadillo proteins beta-catenin and plakoglobin (PG) together with Tcf4 in human neoplastic cells. In epidermal keratinocytes, c-Myc was reported to be repressed by Lef-1 and PG. Using reporter gene assays, here we demonstrate that deletion of the two consensus TBE fails to abrogate transcriptional regulation by Lef-1/PG in wildtype and beta-catenin-/- keratinocytes, while it reduces transcription in pre-neoplastic PG-/- keratinocytes. We identified a TBE sequence variant downstream of the major transcriptional initiation site that binds Lef-1 in vitro and in vivo, and its mutation compromised transcriptional regulation by Lef-1/PG. Collectively, this study demonstrates that the two consensus TBE's reported in neoplastic cells are dispensable for c-Myc regulation in normal keratinocytes, which instead use a novel TBE sequence variant. This unprecedented finding may have important implications for armadillo target genes involved in carcinogenesis.

Membrane-anchored Plakoglobins Have Multiple Mechanisms of Action in Wnt Signaling

In Wnt signaling, β-catenin and plakoglobin transduce signals to the nucleus through interactions with TCF-type transcription factors. However, when plakoglobin is artificially engineered to restrict it to the cytoplasm by fusion with the transmembrane domain of connexin (cnxPg), it efficiently induces a Wnt-like axis duplication phenotype in Xenopus. In Xenopus embryos, maternal XTCF3 normally represses ventral expression of the dorsalizing gene Siamois. Two models have been proposed to explain the Wnt-like activity of cnxPg: 1) that cnxPg inhibits the machinery involved in the turnover of cytosolic β-catenin, which then accumulates and inhibits maternal XTCF3, and 2) that cnxPg directly acts to inhibit XTCF3 activity. To distinguish between these models, we created a series of N-terminal deletion mutations of cnxPg and examined their ability to induce an ectopic axis in Xenopus, activate a TCF-responsive reporter (OT), stabilize β-catenin, and colocalize with components of the Wnt signaling pathway. cnxPg does not colocalize with the Wnt pathway component Dishevelled, but it does lead to the redistribution of APC and Axin, two proteins involved in the regulation of β-catenin turnover. Expression of cnxPg increases levels of cytosolic β-catenin; however, this effect does not completely explain its signaling activity. Although cnxPg and Wnt-1 stabilize β-catenin to similar extents, cnxPg activates OT to 10- to 20-fold higher levels than Wnt-1. Moreover, although LEF1 and TCF4 synergize with β-catenin and plakoglobin to activate OT, both suppress the signaling activity of cnxPg. In contrast, XTCF3 suppresses the signaling activity of both β-catenin and cnxPg. Both exogenous XLEF1 and XTCF3 are sequestered in the cytoplasm of Xenopus cells by cnxPg. Based on these data, we conclude that, in addition to its effects on β-catenin, cnxPg interacts with other components of the Wnt pathway, perhaps TCFs, and that these interactions contribute to its signaling activity.

Identification of candidate genes at the corticoseptal boundary during development

Cortical midline glia are critical to the formation of the corpus callosum during development. The glial wedge is a Population of midline glia that is located at the corticoseptal boundary and expresses repulsive/growth-inhibitory molecules that guide callosal axons as they cross the midline. The glial wedge are the first cells within the cortex to express GFAP and thus may express molecules specific for glial maturation. The corticoseptal boundary is a genetically defined boundary between the cingulate cortex (dorsal telencephalon) and the septum (ventral telencephalon). The correct dorso-ventral position of this boundary is vital to the formation of both the glial wedge and the corpus callosum. Our aim was to identify genes expressed specifically within the glial wedge that might be involved in either glial differentiation, formation of the corticoseptal boundary or development of the corpus callosum. To identify such genes we have performed a differential display PCR screen comparing RNA isolated from the glial wedge with RNA isolated from control tissues such as the neocortex and septum, of embryonic day 17 mouse brains. Using 200 different combinations of primers, we identified and cloned 67 distinct gene fragments. In situ hybridization analysis confirmed the differential expression of many of the genes, and showed that clones G24F3, G39F8 and transcription factor LZIP have specific expression patterns in the telencephalon of embryonic and postnatal brains. An RNase Protection Assay (RPA) revealed that the expression of G39F8, G24173 and LZIP increase markedly in the telencephalon at E16 and continue to be expressed until at least PO, during the period when the corpus callosum is forming. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

Function of the PDLIM2 protein in oncogenic Wnt signalling pathways

Aberrant regulation of the Wnt signalling pathway is a recurrent theme in cancer biology. Hyper activation due to oncogenic mutations and paracrine activity has been found in both colon cancer and breast cancer, and continues to evolve as a central mechanism in oncogenesis. PDLIM2, a cytoskeletal PDZ protein, is an IGF-1 regulated gene that is highly expressed in cancer cell lines derived from metastatic tumours. Suppression of PDLIM2 inhibits polarized cell migration, reverses the Epithelial to Mesenchymal transition (EMT) phenotype, suppresses the transcription of β-catenin target genes, and regulates gene expression of key transcription factors in EMT. This thesis investigates the mechanism by which PDLIM2 contributes to the maintenance of Wnt signalling in cancer cells. Here we show that PDLIM2 is a critical regulator of the Wnt pathway by regulating β-catenin at the adherens juctions, as also its transcriptional activity by the interaction of PDLIM2 with TCF4 at the nucleus. Evaluation of PDLIM2 in macrophages and co-culture studies with cancer cells and fibroblasts showed the influence exerted on PDLIM2 by paracrine cues. Thus, PDLIM2 integrates cytoskeleton signalling with gene expression by modulating the Wnt signalling pathway and reconciling microenvironmental cues with signals in epithelial cells. Negative correlation of mRNA and protein levels in the triple negative breast cancer cell BT549 suggests that PDLIM2 is part of a more complex mechanism that involves transcription and posttranslational modifications. GST pulldown studies and subsequent mass spectrometry analysis showed that PDLIM2 interacts with 300 proteins, with a high biological function in protein biosynthesis and Ubiquitin/proteasome pathways, including 13 E3 ligases. Overall, these data suggest that PDLIM2 has two distinct functions depending of its location. Located at the cytoplasm mediates cytoskeletal re-arrangements, whereas at the nucleus PDLIM2 acts as a signal transduction adaptor protein mediating transcription and ubiquitination of key transcription factors in cancer development.

The regulatory role of eNOS-derived nitric oxide on transcription in endothelial cells: Impact of S-nitrosylation on β-catenin signaling

Les cellules endothéliales forment une couche semi-perméable entre le sang et les organes. La prolifération, la migration et la polarisation des cellules endothéliales sont essentielles à la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, soit l’angiogenèse. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) peut activer la synthase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS) et induire la production de monoxyde d’azote (NO) nécessaire pour la régulation de la perméabilité vasculaire et l’angiogenèse. β- caténine est une composante essentielle du complexe des jonctions d’ancrage ainsi qu’un régulateur majeur de la voie de signalisation de Wnt/β-caténine dans laquelle elle se joint au facteur de transcription TCF/LEF et module l’expression de nombreux gènes, dont certains sont impliqués dans l’angiogenèse. La S-nitrosylation (SNO) est un mécanisme de régulation posttraductionnel des protéines par l’ajout d’un groupement nitroso au niveau de résidus cystéines. Le NO produit par eNOS peut induire la S-nitrosylation de la β−caténine au niveau des jonctions intercellulaires et moduler la perméabilité de l’endothélium. Il a d’ailleurs été montré que le NO peut contrôler l’expression génique par la transcription. Le but de cette thèse est d’établir le rôle du NO au sein de la transcription des cellules endothéliales, spécifiquement au niveau de l’activité de β-caténine. Le premier objectif était de déterminer si la SNO de la β-caténine affecte son activité transcriptionnelle. Nous avons montré que le NO inhibe l’activité transcriptionnelle de β- caténine ainsi que la prolifération des cellules endothéliales induites par l’activation de la voie Wnt/β-caténine. Il est intéressant de constater que le VEGF, qui induit la production de NO via eNOS, réprime l’expression de AXIN2 qui est un gène cible de Wnt s’exprimant suite à la i i stimulation par Wnt3a et ce, dépendamment de eNOS. Nous avons identifié que la cystéine 466 de la β-caténine est un résidu essentiel à la modulation répressive de son activité transcriptionnelle par le NO. Lorsqu’il est nitrosylé, ce résidu est responsable de la perturbation du complexe de transcription formé de β-caténine et TCF-4 ce qui inhibe la prolifération des cellules endothéliales induite par la stimulation par Wnt3a. Puisque le NO affecte la transcription, nous avons réalisé l’analyse du transcriptome afin d’obtenir une vue d’ensemble du rôle du NO dans l’activité transcriptionnelle des cellules endothéliales. L’analyse différentielle de l’expression des gènes de cellules endothéliales montre que la répression de eNOS par siRNA augmente l’expression de gènes impliqués au niveau de la polarisation tels que : PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 et TJ3. Cette analyse suggère que le NO peut réguler la polarisation des cellules et a permis d’identifier des gènes responsables de l’intégrité des cellules endothéliales et de la réponse immunitaire. De plus, l’analyse de voies de signalisation par KEGG montre que certains gènes modulés par l’ablation de eNOS sont enrichis dans de nombreuses voies de signalisation, notamment Ras et Notch qui sont importantes lors de la migration cellulaire et la différenciation des cellules de têtes et de tronc (tip/stalk). Le regroupement des gènes exprimés chez les cellules traitées au VEGF (déplétées de eNOS ou non) révèle que le NO peut affecter l’expression de gènes contribuant au processus angiogénique, dont l’attraction chimiotactique. Notre étude montre que le NO module la transcription des cellules endothéliales et régule l’expression des gènes impliqués dans l’angiogenèse et la fonction endothéliale.

The regulatory role of eNOS-derived nitric oxide on transcription in endothelial cells: Impact of S-nitrosylation on β-catenin signaling

Les cellules endothéliales forment une couche semi-perméable entre le sang et les organes. La prolifération, la migration et la polarisation des cellules endothéliales sont essentielles à la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, soit l’angiogenèse. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) peut activer la synthase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS) et induire la production de monoxyde d’azote (NO) nécessaire pour la régulation de la perméabilité vasculaire et l’angiogenèse. β- caténine est une composante essentielle du complexe des jonctions d’ancrage ainsi qu’un régulateur majeur de la voie de signalisation de Wnt/β-caténine dans laquelle elle se joint au facteur de transcription TCF/LEF et module l’expression de nombreux gènes, dont certains sont impliqués dans l’angiogenèse. La S-nitrosylation (SNO) est un mécanisme de régulation posttraductionnel des protéines par l’ajout d’un groupement nitroso au niveau de résidus cystéines. Le NO produit par eNOS peut induire la S-nitrosylation de la β−caténine au niveau des jonctions intercellulaires et moduler la perméabilité de l’endothélium. Il a d’ailleurs été montré que le NO peut contrôler l’expression génique par la transcription. Le but de cette thèse est d’établir le rôle du NO au sein de la transcription des cellules endothéliales, spécifiquement au niveau de l’activité de β-caténine. Le premier objectif était de déterminer si la SNO de la β-caténine affecte son activité transcriptionnelle. Nous avons montré que le NO inhibe l’activité transcriptionnelle de β- caténine ainsi que la prolifération des cellules endothéliales induites par l’activation de la voie Wnt/β-caténine. Il est intéressant de constater que le VEGF, qui induit la production de NO via eNOS, réprime l’expression de AXIN2 qui est un gène cible de Wnt s’exprimant suite à la i i stimulation par Wnt3a et ce, dépendamment de eNOS. Nous avons identifié que la cystéine 466 de la β-caténine est un résidu essentiel à la modulation répressive de son activité transcriptionnelle par le NO. Lorsqu’il est nitrosylé, ce résidu est responsable de la perturbation du complexe de transcription formé de β-caténine et TCF-4 ce qui inhibe la prolifération des cellules endothéliales induite par la stimulation par Wnt3a. Puisque le NO affecte la transcription, nous avons réalisé l’analyse du transcriptome afin d’obtenir une vue d’ensemble du rôle du NO dans l’activité transcriptionnelle des cellules endothéliales. L’analyse différentielle de l’expression des gènes de cellules endothéliales montre que la répression de eNOS par siRNA augmente l’expression de gènes impliqués au niveau de la polarisation tels que : PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 et TJ3. Cette analyse suggère que le NO peut réguler la polarisation des cellules et a permis d’identifier des gènes responsables de l’intégrité des cellules endothéliales et de la réponse immunitaire. De plus, l’analyse de voies de signalisation par KEGG montre que certains gènes modulés par l’ablation de eNOS sont enrichis dans de nombreuses voies de signalisation, notamment Ras et Notch qui sont importantes lors de la migration cellulaire et la différenciation des cellules de têtes et de tronc (tip/stalk). Le regroupement des gènes exprimés chez les cellules traitées au VEGF (déplétées de eNOS ou non) révèle que le NO peut affecter l’expression de gènes contribuant au processus angiogénique, dont l’attraction chimiotactique. Notre étude montre que le NO module la transcription des cellules endothéliales et régule l’expression des gènes impliqués dans l’angiogenèse et la fonction endothéliale.