太行花属（Taihangia Yu et Li）种质资源的研究

本文报道了太行花属（Taihangia Yu et Li）的种群分布、生物学特性和离体培养的初步结果。 太行花种群由于环境和生物等方面的原因仅在太行山区有狭小分布。来源于不同地区种群的太行花其形态特征具有丰富的表型，在引种条件下更为显著。而酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶分析进一步证实了其遗传的稳定性和同源性。 实验表明，太行花在北纬39°58'，最低温度-11℃的北京北京植物园，露地越冬正常。温度提高至40℃时生长发育受抑制而迟滞，以25℃最为适宜，增殖率最高。太行花对土壤的适应范围较广，在泥炭培养土上移殖的幼苗成活率达97.20%，主根须根发达，叶生长良好。不同强度光照处理12000Lux效果最好。 太行花生育期为230多天，生长积温为3763℃左右。物候期受环境条件和当年气候的影响，不同种群和个体之间有一定的差异。花的性别、花期和开花量等与纬度、海拔主要与温湿度相关。 太行花的茎尖、花芽、花梗、萼片、花瓣和叶子等外植体均能在MS附加不同种类和浓度植物激素的培养基中分化，其分化途径和分化效果因附加成分、外植体类别而异。在含有0.1mg/L IAA和0.5mg/L 6-BA的培养基中，不但能启动花芽正常生长、开花、形成合子胚，而且也能诱导花芽、花梗、茎尖产生花芽和营养芽。在芽的继代培养中，细胞分裂素能大量诱导芽的分化，最好的配比是0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L ZJ;只含生长素时可以诱导生根或脱分化，其中生根最好的是0.5mg/L IAA;2.4-D单独使用时，能较好地使花芽、叶等脱分化，其最佳浓度为1.0mg/L。

稀有植物太行花的保护生物学研究

悬崖代表着一个残遗的、较少受到干扰的古生境，悬崖也是生物多样性的避难所。这个特殊生境中分布种类丰富的稀有植物和特有植物，而这些稀有和特有植物又往往以悬崖为唯一的生境，在长期的演化历史进程中形成彼此相互适应的关系。这种分布在特殊生境中的稀有植物为保护研究提出了新的研究方向和问题。本文以蔷薇科的中国特有植物太行花（Taihangia rupestris Yü et Li）为对象，对这个仅分布在有限的地理范围内悬崖上的稀有物种进行了保护生物学的研究。 利用RAPD分子标记技术对太行花8个居群的遗传多样性和遗传结构进行了检测分析。结果表明太行花居群内维持着较高的遗传多样性水平，未显示遭受过严重遗传瓶颈的迹象。同时，居群间遗传分化显著，与居群间的地理距离相关，聚类分析得到的树系图与太行花种下两个变种（太行花原变种Taihangia rupestris var. rupestris和缘毛太行花Taihangia rupestris var. ciliate Yü et Li）的划分相符。 通过栽培实验，研究了太行花对光照和养分的反应，从生态学角度检测植物对环境因子变化的适应能力。结果表明光照处理显著影响太行花的气体交换参数，且显示出随季节不同而变化的趋势。在8月第一次测量时，光合速率随着光照水平的增加而增加;而在9月底第二次测量时，高光下植株的光合速率反低于中光条件下的植株。光合光反应曲线表明太行花对不同光照水平（高光、中光和低光）均显示出一定的光合适应性。 光照对太行花的生长反应、形态、解剖等指标均具有显著的作用。在收获时，高光下植物形成小而厚的叶片，更快的叶片形成速率足以弥补单叶面积上光合速率的下降，使植株维持最大的总生物量。中光条件下的植株具有更长的叶柄，更大的叶面积，大而薄的叶片，和更大的叶面积比，被认为是对较弱光照环境适应的表现。而光照对叶片的气孔指标（气孔密度、气孔指数和大小）没有作用，养分施加对太行花的影响也甚微。总体来说，太行花显示出对光照变化的生理适应性和形态可塑性，光照和养分这两个环境条件均非影响太行花局限分布的关键因素。 同时，我们采用扫描电镜手段跟踪观察了太行花的花的早期发育过程。太行花早期发育过程中苞片内残留的退化花痕迹表明，太行花的顶生单花其实是有限聚伞花序中其它花芽败育的结果，显示出从花序向单花演化的趋势。同时，雌蕊的发育在早期是正常的，未显示出退化痕迹。 根据以上结果表明，局限分布在特殊生境上的太行花并未显示出生理适应幅度的狭窄性和遗传多样性水平的降低，因此，太行花在长期的进化过程中形成了对特殊生境——悬崖的适应性，遗传衰退和缺乏适应性不是稀有植物太行花局限分布的原因。在对太行花的保护中应进一步加强对其生境的保护，并在进行迁地保护和回归引种时应兼顾不同变种和地理分布的居群，以实现对其遗传完整性的有效保护。

太行花某些生殖生物学特性的研究

本文通过原产地生境分析、有性生殖和无性生殖调查以及胚胎学研究等，研究了太行花的生殖生物学特性。 太行花分布在太行山东缘，其分布特点为：1、在海拔600-1500米之间，呈间断、零星、条带状分布。 2、主要生长在阴坡裸露崖壁的缝穴中。它的生境条件十分恶劣，气候季节性变化明显，夏季炎热多雨，冬季干燥寒冷;着生太行花的崖缝中只含极少土壤，保水性极差，有机质贫乏，含钙极高。太行花群落植物种类稀少，在调查的三个样地中仅有15个种，分属于9个科、11个属。 生殖途径调查表明：太行花具完整的两性花和单性雄花，两性花能发育成熟最终形成种子，萌发产生新植株，进行有性生殖;由于原产地恶劣的生境条件，有性生殖能力很弱。太行花还通过分蘖茎来进行无性生殖。分蘖茎产生于茎基部，当它出叶成苗并在顶芽基部上产生根后，与母株断开形成新植株。在原产地太行花种群的扩大和繁衍主要依靠无性生殖途径。 通过细胞学的研究，太行花具如下胚胎学特性：花药具有四个小孢子囊;孢原为单列细胞;花药壁由表皮、药室内壁、中层和绒毡层组成，药壁发育为基本型;减数分裂中胞质分裂为同时型;小孢子四分体是四面体;两细胞成熟花粉。胚珠倒生，单珠被，厚珠心;大孢子四分体线状排列;合点端单孢子发育形成8核蓼型胚囊;珠孔端受精;初生胚乳核先于合子分裂，核型胚乳，紫菀型胚;聚合瘦果，成熟时腹缝半裂。在这些特性中瘦果腹缝半裂是蓇葖果演变为瘦果的过渡类型特征。 太行花生殖生物学特性研究证明，虽然太行花正处于濒危状态中，但有性生殖和无性生殖的功能并未丧失，特别是大小孢子的发生和发育、受精和胚胎发生都具有正常的细胞学过程。因此，原产地太行花濒危的原因被认为是由于生殖过程所必需的条件不能满足的结果，也就是说特殊的生境阻碍了有性生殖和无性生殖的过程，从而导致个体数量减少和群体停止扩展。为了防止太行花灭绝，将它迁移到另一个适合于它繁殖的地方去，可能是合理的。

太行花化学成分及生物活性的研究

本文对蔷薇科太行花属太行花（Taihangia rupestris Yu et Li）全株的化学成分及乙醇提取物部分的药理活性进行了研究，分离得到五个化合物并确定了结构：β一谷甾醇(I)、熊果酸(II)、2α，3β一二羟基一熊果酸(III)、没食子酸(Ⅳ)、2α，3β，23-三羟基．齐墩果-12-烯-28-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯甙(V)。它们均是首次从该植物中获得。用DPPH法以BHT和迷迭香为对照测定了太行花抗氧化活性。结果显示太行花抗氧化活性优于迷迭香。利用HPLC对抗氧化活性成分没食子酸的含量进行了测定。体外抑菌实验表明太行花具有一定的体外抑菌活性，特别是对结核分枝杆菌的临床菌株表现出相当强的抑制生长活性。

MADS-box基因在水稻和太行花中的相关研究& SAGE 在水稻上应用的生物信息学分析

本论文主要涉及两部分内容：第一部分是水稻和太行花中MADS-box基因的相关研究，第二部分是水稻中SAGE技术的生物信息学分析。 MADS-box基因家族在花发育过程中起着重要的作用。水稻是单子叶植物的模式植物，其基因组序列的公布为在基因组水平上鉴定MADS-box基因提供了条件。根据已发表的水稻MADS-box基因序列，利用关键词搜索、HMMER分析、同源比较、系统进化树分析等手段，对GeneBank和TIGR水稻基因组注释中所有已知和未知的水稻MADS-box基因进行了分析。结果表明，水稻中有64个MADS-box基因编码不同氨基酸，其中已知cDNA序列的为43个。在64个基因中，有23个属于ABCDE类基因，并且其cDNA序列已知，其中的10个已有功能方面的研究。通过3’-RACE和筛选水稻花器官的cDNA文库，得到了一个A类基因片断（A5B2），两个E类基因片断（MW1，MW2）。这三个基因分别与OsMADS14，OsMADS7和OsMADS5相似或相同。禾本科植物花器官的起源，尤其是内外稃的起源仍存在疑问，A功能基因是否以及如何参与其形成成为问题的关键。初步原位杂交分析表明，OsMADS14在花发育的早期开始表达。在小穗原基发育过程中，OsMADS14在内外稃原基中有较强的表达。随着小穗的发育，OsMADS14在整个花序中都有表达。在小穗发育的后期，OsMADS14在胚珠中有较强的表达。OsMADS14的表达模式与FUL类基因一致，并且证明了其在花发育的后期仍然表达强烈，暗示其可能与胚珠发育有重要关系。 SEPALLATA基因被认为是花的特异因子，参与了花的四轮花器官的决定过程。在本文中，通过3’-，5’-RACE，从太行花花芽中克隆了一个MADS-box基因。该基因推导的的氨基酸序列含有典型的M，I，K和C四个结构域，与FBP2和SEP3的相似性较高，系统进化树分析表明该基因属于SEP3亚家族，于是将其命名为TrSEP3。TrSEP3首先在花分生组织中表达，然后在雌雄蕊原基及花瓣中表达;在成熟花中，TrSEP3仅在花瓣和雌蕊中表达。这种表达模式与其它的SEP-like基因有稍不同。TrSEP3拟南芥中过量表达后并未导致表型的改变，暗示其功能与拟南芥的SEP基因可能存在差异。选择压力分析显示TrSEP3受到了不显著的负选择压力。这些结果暗示TrSEP3的功能可能与其它的SEP-like基因有差别，值得进一步研究。 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)是对比样品间转录谱的差异、发现新基因的有效的方法。tag mapping是将SAGE-tag与其转录本匹配的过程，其效率直接影响对转录谱的解释，该过程受多种因素影响。目前，对水稻tag mapping过程缺少详细研究，导致其效率不高。为了确定参考数据库和其它合适的条件，我们利用EST序列和基因组序列构建了不同的参考图谱，从全长cDNA数据库中提取虚拟的SAGE-tag，研究了参考图谱、锚定酶、tag长度以及匹配方法对tag mapping效率的影响，并比较了tag mapping的准确率。结果表明，用EST序列构建的参考图谱能够匹配大多数的SAGE-tag，并具有较高的准确率;利用迭代的方法，可以充分利用基因组序列。各种锚定酶之间的差别不明显，其中NlaIII， HpyCH4V 和 AluI 表现较好;17bp的tag比较适合水稻;而用双锚定酶和17bp的tag则可以显著提高tag mapping的效率和准确率。

太行花MADS-box基因克隆、表达模式及功能分析

基因的重复（duplication）及其功能的多样性（diversification）为生物体新的形态进化提供了原材料。重复的基因通过表达方式和（或）编码序列的改变而导致其亚功能化（subfunctionalization）和（或）新功能化（neofunctionalization），从而使这些重复基因有可能保留在生物体中，增添生物的遗传稳定性（robustness）和多样性。MADS-box基因在植物（特别是在被子植物）的进化过程中发生了大量的基因重复事件而形成一个多基因家族。MADS-box基因家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用，在调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征，以及调控根、叶、胚珠及果实的发育中起着广泛的作用。开展对MADS-box基因家族成员的序列结构、表达模式及编码蛋白的功能研究可以为这些同源基因在生物体中的可能命运提供很好的实验依据。本研究以我国特有的蔷薇科物种太行花做实验材料，通过3’ RACE和5’ RACE方法从太行花中克隆了7个MADS-box家族的基因。序列和系统进化树分析表明这7个基因分别与拟南芥的MADS-box基因AG、SHP（SHP1/2）、PI、AP1、FUL和SEP1以及与矮牵牛MADS-box基因PhTM6具有很高的同源性并聚为一支，从而将这7个MADS-box基因分别命名为TrAG（Taihangia rupestris AG）、TrSHP（Taihangia rupestris SHP）、TrPI（Taihangia rupestris PI）、TrAP1（Taihangia rupestris AP1）、TrFUL（Taihangia rupestris FUL）、TrSEP1（Taihangia rupestris SEP1）和TrTM6（Taihangia rupestris PhTM6）。针对克隆的这些基因，具体进行了以下几方面的研究： 第一，对TrAG和TrSHP两个MADS-box基因进行了研究，它们分别属于AG亚家族中旁系同源进化系euAG和PLE进化系的成员。通过原位杂交的方法分析了旁系同源基因TrAG和TrSHP的表达方式是否发生了分化;构建组成型表达载体转化野生型拟南芥，分析了TrAG和TrSHP的编码蛋白的功能是否发生了改变;并进一步通过酵母双杂交的方法比较了TrAG和TrSHP的相互作用方式是否发生了分化。原位杂交分析表明，TrAG和TrSHP主要在雄蕊、心皮和胚珠中表达。在花发育过程中，TrAG起始表达比TrSHP早，在随后将形成雄蕊和心皮原基的分生组织区域以及雄蕊原基中表达;然而直到雄蕊原基出现前未检测到TrSHP的表达。在雄蕊原基形成之后，TrAG和TrSHP在发育的雄蕊、随后将产生心皮原基的分生组织区域以及心皮原基中表达。在花发育的晚期，TrAG在发育的柱头、花柱以及胚珠中均有表达，而TrSHP仅在胚珠中表达。35S::TrAG和35S::TrSHP转基因拟南芥植株表现出相似的表型，包括开花提前;莲座叶和茎生叶向腹卷曲、变小;花芽在时期13前即开放，萼片包裹不住花芽;萼片和花瓣分别被同源异型转化为心皮化和雄蕊化器官，并在萼片向腹面产生异位的胚珠;在茎生叶上产生柱头化的乳突和胚珠;子房弯曲;果实提前沿着开裂区裂开，暴露出胚珠。此外，也观察到35S::TrAG和35S::TrSHP转基因拟南芥植株的一些表型差异，35S::TrAG转基因拟南芥植株花芽呈暗绿色，而35S::TrSHP转基因拟南芥植株花芽呈黄绿色;不同与35S::TrAG转基因植株表型的是，35S::TrSHP转基因拟南芥植株花被脱落受到了抑制，偶尔可以观察到花丝基部融合，果实变短、育性降低。酵母双杂交分析表明TrAG可以与TrSEP3相互作用，而TrSHP不能与TrSEP3形成异源二聚体。以上研究结果表明做为旁系同源基因，TrAG和TrSHP在表达方式上发生了改变，在蛋白编码序列上保持了其祖先的功能，但是编码序列的一些差异还是导致它们之间生化作用方式的不同和一定程度上的亚功能化。基于以上研究结果并结合先前报道的在拟南芥、金鱼草和矮牵牛等物种中旁系同源基因的表达和功能数据，我们提出在不同物种中旁系同源基因在进化过程中维持部分功能冗余（redundant），但是也通过改变表达方式、编码蛋白的功能及蛋白相互作用方式呈现出不同形式的亚功能化和（或）新功能化。 第二，对TrPI基因的功能也进行了初步研究，它属于AP3/PI亚家族PI-like进化系的成员。原位杂交结果表明，TrPI主要在花瓣、雄蕊和胚珠中表达。显示出TrPI与拟南芥同源基因PI保守的表达模式。35S::TrPI转基因拟南芥植株莲座叶发生延迟、变小、并且第一至第三片莲座叶呈白色针状;莲座叶和茎生叶并不像野生型呈有规则的螺旋状排列;花序茎基部、中间或顶端发生2-3个分支;在茎生叶的叶腋内的花序抽出时间明显晚于野生型，并且很小甚至不能完全抽出而藏在叶腋内。低温条件下转基因植株莲座叶的表型更加明显，表现为莲座叶变为针状，无叶片，仅有叶柄结构。这明显不同于35S::PI转基因拟南芥植株的表型。此外，酵母双杂交分析表明TrPI自身可以形成同源二聚体。这种相互作用方式也不同与拟南芥中PI的相互作用方式。以上研究结果表明，TrPI可能与拟南芥PI具有保守的表达模式但编码的蛋白可能获得了新的功能。 第三，构建了一个AP1-like基因（TrAP1）的过量表达载体，转化野生型拟南芥植株，通过反向遗传学分析了TrAP1的功能。35S::TrAP1转基因拟南芥植株开花提前;花序以两朵花终止，形成terminal flower的表型;偶尔可以观察到雄蕊转化为花瓣化的器官;莲座叶呈黄绿色并且其边缘呈锯齿状。酵母双杂交分析表明TrAP1蛋白自身可以形成同源二聚体。这些结果表明TrAP1可能与拟南芥同源基因AP1具有保守的功能。

太行花TrMADS3基因的结构、功能和进化研究

休眠是温带多年生植物的特性之一。为了适应温带地区寒冷的冬季，多年生植物的分生组织通常在秋末冬初进入休眠状态，这样有利于它们在低温下的存活。因此，温带多年生植物的生长和开花具有季节性。植物的生长发育需要与季节的交替变化同步，才能适应环境，保证繁殖成功。多年生植物通过“生长－休眠－生长”的循环过程适应温带地区寒冷的冬季。休眠既有利于植物存活又可调节开花时间。因此，探索温带多年生植物休眠过程的分子调控机理具有重要的应用价值。 太行花（Taihangia rupestris）是蔷薇科仙女木族的一种多年生草本。它生长在海拔1000到1200米的温带山区。太行花需要两个生长季节才能开花，这一点与模式植物拟南芥、水稻不同。在第一个生长季节花芽诱导，花序发育到秋末冬初时进入休眠状态;过冬花序包裹在叶柄基部，接近土壤表面;到了第二个生长季节，花进一步发育完全，开花结果。休眠过程对太行花花序的存活以及来年的开花时间控制非常关键，对这个过程的调控基因的研究不仅有助于理解太行花休眠的分子机制，还将为其它经济植物在这个方面的研究提供资料。 本研究以太行花为研究材料，从它的过冬花序中分离得到了一个MADS-box基因，分析了它的序列结构、系统发育关系、表达式样和功能，探讨了FLC亚家族基因在太行花这种多年生植物和一年生、两年生植物之间发生的表达功能分化。主要研究结果包括： 1. 从太行花的过冬花序中分离出了TrMADS3基因。氨基酸序列分析结果表明它是MIKCc型MADS-box基因，系统发育分析结果表明TrMADS3与FLC类基因聚在一起。 2. 实时定量PCR和RT-PCR实验显示TrMADS3在冬季休眠期太行花的花序、根、叶中广泛表达。从十月底到一月底的冬季低温期户外太行花植株中TrMADS3表达量比同期温室植株的表达量高，也比夏季户外植株的表达量高。对温室植株进行低温处理能明显上调TrMADS3的表达量，而短光照、干旱、高盐和脱落酸（ABA）处理对TrMADS3的表达影响不明显。 3. 用原位杂交的方法分析了TrMADS3的表达式样。营养器官中，TrMADS3在营养顶端分生组织、叶原基、幼叶边缘细胞中表达量高;生殖器官中，TrMADS3在侧生分生组织、花序原基、花原基、幼苞片、萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基、心皮原基、发育中的雄蕊、心皮中表达量高。TrMADS3的表达模式反映了TrMADS3调控营养生长和不同阶段的花序、花发育过程。 4. TrMADS3在拟南芥中异位表达不影响拟南芥开花时间。在高盐和干旱胁迫条件下，TrMADS3异位表达能够明显提高转基因拟南芥后熟种子的萌发率。 5. 建立了太行花的组培体系。 综上所述，TrMADS3属于FLC进化支，这一亚家族基因还未在多年生植物中报道。TrMADS3在太行花休眠期表达量很高。在实验控制条件下，一至两周低温能够明显促进TrMADS3表达量的上调。低温处理后回到生长温度的太行花在一月内依然保持较高的TrMADS3的表达。原位杂交实验显示TrMADS3在营养和生殖分生组织中表达量高。TrMADS3在拟南芥中异位表达促进后熟种子在高盐和干旱胁迫下萌发。因此，我们推测TrMADS3具有响应低温调节太行花休眠期营养和生殖分生组织活性的功能。在一、二年生植物中分离的FLC-like基因响应春化作用，具有抑制花芽诱导的保守功能，这些基因在营养器官中表达，受春化作用调节，对应一、二年生植物的成花诱导受春化作用促进的过程，但TrMADS3在太行花营养和生殖器官中均表达，对应太行花花芽诱导后营养和生殖器官均进入休眠状态的生理特性，因此，我们推测FLC-like基因有可能在太行花这种温带多年生植物和一、二年生植物之间发生功能分化。