Antioxidant response of Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 cells to cadmium and nickel stress

Plant cell cultures are a suitable model system for investigation of the physiological mechanisms of tolerance to environmental stress. We have determined the effects of Cd (0.1 and 0.2 mM CdCl(2)) and Ni (0.075 and 0.75 mM NiCl(2)) on Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow (TBY-2) cell suspension cultures over a 72-h period. Inhibition of growth, loss of cell viability and lipid peroxidation occurred, in general, only when the TBY-2 cells were grown at 0.2 mM CdCl(2) and at 0.75 mM NiCl(2). At 0.1 mM CdCl(2), a significant increase in growth was determined at the end of the experiment. Increases in the activities of all of the four enzymatic antioxidant defence systems tested, were induced by the two concentrations of Cd and Ni, but at different times during the period of metal exposure. Overall, the cellular antioxidant responses to Cd and Ni were similar and were apparently sufficient to avoid oxidative stress at the lower concentrations of Cd and Ni. The activities of glutathione reductase and glutathione S-transferase increased early but transiently, whereas the activities of catalase and guaiacol peroxidase increased in the latter half of the experimental period. Therefore it is likely that the metabolism of reduced glutathione was enhanced during the initial onset of the stress, while catalase and guaiacol-type peroxidase appeared to play a more important role in the antioxidant response once the stress became severe.

Analysis of the Nicotiana tabacum Stigma/Style Transcriptome Reveals Gene Expression Differences between Wet and Dry Stigma Species

The success of plant reproduction depends on pollen-pistil interactions occurring at the stigma/style. These interactions vary depending on the stigma type: wet or dry. Tobacco (Nicotiana tabacum) represents a model of wet stigma, and its stigmas/styles express genes to accomplish the appropriate functions. For a large-scale study of gene expression during tobacco pistil development and preparation for pollination, we generated 11,216 high-quality expressed sequence tags (ESTs) from stigmas/styles and created the TOBEST database. These ESTs were assembled in 6,177 clusters, from which 52.1% are pistil transcripts/genes of unknown function. The 21 clusters with the highest number of ESTs (putative higher expression levels) correspond to genes associated with defense mechanisms or pollen-pistil interactions. The database analysis unraveled tobacco sequences homologous to the Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) genes involved in specifying pistil identity or determining normal pistil morphology and function. Additionally, 782 independent clusters were examined by macroarray, revealing 46 stigma/style preferentially expressed genes. Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction experiments validated the pistil-preferential expression for nine out of 10 genes tested. A search for these 46 genes in the Arabidopsis pistil data sets demonstrated that only 11 sequences, with putative equivalent molecular functions, are expressed in this dry stigma species. The reverse search for the Arabidopsis pistil genes in the TOBEST exposed a partial overlap between these dry and wet stigma transcriptomes. The TOBEST represents the most extensive survey of gene expression in the stigmas/styles of wet stigma plants, and our results indicate that wet and dry stigmas/styles express common as well as distinct genes in preparation for the pollination process.

Influência do butralin como anti-brotante em cultura de fumo (Nicotiana tabacum L. cv. 'Goiano')

Com a finalidade de se evitar a operação de desbrota manual em plantas de fumo (Nicotiana tabacum L.), controlando a brotação axilar, conduziu-se um experimento, em Piracicaba (SP), em condições de campo, utilizando-se um inibidor de brotação, o 4-(1,1-dimetiletil)-N-(1-metilpropil)-2,6-dinitrobenzenamina (butralin), nas concentrações de 1, 2 e 3% do produto comercial, na dose de 20 ml da emulsão por planta, aplicada logo após a retirada da inflorescência principal, na extremidade superior da haste atingindo as gemas axilares uniformemente. Os resultados mostram que o butralin, nas concentrações utilizadas, em comparação com o controle, promove a inibiçao no desenvolvimento dos meristemas das gemas axilares, sem afetar o desenvolvimento das folhas. A concentração de 2% do produto comercial, foi a que proporcionou maior peso de matéria seca de folhas e menor de matéria seca de brotos. Os resultados mostram que o butralin, nas concentrações utilizadas, em comparação com o controle, promove a inibiçao no desen volvimento dos meristemas das gemas axila-res, sem afetar o desenvolvimento das folhas. A concentração de 2% do produto comercial, foi a que proporcionou maior peso de materia seca de folhas e menor de materia seca de brotos.

Deficiências de macronutrientes e de boro em Nicotiana tabacum L. var. goianinho

Com os objetivos de determinar: 1) O quadro sintomatológico das carências dos macronutrientes e de boro; 2) Concentração dos macronutrientes e de boro nas folhas novas, velhas e no caule na presença e ausência dos nutrientes. Foi instalado em ensaio em solução nutritiva tendo como sílica o substrato. Os tratamentos constaram da omissão de N, P, K, Ca, Mg, S, B, e presença de todos os nutrientes. Acompanhou-se o desenvolvimento dos sintomas e uma vez evidenciados coletou-se as plantas que foram analisadas para os elementos em estudo. Verificou-se que: 1) Houve efeito na produção de matéria seca influência pela omissão de N, P, K, Ca e Mg; 2) Os sintomas visuais de deficiência são bem definidos e de fácil caracterização para todos os nutrientes; 3) Os níveis de deficiência adequado, obtidos nas folhas foram: N% 1,23-3,06; P% 0,04-0,11; K% 1,15-3,25; Ca% 0,20-0,59; Mg% 1,13-1,25, S% 0,16-0,20; B ppm 34-59.

Fauna epigeica em sistemas de produção de Nicotiana tabacum L.

O Rio Grande do Sul detém grande relevância na produção de tabaco. Adotam-se três sistemas de manejo: convencional, mínimo e plantio direto. Para analisar o impacto desses sistemas sobre a população da fauna do solo, efetuou-se uma amostragem da fauna epigeica. Foram avaliados preparo convencional (PC), cultivo mínimo (CM) e plantio direto (PD), além de área de reconversão da fumicultura para a vitivinicultura (RV) e de mata nativa (MN). Na amostragem, foram utilizadas dez armadilhas Provid em cada área. Os atributos avaliados foram: abundância de organismos, riqueza, índice de diversidade (H') e equitabilidade de Shannon (J). Collembola (Arthropoda: Hexapoda) foi identificada até o nível de família, devido à sua sensibilidade às modificações do ambiente. Efetuaram-se a análise multivariada de Agrupamento Hierárquico e a Análise de Componentes Principais, e os índices H' e J foram comparados pelo teste t, de Student. O PD apresentou maior número total de organismos, isolando-se das demais áreas pela análise de agrupamento hierárquico. Os valores de riqueza foram muito semelhantes entre as áreas, destacando-se a aproximação entre RV e MN. Os tratamentos PC, PD e RV não diferiram estatisticamente quanto ao H', apresentando valores de 1,58; 1,60; e 1,52, respectivamente. CM apresentou menor valor de H' (1,18) e MN, o valor intermediário (1,33). O comportamento estatístico de J foi muito semelhante ao encontrado em H'. Em relação à Classe Collembola, foram identificadas as famílias Entomobrydae, Sminthuridae, Poduridae e Hipogasturidae. PD apresentou exemplares das quatro famílias identificadas, enquanto nas demais áreas foram identificadas apenas Entomobrydae e Sminthuridae. Pela Análise de Componentes Principais (PCA), as diferenças entre as áreas explicaram 32 % da variabilidade encontrada; desse percentual, 59,3 % foram explicados pelos eixos 1 e 2. A presença ou ausência de revolvimento do solo e a rotação com culturas de cobertura foram os fatores que mais influenciaram as populações de fauna epigeica.

Efeitos de butralin sobre a brotação axilar na cultura de fumo (Nicotiana tabacum L.)

Com o objetivo de controlar a brotação axilar em plantas de fumo e verificar sua influência na produção e característica das folhas, foram estudados, em condições de campo, os efeitos da desbrota manual e de butralin [4-(1,1- dimetiletil) - N - (1 - metilpropil) - 2,6 - dinitrobenzenamina], aplicado diretamente nas gemas axilares ou na extremidade superior da haste em plantas que tiveram removida a inflorescência principal. Os tratamentos com butralin, independente da maneira de aplicação, proporcionaram completa inibição do crescimento dos brotos axilares, enquanto que a desbrota manual reduziu em 45% a matéria seca de brotos em relação à testemunha não desbrotada. Tanto as plantas tratadas com butralin, como as que foram desbrotadas manualmente, não diferiram entre si, quanto ao peso de matéria fresca e seca de folhas, área foliar especifica e Índice de Área Foliar, porém aumentaram significativamente esses parâmetros em relação ao controle.

Comparative uptake and metabolism of 2-[14C]-2,4-dichlorophenoxyacetic acid in callus cultures of monocot (Dioscorea spp.) and dicot (Nicotiana tabacum L.) plants

(Comparative uptake and metabolism of 2-[14C]-2,4-dichlorophenoxyacetic acid in callus cultures of monocot (Dioscorea spp.) and dicot (Nicotiana tabacum L.) plants). The uptake and metabolism of 2-[14C]-2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) were investigated in leaf calluses of Nicotiana tabacum, tuber calluses of Dioscorea opposita and calluses derived from zygotic embryos, leaves and petioles of Dioscorea composita. Striking similarities were evident in the patterns of 2,4-D metabolites and their chemical characteristics in the three callus types of D. composita compared, but significant differences were detected among the patterns of rnetabolites in the three species studied. Preliminary investigations on the stability of various metabolites (separated using TLC) by hydrolysis showed that sugar esters appeared to be the major metabolites in tobacco whilst in yams (D. opposita) glycosides were shown to be the main ones, which indicated a similarity between plants of Gramineae and Dioscoreaceae in terms of 2,4-D metabolism. Release of 2,4-D from tobacco callus cells upon their transfer to 2,4-D-free medium was detected and the implications of this are discussed in relation to the cultural conditions necessary to induce morphogenesis in vitro.

A heterologous expression system for bovine lens transmembrane main intrinsic protein (MIP) in Nicotiana tabacum plants

We have developed a heterologous expression system for transmembrane lens main intrinsic protein (MIP) in Nicotiana tabacum plant tissue. A native bovine MIP26 amplicon was subcloned into an expression cassette under the control of a constitutive Cauliflower Mosaic Virus promoter, also containing a neomycin phosphotransferase operon. This cassette was transformed into Agrobacterium tumefaciens by triparental mating and used to infect plant tissue grown in culture. Recombinant plants were selected by their ability to grow and root on kanamycin-containing media. The presence of MIP in the plant tissues was confirmed by PCR, RT-PCR and immunohistochemistry. A number of benefits of this system for the study of MIP will be discussed, and also its application as a tool for the study of heterologously expressed proteins in general.

Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Analysis of the Nicotiana tabacum Stigma/Style Transcriptome Reveals Gene Expression Differences between Wet and Dry Stigma Species

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Nicotiana tabacum as an experimental host for the study of plant-Xylella fastidiosa interactions

Xylella fastidiosa causes citrus variegated chlorosis (CVC). Information generated from the X. fastidiosa genome project is being used to study the underlying mechanisms responsible for pathogenicity. However, the lack of an experimental host other than citrus to study plant-X. fastidiosa interaction has been an obstacle to accelerated progress in this area. We present here results of three experiments that demonstrated that tobacco could be an important experimental host for X. fastidiosa. All tobacco plants inoculated with a citrus strain of X. fastidiosa expressed unequivocal symptoms, consisting of orange leaf lesions, approximately 2 months after injection of the pathogen. CVC symptoms were observed in citrus 3 to 6 months after inoculation. The pathogen was readily detected in symptomatic tobacco plants by polymerase chain reaction (PCR) and phase contrast microscopy. In addition, X. fastidiosa was reisolated on agar plates in 4 of 10 plants. Scanning electron microscopy analysis of cross sections of stems and petioles revealed the presence of rod shaped bacteria restricted to the xylem of inoculated plants. The cell size was within the limit typical of X. fastidiosa.

Overexpression of mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1) induces a hypoxic response in Nicotiana tabacum leaves

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Relationship between ozone, meteorological conditions, gas exchange and leaf injury in Nicotiana tabacum Bel-W3 in a sub-tropical region

The city of Sao Paulo is located in a subtropical region whose climate exhibits few defined seasons as well as frequent oscillations in temperature and rainfall throughout the year. In addition to interfering with physiological processes, these peculiar climatic dynamics influence the formation of O-3 and its influx into leaves, causing species used as bioindicators in temperate climates to be ineffective here. This study evaluated gas exchange variations in CO2 and H2O and leaf injuries induced by O-3 in Nicotiana tabacum Bel-W3 in relation to oscillations in environmental conditions. Plants were exposed to an O-3-polluted environment for fifteen periods of fourteen days each throughout 2008. Gas exchange and O-3 were higher during the summer and winter but were highly variable in all seasons. Severe injuries occurred during the winter and spring, with significant variation in this parameter being observed throughout the year. An analysis of biotic and abiotic variables revealed complex relationships among them, with great importance of meteorological factors in plant responses. We conclude that under unstable climatic conditions, the relationship between O-3 flux and injury is weak, and the qualitative character of biomonitoring is further confirmed. (c) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.