Syncytin蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的克隆人syncytin基因并在大肠杆菌中表达,并用表达后的融合蛋白制备syncytin蛋白多克隆抗体。方法 PCR扩增人syncytin基因编码区的DNA片段,将其克隆入原核表达质粒pET30a(+),转化大肠杆菌BL21,诱导产生syncytin-His融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA、Western-Blot和免疫组织化学等方法来检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功表达并纯化了syncytin-His融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白主要以包涵体形式存在;ELISA法测定抗体效价为1:10 000;Western-Blot和免疫组织化学结果显示所制备的抗体能特异性识别syncytin蛋白。结论成功制备和鉴定了人syncytin多克隆抗体,多克隆抗体特异性强和效价高,为下一步研究Syncytin的生物学功能奠定了基础。

Expression of syncytin in leukemia and lymphoma cells

Syncytin is a placenta-specific protein and generally believed to play a pivotal role in syncytiotrophoblast morphogenesis. In this study, transcripts of this gene were quantified by real-time RT-PCR and the translated products were measured by an indirect immunofluorescence assay. Results showed that syncytin was found to be expressed in all nine leukemia and lymphoma cell lines studied albeit at different levels and in 43 peripheral blood samples of 57 leukemia or lymphoma patients. Neither the transcripts nor the translated syncytin was detected in blood samples of normal individuals. In conclusion, peripheral blood syncytin may serve as a marker for leukemia and lymphoma. ©

MAPK在天花粉蛋白抗HIV-1中的作用以及syncytin基因在白血病细胞中的表达

本学位论文主要包括两部分的内容： 一是关于MAPK信号转导在天花粉蛋白（trichosanthin, TCS）抗人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）中的作用的研究。TCS是I型核糖体失活蛋白（RIP），分子量27Kd，可从传统的中期流产和抗绒癌中药栝楼根块茎（天花粉）中提纯获得。该蛋白具有抗HIV-1活性，但其机制尚不清楚。本文用JNK抑制剂CEP-11004，预处理宿主细胞，检测其对TCS抗HIV-1的影响。用以下两种方法检测病毒的复制：一是用ELISA方法检测细胞培养上清中p24抗原的水平，二是检测上清中病毒粒子的逆转录酶（RT）活性。结果显示，TCS剂量依赖性地抑制HIV-1在C8166细胞中的复制。在TCS实验浓度下，HIV-1的复制水平平均为68 ± 4％（p24抗原检测）和52 ± 4％（RT活性检测）。如果用0.4μM CEP-11004对C8166细胞预处理2小时，TCS似乎失去了抗HIV-1活性，HIV-1的复制水平分别恢复为101 ± 4％和101 ± 7％。但无论是p24抗原检测还是RT活性检测，当不含TCS时，CEP-11004预处理病毒宿主细胞，本身并不影响病毒粒子的复制。这说明CEP-11004能够拮抗TCS的抗病毒活性，或者说CEP-11004抑制的信号转导途径的某些信号分子，与TCS的抗HIV-1活性相关。Western Blot方法检测的结果也证明，TCS能够以时间依赖和剂量依赖的方式激活JNK激酶，0.4μM的CEP-11004能有效抑制JNK的磷酸化。因此，TCS与它激活MAPK信号转导途径有关。 二是关于人类内源性病毒HERV-W家族囊膜蛋白基因syncytin在白血病细胞中的表达的研究。该基因在人的胎盘组织中特异性表达，可能与合胞滋养层的形成有关。另外也少量表达于睾丸组织。本论文采用实时定量RT-PCR的方法证明，syncytin能够在白血病细胞系中表达。进一步的检测还表明，syncytin的mRNA也表达于白血病/淋巴瘤患者的外周血细胞，而不表达于作为对照的10名健康志愿者的血细胞。在15名不同类型的白血病/淋巴瘤患者中，有11名有syncytin的表达。细胞系的表达相对稳定，与C8166细胞系的表达量相比较，介于0.5-2.0倍之间；而在白血病患者外周血细胞中的表达则介于0.8-21.7倍不等。上述结果提示，syncytin可能与白血病的形成有关。

合胞素在白血病和淋巴瘤细胞中的表达及意义研究

人类内源性病毒(HERVs)是远古具有感染能力的逆转录病毒整合于人类基因组的遗迹, 大约占人类基因组的3%~8%，至少包括31个家族。它们通过不同的途径参与人类各种生理和病理活动的调节过程。大多数人类内源性病毒的基因, 由于基因的突变或部分缺失而失去了转录的能力。但有些基因依然保持完整的开放读码框, 能翻译成有功能的蛋白, 如HERV-W家族的囊膜蛋白合胞素基因, 可以被转录并翻译成有功能的蛋白质。目前合胞素的生理功能以及在各种病理过程中的作用机制仍然不清楚。国内对于合胞素的功能研究处于起步阶段，尚无商品化试剂，而且也没有合胞素抗体制备的报道。我们通过PCR扩增人合胞素基因编码区的DNA片段，将其克隆入原核表达质粒pET30a (+)，转化大肠杆菌 BL21，诱导产生了合胞素-His融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白, 免疫新西兰白兔, 制备了多克隆抗体。最后通过ELISA、Western-Blot和免疫组织化学等方法检测抗体的效价和特异性。我们成功表达并纯化了合胞素-His融合蛋白, SDS-PAGE分析表明融合蛋白主要以包涵体形式存在；ELISA法测定抗体效价为 1:10 000；Western-Blot和免疫组织化学结果显示所制备的抗体能特异性识别合胞素蛋白，为下一步研究合胞素的生物学功能奠定了基础。我们首次发现，合胞素能够在白血病和淋巴瘤细胞系中表达。利用我们制备的抗合胞素多克隆抗体，我们进一步检测该基因是否在白血病和淋巴瘤患者的外周血中表达，所有患者的外周血标本，均来自云南省有关医院。作为对照，我们还检测了20 名健康志愿者的外周血细胞。实验证明，合胞素基因(包括 mRNA 和蛋白)也在白血病患者的外周血细胞表达，而不表达于健康志愿者的血细胞。在30 名不同的白血病和淋巴瘤患者中，有22 名有合胞素的表达。荧光实时定量RT-PCR 的方法比较了合胞素在细胞系和白血病患者外周血中表达的相对定量，发现合胞素基因在所检测的5 种淋巴细胞系、3 种粒细胞系和1 种淋巴瘤细胞系中都有相对稳定的表达，表达水平与C8166 细胞系相比，介于0.5-2 倍之间。而在白血病患者中的表达则介于1.8-33.4 倍不等。我们的结果提示，合胞素可能与白血病的形成有关，因为该基因表达的囊膜蛋白具有很强的促细胞融合活性，含有具有免疫抑制活性的肽段，而且已发现某些与其类似的蛋白有致瘤能力。