Estudi d'una metal·lotioneïna d'alzina surera (QsMT)

En aquest treball es caracteriza per primera vegada la capacitat de coordinació metàl·lica d'una metal·lotineïna (MT) de planta i es proposa un model de plegament per a les MTs de planta en general. Els resultat mostren que aquestes proteïnes poden tenir un paper molt important en la regulació de l'estat redox de les cèl·lules, probablement a través de la coordinació a Cu. Les MTs de planta són proteïnes molt desconegudes. Es postula que participen en l'homeòstasi del Cu i en la protecció contra l'estrès oxidatiu, però es desconeix la capacitat de coordinació metàl·lica i el plegament. En aquest treball s'han estudiat una metal·lotioneïna d'alzina surera, QsMT, aïllada d'una llibreria de cDNA de fel·lema. Els objectius concrets han estat: (1) estudiar l'expressió de QsMT i la resposta a l'estrès oxidatiu; (2) determinar la capacitat de coordinació metàl·lica i la funcionalitat in vivo; (3) fer una aproximació al plegament de les MTs de planta. L'expressió del gen s'ha estudiat mitjançant hibridació in situ en plàntules i en embrions d'alzina surera. QsMT s'expressa majoritàriament en cèl·lules amb fort estrès oxidatiu, associat a la síntesi de polifenols (suberització i lignificació) i a la senescència. També s'expressa en cèl·lules meristemàtiques, cèl·lules en divisió molt activa on la funció de les MTs podria estar relacionada amb el manteniment de l'estat redox. L'aplicació d'estrès oxidatiu exogen (H2O2 i paraquat) incrementa fortament l'expressió de QsMT en teixits amb expressió constitutiva, confirmant la regulació de l'expressió del gen per estrès oxidatiu. Per l'estudi de les propietats de coordinació metàl·lica es va expressar QsMT en cèl·lules d'E. coli en medi de cultiu suplementat amb Cu, Zn o Cd. Es van aïllar els agregats metàl·lics corresponents i es van analitzar mitjançant tècniques espectroscòpiques i espectromètriques (ICP-OES, ESI-MS i CD). Els resultats mostren que QsMT coordina de forma estable Cu (8 ions metàl·lics/molècula), Zn (4 ions de Zn/molècula) i Cd (6 ions de Cd/molècula), i adopta una estructura especialment quiral en coordinació a Cu. L'elevada capacitat quelant de la proteïna i la quiralitat de l'estructura indiquen que QsMT possiblement té preferència metàl·lica pel Cu i per tant una funció relacionada amb aquest metall in vivo. Estudis de complementació en llevat demostren que QsMT coordina Cu de forma funcional in vivo. En coordinació a Cd QsMT presenta una peculiaritat no observada fins ara en altres MTs: la participació d'ions sulfur en la formació de l'agregat metàl·lic incrementant la capacitat de coordinació metàl·lica (6 ions metàl·lics divalents de Cd enlloc de 4 ions de Zn). A més QsMT coordina Cd de forma funcional en llevat, i per tant la seva funció també podria estar relacionada amb la destoxicació de Cd en la planta. QsMT s'ha utilitzat com a model per fer una aproximació al plegament de les MTs de planta. Amb aquest objectiu vam dissenyar tres pèptids mutants derivats de QsMT: N25 corresponent a la zona rica en cisteïna en posició amino-terminal, C18 corresponent a la zona rica en cisteïna en posició carboxil-terminal, i N25-C18 corresponent a les dues zones riques en cisteïna enllaçades per 4 glicines substituint la zona central de 39 aminoàcids. Es van expressar i estudiar aquests pèptids per les mateixes tècniques utilitzades en l'estudi de QsMT. Els resultats indiquen que QsMT es plega formant un sol agregat metàl·lic per la interacció de les dues zones riques en cisteïna. En aquest model la zona central d'enllaç, típica de les MTs de planta, no participa en la coordinació metàl·lica però és imprescindible per a la funció de la proteïna. El paper de la zona central podria variar en funció del metall que coordina, participant en el plegament i estructura de la proteïna quan coordina Zn i Cd i en la seva regulació i estabilització quan coordina Cu.

Les sHsps en surera: capacitat protectora enfront l'estrés i variabilitat genètica

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic. L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu. L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics.

Les sHsps en surera: Estudis de funcionalitat

Aquesta tesi es centra en la caracterització funcional d'una proteïna de xoc de calor de baix pes molecular (Small Heat Shock Protein - sHSP) de classe I de surera pel que fa a la seva capacitat per protegir les cèl·lules de l'estrès i per estabilitzar les membranes. Les sHsps són proteïnes que s'expressen en condicions d'estrès cel·lular. Encara que certs aspectes funcionals de les sHsps són ben coneguts, el nostre treball aporta informacions noves sobre el paper de les diferents regions de la proteïna, especialment de la regió N-terminal. L'objectiu concret d'aquest treball és determinar la funció termoprotectora de QsHsp17.4-CI, una sHsp de classe I oobtinguda a partir de les cèl·lules de fel·lema d'alzina surera, en un model bacterià i analitzar la importància de les diferents regions de la proteïna en aquesta funció. Amb aquesta finalitat s'han dissenyat dues proteïnes parcials derivades de QsHsp17.4-CI: una a la que li falta la regió N-terminal (C105) i una altra amb pràcticament tot el domini -cristal·lí deleccionat (N61), i una tercera, derivada de QsHs10-CI, a la que li falta la meitat del domini -cristal·lí (Hsp10). També s'estudia la possible capacitat estabilitzadora de membranes i la capacitat de modificar l'expressió d'altres Hsps quan s'expressa de forma heteròloga. Els nostres resultats demostren que l'expressió de QsHsp17.4-CI protegeix a les cèl·lules d'E.coli de l'estrès tèrmic alhora que la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí són imprescindibles per aquesta funció de protecció. En relació a un possible paper en les membranes, els estudis de localització subcel·lular mostren que QsHsp17.4-CI colocalitza amb la fracció membranes i que la regió N-terminal de la proteïna és responsable d'aquesta colocalització. No s'ha pogut demostrar, però, que la localització amb la membrana estigui associada a un efecte protector d'aquesta: en cap cas la sobrexpressió de les proteïnes modifica la composició d'àcids grassos i només N61, que no té acció termoprotectora, altera l'estat fisico-químic de la membrana. En estudis d'expressió de novo en E.coli s'ha observat que, a diferència de les altres proteïnes heteròlogues, N61 activa l'expressió de la majoria de Hsps d'E.coli fent pensar en una possible relació entre l'estat físic de la membrana i l'activació de la resposta a l'estrès. En resum, en aquest treball hem provat la capacitat protectora de QsHsp17.4 i aportem noves dades sobre la importància de la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí en aquesta funció. Per altra banda, es suggereix que QsHsp17.4 podria interaccionar amb la membrana d'E.coli i que la regió N-terminal seria imprescindible per aquesta interacció. Finalment hem determinat que les proteïnes que provoquen variacions en l'estat de fluïdesa de la membrana poden activar la resposta al xoc de calor per part de la cèl·lula bacteriana.

Molecular genetics of cork formation

La peridermis és una estructura complexa que protegeix els òrgans vegetals madurs (secundaris) i les zones que han sofert ferides de la pèrdua d'aigua i dels patògens. Aquesta funció barrera és deguda al fel·lema o súber, un teixit format per cèl·lules suberificades. Tant el fel·lema com la suberina són crucials per la vida de les plantes terrestres, però pràcticament no es coneix res dels processos moleculars que regulen la seva formació, probablement degut a la manca de models adequats. En aquesta tesi s'han identificat i caracteritzat gens induïts al fel·lema mitjançant la combinació de dues plantes models. L'escorça d'alzina surera (Quercus suber) s'ha utilitzat per aïllar gens candidats de la formació del fel·lema i per investigar el comportament d'alguns d'aquests gens durant l'estació de creixement, mentre que la pela de la patata (Solanum tuberosum) s'ha utilitzat en estudis de genètica reversa per demostrar la funció d'alguns gens reguladors al fel·lema.

Incidència de microorganismes i de compostos orgànics volàtils en l'aparició de defectes sensorials en suro

La incidència sobre el suro de defectes sensorials amb descriptors de florit-humitat és un dels principals problemes amb què s'enfronta la indústria surera. Els principals compostos relacionats amb aquest defecte son cloroanisoles, metoxipirazines, geosmina i metilisoborneol. Aquesta recerca s'ha fet amb l'objectiu principal d'aprofundir en els mètodes de determinació de compostos volàtils en suro. S'ha desenvolupat una metodologia basada en la microextracció en fase sòlida i la cromatografia de gasos per a l'anàlisi conjunta d'aquests compostos en macerats de suro. El fet que la majoria dels compostos d'interès tingui un origen microbià ha fet necessari completar les anàlisis químiques amb mètodes de detecció i aïllament dels microorganismes susceptibles de produir-los. S'ha utilitzat un mètode per a l'estudi de la diversitat de fongs i bacteris en mostres de suro basat en l'estudi de marcadors genètics mitjançant l'anàlisi en gradients electroforètics desnaturalitzants. Per últim s'ha avaluat la capacitat de producció de defectes sensorials per microorganismes aïllats de suro utilitzant tècniques olfactomètriques.

La consolidació de la propietat pagesa a Catalunya (el Baix Empordà, 1850-1940)

Aquesta tesi estudia algunes de les transformacions agràries enregistrades en un àmbit comarcal (la comarca catalana del Baix Empordà) entre mitjan segle XIX i mitjan segle XX. EI fil conductor és la distribució de la propietat del sol agrícola. Però per a la seva comprensió es considera necessari integrar moltes altres variables. EI treball també es proposa assajar alguns procediments metodològics poc habituals en l'anàlisi de la distribució de la propietat del sòl agrícola i la seva evolució en època contemporània. Com a hipòtesi central, es sosté que, al Baix Empordà i al llarg del període comprès entre 1850 i 1940, els canvis que varen produir-se en l'estructura de la propietat i, també, en I'estructura social rural, varen apuntar genèricament a favor dels grups pagesos. En particular, es sosté : ( I) Que la situació de partida (de mitjan segle XIX) ja es caracteritzava per un notable pes de la petita propietat pagesa sobre I'estructura de la propietat agrícola i sobre el conjunt del sistema agrari. (2) Que, amb posterioritat a la crisi agrària finisecular, els problemes de rendibilitat de la producció agrària i l'erosió soferta per alguns mecanismes d'extracció de renda varen tendir a allunyar els sectors rendistes que tradicionalment havien exercit la seva hegemonia -econòmica i social- en la societat rural. (3) I, finalment, que al llarg del període va produir-se un avenç de la propietat pagesa com a conseqüència del fet que una porció significativa de famílies pageses aconseguissin ampliar el seu patrimoni territorial a través de compres realitzades en el mercat de terres, alhora que un nombre significatiu de vells grans patrimonis es fraccionava i desfeia. La magnitud d'aquests canvis va ser moderada i no va pas estar exempta d'ambigüitats, però posa de relleu la capacitat de resistència i adequació de l'explotació pagesa a les condicions d'un capitalisme evolvent, malgrat els pronòstics en sentit contrari de molts teòrics. La tesi està articulada en dues parts. En la primera es duu a terme una descripció detallada de les característiques del sistema agrari baixempordanès de mitjan segle XIX amb l'objectiu final de determinar el significat econòmic de les terres posseïdes per cada patrimoni familiar (més enllà de la simple consideració de les superfícies). EI primer pas consisteix en l'anàlisi dels usos del sòl, dels conreus principals i la seva ordenació en rotacions, dels rendiments físics, de les practiques de reposició de la fertilitat i de la dotació ramadera. A continuació es descriuen les tècniques i el procés de treball agrari amb l'objectiu de formular un model d'organització del treball agrícola que permeti mesurar les exigències en treball d'aquesta activitat. Es conclou que, des de la perspectiva de l'ocupació i de la demanda de treball generades pel sistema agrari, les localitats rurals es caracteritzaven per un fort excedent de mà d'obra en relació a les demandes laborals dels conreus tant des d'una perspectiva macroeconòmica com microeconòmica. EI tercer capítol es centra en l'avaluació de les necessitats de consum i reproducció de les UFP. Les estimacions realitzades permeten proposar un model flexible, que és contrastat amb els ingressos potencialment obtenibles per cada patrimoni. S'arriba a la conclusió que només una ínfima part de la població arribava a obtenir, amb l'explotació directa del seu patrimoni, l'ingrés necessari per a la seva reproducció econòmica simple. Paral·lelament però, es posa de relleu la importància econòmica i social dels petits patrimonis pagesos. S'estima que entorn una mitjana del 45% del sòl agrícola estava posseït per aquest segment de propietaris i, en el quart capítol, s'estudien les implicacions d'aquest fet. EI retrat de la situació de partida finalitza amb l'estudi dels règims de no-propietat predominants a la comarca. En la segona part, aquesta visió estàtica deixa pas a una anàlisi dinàmica. A mitjan segle XIX, al Baix Empordà, s'estava arribant a la fi d'una llarga etapa expansiva iniciada una centúria abans. Els primers signes d'esgotament varen ser la intensa pèrdua de població rural entre 1860 i 1880, la paralització de l'expansió dels conreus i el fort desenvolupament de la industria surera, eix del nou motor econòmic comarcal. Amb posterioritat a 1860 els canvis en l'estructura distributiva de la propietat varen tendir a apuntar cap a la consolidació de la propietat pagesa. Es va produir un procés de transferència de terres des dels sectors rendistes cap a sectors pagesos que va realitzar-se a través de compravendes en el mercat de la terra més que a través d'establiments i subestabliments emfitèutics. Va tenir com a conseqüència última el retrocés dels vells patrimonis rendistes, que, en general, no varen ser substituïts per l'aparició de nous grans patrimonis, com havia pogut passar fins aleshores. Paral·lelament, un bon nombre d'unitats familiars rurals també varen anar abandonant el camp i les seves propietats, produint-se una altra línia de transferència de terres entre sectors pagesos. La depreciació sostinguda dels preus agrícoles, la caiguda de la renda agrària, la superior rendibilitat de les inversions en valors mobiliaris i la incidència d'una creixent conflictivitat agrària són els factors que es destaquen per explicar la reculada dels grans patrimonis territorials. Des de la perspectiva pagesa es proposen tres elements explicatius per interpretar el procés d'acumulació patrimonial observat en un determinat segment de població: (1) el manteniment d'estratègies de producció per a l'autoconsum (un aspecte sempre polèmic i de difícil demostració); (2) l'existència d'un flux important d'ingressos salarials i extra-agrícoles en la composició de l'ingrés familiar pagès; i (3) el canvi en les orientacions tècniques i productives de les explotacions pageses. La combinació dels tres, alhora que hauria limitat els efectes directes dels moviments dels preus agraris, hauria possibilitat l'estratègia acumulativa observada.