Efeito da irradiação ultrasônica em microalgas Selenastrum capricornutum e Chlorella sorokiniana

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia Aplicada) - IBRC

Optimization of a microplate-based assay to assess esterase activity in the alga Pseudokirchneriella subcapitata

The present work describes the optimization of a short-term assay, based on the inhibition of the esterase activity of the alga Pseudokirchneriella subcapitata, in a microplate format. The optimization of the staining procedure showed that the incubation of the algal cells with 20 μmolL−1 fluorescein diacetate (FDA) for 40 min allowed discrimination between metabolic active and inactive cells. The shortterm assay was tested using Cu as toxicant. For this purpose, algal cells, in the exponential or stationary phase of growth, were exposed to the heavy metal in growing conditions. After 3 or 6 h, cells were subsequently stained with FDA, using the optimized procedure. For Cu, the 3- and 6-h EC50 values, based on the inhibition of the esterase activity of algal cells in the exponential phase of growth, were 209 and 130 μg L−1, respectively. P. subcapitata cells, in the stationary phase of growth, displayed higher effective concentration values than those observed in the exponential phase. The 3- and 6-h EC50 values for Cu, for cells in the stationary phase, were 443 and 268 μgL−1, respectively. This short-term microplate assay showed to be a rapid endpoint for testing toxicity using the alga P. subcapitata. The small volume required, the simplicity of the assay (no washing steps), and the automatic reading of the fluorescence make the assay particularly well suited for the evaluation of the toxicity of a high number of environmental samples.

Estudi de l'impacte ecotoxicològic de l'insecticida imidacloprid en diferents compartiments ambientals

En les darreres dècades la necessitat d’una major producció en l’agricultura ha implicat l’ús de productes químics per a millorar la producció. Entre aquests productes trobem els insecticides que, tot i ser específics per a determinades funcions, en molts casos acaben afectant també a altres organismes que no en són la diana. Els assajos d’ecotoxicitat són una eina clau per a determinar el grau d’afectació d’aquests insecticides. En aquest estudi es pretén determinar l’efecte de l’aplicació directa en el sòl de les dosis recomanades de l’insecticida Confidor 20SL (amb imidacloprid com a principi actiu) sobre Eisenia fetida i dels lixiviats d’aquests sòls sobre Daphnia magna i Selenastrum capricornutum simulant fenòmens d’escorrentia o lixiviació naturals. En el cas de E.fetida s’obté una LC50 de 24.71 mg/kg sòl i per la reproducció un valor de EC50 de 8.41 mg/kg sòl. S’observa allunyament en totes les dosis utilitzades i la EC50 és de 2.57 mg/kg sòl. No s’han pogut determinar efectes a nivell neurològic a partir de la determinació de l’activitat de l’ AChE. A l’exposar D.magna als lixiviats del sòl contaminat no s’han observat efectes clars ni en la mortalitat ni en la reproducció. El mateix succeeix amb S.capricornutum. Les dosis d’aplicació del pesticida Confidor, representen una amenaça per a E.fetida pel que fa a efectes subletals però no podem dir el mateix per als organismes aquàtics.

Decolorization and toxicity of municipal waste by horseradish (Cochlearia armoracia)

The Municipal Station of Americana, SP, Brazil, treats a volume of 400 l s-1 of effluent, of domestic and textile origin, and produces about 20 t of sludge per day. The plant horseradish, which contains high amount of peroxidases, was able to decolorize this effluent in 2 h and the solid waste in 2 days, at concentrations of 10 and 50%, respectively. However, there was an increase in the toxicity for the bioassays with Hydra attenuatta, Selenastrum capricornutum and lettuce seeds, indicating formation of more toxic substances. Since horseradish showed the ability to decolorize these residues, it can be used as pre-treatment resulting in a sludge of less complex composition.

Uso de biomassa de algas para a peletização de sementes de Bowdichia virgilioides Kunth

Microalgas são consideradas organismos promissores com aplicações em diversas áreas, entre elas para a fixação de CO2, indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica. A industrialização na produção desses organismos levará à geração de resíduos, cuja utilização é vista como contribuinte na redução de custos de produção. Nesta pesquisa, propôs-se o uso de microalgas como material cimentante para peletização de sementes de Bowdichia virgilioides Kunth, espécie nativa do Cerrado brasileiro. Biomassa das microalgas Selenastrum capricornutum e Chlorella sorokiniana foram obtidas a partir de cultivos semicontrolados em casa de vegetação. Nas microalgas, foi determinada a concentração de clorofila a, proteínas, carboidratos e lipídios totais, e a biomassa para peletização foi obtida com as células em fase estacionária de crescimento. Com relação às sementes, os tratamentos consistiram de semente nua, semente com gesso agrícola, semente com gesso agrícola e S. capricornutum ou com C. sorokiniana. Nessas, analisaram-se a emergência e desenvolvimento das plântulas e ocorrência de nódulos fixadores de nitrogênio. Os resultados indicaram que sementes com gesso e C. sorokiniana apresentaram porcentagem de emergência (76%) estatisticamente similar à obtida para sementes nuas (86%) e que foi mais elevada do que sementes peletizadas com gesso (60%) e com gesso e S. capricornutum (62%). A melhor porcentagem de emergência para C. sorokiniana em comparação com S. capricornutum pode estar relacionada ao maior conteúdo de lipídios (11,4 mgL-1) e carboidratos (25,0 mg L-1) em C. sorokiniana, em comparação com S. capricornutum (2,2 mg L-1 lipídios e 0,31 mg L-1 carboidratos). Parâmetros como tempo médio de emergência, comprimento e peso da parte aérea fresca e seca e radicular das plântulas de B. virgilioides foram similares para todos os tratamentos. Conclui-se que a biomassa de C. sorokiniana pode ter aplicação promissora como constituinte de material cimentante em peletização de sementes, apresentando resultados posistivos e similares à emergência de sementes nuas.

Avaliação da sensibilidade de Raphidocelis subcapitata (Chlorococcales, Chlorophyta) ao sulfato de cobre e sulfato de zinco através de toxicidade crônica e determinação da densidade algal por espectrofotometria

Testes de toxicidade crônica, analisando a inibição de crescimento algáceo após 96 horas, foram realizados a fim de conhecer a sensibilidade de Raphidocelis subcapitata (conhecida como Selenastrum capricornutum), ao sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e do sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O). A inibição do crescimento algal seguiu uma tendência exponencial negativa em função do aumento de concentração das duas substâncias, sendo descrita através das seguintes equações: y = 6257208,7. e-5,581.Cu; y = 7003223,1. e- 5,452.Zn; onde y é o número de células de R. subcapitata após 96 horas de exposição a diferentes concentrações de sulfato de cobre e sulfato de zinco, respectivamente. Valores de CE(I)50 demonstraram maior sensibilidade de R. subcapitata ao sulfato de cobre (CE(I)50;96h=0,154 mg.L-1) quando comparada com sulfato de zinco (CE(I)50;96h=0,215 mg.L-1). A densidade algácea foi determinada através de contagem celular e por técnica espectrofotométrica. Foi obtida uma curva de calibração para estimativa de densidade algácea correlacionando valores de absorbância e número de células por contagem, em 684 nm. A curva foi determinada através de um modelo empírico: y = 7,2578.10-8 . x1,0219 (n=130; r2=0,9998); onde y é a medida de absorbância e x é o número de células. A análise de resíduos demonstrou que a equação pode ser utilizada até a densidades de 5.000.000 de células e valores de absorbância até 0,5.

Avaliação da fertilidade e sensibilidade de Daphnia similis e Daphina magna (Crustacea, Cladocera) submetidas a diferentes tipos de dietas e meios de cultivo

O gênero Daphnia é o grupo mais antigo utilizado em ensaios de toxicidade. Dentre este grupo, as espécies Daphnia similis e Daphnia magna tiveram sua biologia amplamente estudada e vem sendo utilizada para ensaios toxicológicos. Diferentes condições de cultivo, no entanto, podem influenciar na produtividade e sensibilidade dos organismos. Este trabalho tem como objetivo, avaliar a influência de diferentes dietas e meios de cultivo na sensibilidade e na reprodução de D. similis e D. magna. Foram realizados cultivos com dez indivíduos em béqueres de 250 mL e 600 mL para D. similis e D. magna respectivamente, com água destilada deionizada reconstituída e meio de cultivo M4, mantidos a 20°C, fotoperíodo de 16horas/luz e alimentados com diferentes combinações de alimento com quatro réplicas cada. As dietas consistiam na utilização das algas Selenastrum capricornutum na concentração de 1.5.105 céls.mL-1 e Scenedesmus subspicatus na concentração de 106 céls.mL-1 . A combinação destas algas com o complemento de uma ração podendo ser de truta ou artêmia na concentração de 6 g.L-1 também foi utilizada. Em cada tratamento observou-se diariamente o número médio de neonatos produzidos por fêmea no período de 21 dias. Paralelamente foram realizados ensaios de sensibilidade ao dicromato de potássio de acordo com a NBR 12713 para cada dieta. Os resultados obtidos quanto à fertilidade quando submetidas a uma dieta com as algas S. capricornutum para D. similis e S. subspicatus para D. magna tendo o complemento de uma ração de artêmia demonstrou que independente do meio utilizado para o cultivo, a reprodução não variou significativamente o que caracteriza a ração de artêmia como uma alternativa ao complemento M4. Quanto à sensibilidade, em todos os casos analisados, quando cultivados em meio M4 os organismos mostraram-se mais resistentes ao Dicromato de Potássio do que quando cultivados em meio ISO.

Ensaios ecotoxicológicos no monitoramento da qualidade de águas subterrâneas potencialmente impactadas

Conforme a legislão brasileira, a gestão das águas subterrâneas está integrada à das águas superficiais nas quais estão localizadas os aqüiferos. Entretanto, não existe uma regulamentação específica que defina critérios e métodos de avaliação da qualidade ambiental, que caracterizem de forma completa este ambiente. A restrita bibliografia especializada que trata do assunto não é conclusiva quanto a aplicação de ensaios de toxidades aquática no monitoramente de águas subterrâneas. Assim, com o bjetivo de verificar a aplicabilidade dos ensaios de toxidadee padronizados para a avaliação da qualidade de águas subterrâneas potencialmente impactadas, foram avaliadas amostras provenientes de dois diferentes tipos de aqüiferos (livre e semiconfinado) localizados em uma área industrial da Região Metropolitana de Porto ALegre, RS, Brasil. Um total de 75 amostrras distribuídas em 19 poços de monitoramento foram analisadas quanto seus valores de pH, condutividade elétrica, cloretos, hidrocarbonetos, fenóis, nitrogênio amoniacal, sólidos dissolvidos totais e metais (Cd, Pb, Cu, Cr, Mn, Zn, Hg e Hi) e quanto à toxicidade crônica com Selenastrum capricornutum, Ceriodaphia dubia e Primephales promelas. As amostras foram coletadas semestralmente, sendo que o aqüifero livre foi amostrado de janeiro de 2001 a janeiro de 2003 e o aqüifero semiconfinado de fevereiro de 2002 a janeiro de 2003. Os resultados dos parâmetros químicos avaliados foram comparados, quando possível, a diferentes concentrações tidas como valores de referência (Portaria 1469/00 do Ministério da Saúde - Potabilidade), Lista Holandesa (valores de alerta - T) e Resolução nº 20/86 so CONAMA (Classe 2). A comparação dos resultados das anállises químicas diferentes de contaminação. Os valores de nitrogênio amoniacal, condutividade, fenóis, e hidrocarbonetos totais foram signitivamente maiores no aqüifero livre quando comparado ao aqüifero semiconfinado, enquanto os metais manganês e zinco apresentaram maiores concentrações no aqüifero semiconfinado. Para os demais parâmetros não foram detectadas diferenças estatiscamente significativas. Os resultados das análises ecotoxicológicas dos poços dos poços de monitoramente do aqüifero livre e semiconfinado acompanharam as diferenças químicas encontradas para os dois aqüiferos, demonstrando diferenças na qualidade das águas subterrâneas avaliadas Observou-se claramente uma maior incidência de valores negativos (inibição de crescimento ou reprodução), para os três níveis trtóficos, para as amostrras do aqüifero livre, quando em comparação as amostrras do aqüifero semiconfinado. Diferenças também foram verificadas nas respostas dos três niveis tróficos utilizadas, observando-se uma maior freqüência de amostrras tóxicas para alga S. capricormutum. O trrabalho apresenta ainda algumas correlações significativas ( =0,05) entrer as concentrações de determinados parâmetros com as toxidades detectados, tais como toxidade para C. dubla e nitrogênio amoniacal (r=0,39) e fenóis (r=0,394), toxidade para S. capricornutum e manganês (r=0,298), condutividade (r=0,393) e cobre (r=0,388) e Toxidade para P. promelas e pH (r=0, 484). Uma possível influência da matriz do solo sobre a toxicidade apresentada para S. capricornutum também é discutida. O trabalho conclui que ensaios de toxicidade com organismos aquáticos pode aplicados no monitoramento de águas subterrâneas. Entretanto, a interpretação dos resultados e as decisões a serem tomadas devem ser mais criteriosas, considerando-se um possível efeito da matriz original do solo sobre os organismos-teste utlizados.

Avaliação de um efluente industrial através de ensaios ecotoxicilógicos e análises físicas e químicas

Análises ecotoxicológicas vêm sendo empregadas no monitoramento de efluentes industriais com o intuito de minimizar o impacto ambiental, avaliar a eficiência de estações de tratamento, bem como requisito para a obtenção e manutenção de licenças junto aos órgãos ambientais. Com o objetivo de avaliar a toxicidade de um efluente industrial de origem petroquímica, foram realizados ensaios de toxicidade crônica com espécies de três diferentes níveis tróficos (Selenastrum capricornutum, Ceriodaphnia dubia e Pimephales promelas). As amostras do efluente foram também analisadas quanto aos valores de cianeto, DBO5, DQO, fenol, fósforo solúvel, fósforo total, nitrogênio amoniacal, nitrogênio total, óleos e graxas minerais, óleos e graxas totais, óleos e graxas vegetal/animal, oxigênio dissolvido, pH, sólidos suspensos totais, sulfeto, surfactantes e metais (mercúrio, cádmio, cobre, cromo, manganês, chumbo, zinco e níquel). As coletas ocorreram mensalmente, de agosto de 2002 a julho de 2003, na saída da estação de tratamento. Os resultados das análises físicas e químicas foram comparados com os limites de emissão disponíveis na Resolução nº 20/86 do CONAMA e Portaria Estadual nº 05/89 da Secretaria da Saúde e do Meio Ambiente (RS) A maioria dos parâmetros (85,7%) estava de acordo com a legislação vigente, exceto o fósforo total, o nitrogênio total e o nitrogênio amoniacal. No entanto, todas as amostras apresentaram toxicidade para pelo menos um dos organismos utilizados nos ensaios. Apesar de um maior número de amostras ter apresentado toxicidade para S. capricornutum, o efluente foi tóxico para P. promelas em concentrações mais baixas, se comparado com os outros dois organismos. Foi possível identificar correlação estatisticamente significativa (p≤0,05) entre a toxicidade para S. capricornutum e os valores de manganês (r=0,44), toxicidade para C. dubia e os valores de nitrogênio total e DQO (r=0,40) e toxicidade para P.promelas e os valores de sólidos suspensos totais, sulfeto, nitrogênio total e cianeto (r=0,71).

Photo-induced toxicity of anthracene in the Antarctic shallow water amphipod, Gondogeneia antarctica

The photo-induced toxicity of anthracene was investigated as the mortality in Antarctic shallow water amphipod, Gondogeneia antarctica, at different concentrations of anthracene and different periods of exposure to natural sunlight and artificial UVA and UVB radiations. When exposed to natural sunlight, animals contaminated in the dark and placed in clean water or in anthracene solutions showed different degrees of mortality, dose-time dependent. Effects were even more evident when these animals were exposed to artificial UVA or UVB radiations. Depuration seemed to be a slow process. The effects of UV radiation and anthracene alone and the effects of the interactions of these two stressors implied that solar radiation is an important parameter that deserves consideration in the environmental assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons in Antarctic coastal waters. G. antarctica proved to be a good bioindicator for the phototoxicity of anthracene in Antarctic shallow waters.

The selection of a model microalgal species as biomaterial for a novel aquatic phytotoxicity assay

A phytotoxicity assay based on the ToxY-PAM dual-channel yield analyser has been developed and successfully incorporated into field assessments for the detection of phytotoxicants in water. As a means of further exploring the scope of the assay application and of selecting a model biomaterial to complement the instrument design, nine algal species were exposed to four chemical substances deemed of priority for water quality monitoring purposes (chlorpyrifos, copper, diuron and nonylphenol ethoxylate). Inter-species differences in sensitivity to the four toxicants varied by a factor of 1.9-100. Measurements of photosystem-II quantum yield using these nine single-celled microalgae as biomaterial corroborated previous studies which have shown that the ToxY-PAM dual-channel yield analyser is a highly sensitive method for the detection of PS-II impacting herbicides. Besides Phaeodactylum tricornutum, the previously applied biomaterial, three other species consistently performed well (Nitzschia closterium, Chlorella vulgaris and Dunaliella tertiolecta) and will be used in further test optimisation experiments. In addition to sensitivity, response time was evaluated and revealed a high degree of variation between species and toxicants. While most species displayed relatively weak and slow responses to copper, C. vulgaris demonstrated an IC10 of 51 μ g L-1, with maximum response measured within 25 minutes and inhibition being accompanied by a large decrease in fluorescence yield. The potential for this C vulgaris-based bioassay to be used for the detection of copper is discussed. There was no evidence that the standard ToxY-PAM protocol, using these unicellular algae species, could be used for the detection of chlorpyrifos or nonylphenol ethoxylate at environmentally relevant levels. © 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

FACTORS AFFECTING DIPOREIA GROWTH RATES IN LAKE SUPERIOR

An ability to predict population dynamics of the amphipod Diporeia is important in understanding how energy pathways in the Lake Superior food web might be altered by disturbances to the ecosystem. Estimating growth rates for this prominent prey item for fish requires information on the physiological effects of changes to its environment. These effects have been investigated for Diporeia in other Great Lakes, but little is known about Lake Superior populations. The primary objective of this study is to obtain quantitative data for rates of Diporeia respiration and consumption that can be incorporated into a bioenergetics model for Lake Superior. Benthic communities in Lake Superior were sampled bimonthly from April through September during 2011 and 2012 to investigate spatial and temporal trends of Diporeia abundances as well as size class structures of the population. Additional samples of Diporeia were collected and kept alive in natural sediment for laboratory experiments. Respiration rates for Diporeia were measured by monitoring dissolved oxygen concentrations in microcosoms using microelectrodes. Additionally, a series of experiments to estimate consumption rates based on food availability were conducted using 14C-labeled algae (Selenastrum capricornutum). Amphipod population densities are highest between 30-110 m (slope) compared to 0-30 m (shelf) or >110 m (profundal) regions in Lake Superior. This heterogeneous distribution of Diporeia in Lake Superior is an important component to quantifying lake-wide biomass. Rates of oxygen consumption by Diporeia range from 32.0 to 44.7 mgO2*gDW-1*d-1, and do not vary significantly with body size per individual. The predicted consumption rate corresponding to average Lake Superior algal carbon fluxes was 0.08 ± SE mgC*gDW-1*d-1. Data on Lake Superior Diporeia biomass and bioenergetics found in this study can be incorporated in a model used to estimate the viability of this population under potential future environmental stressors.

Influence of Baculovirus anticarsia on the growth rate and survival of some nontarget aquatic organisms.

Recently, microbial pest control agents (MPCAs) have been worldwide used to reduce chemical pesticide use and to diminish the high risk of those compounds in the environment. Among various MPCAs, the nuclear polyhedrosis virus Baculovirus anticarsia is widely used in Brazil in the biological control of the velvet bean caterpillar. Although literature data do not show adverse effects of baculoviruses to nontarget organisms, it is necessary to evaluate their toxicity or patogenicity in order to study th environmental risk of those products and to register the formulations in the Brazilian Environmental Regularory Agency - IBAMA. In the presente work, the influence of a Baculovirus anticarsia formulation was evaluted to measure the consequences in the growth rateof the green algae Selenastrum capricornutum, the duckweed Lemna valdiviana and the microcrustacean Daphnia similis. The survival of the fish Hyphessobrycon scholzei exposed during 28 days was also evaluated. No significative adverse effects (P > 0.05) were observed in the test organisms which were exposed to 1-1000 times the maximum calculated pesticide concentration following a direct application to 15 cm layer of water.

Risk assessment of the herbicide clomazone in the aquatic life.

Clomazone (2-(2-chlorophenyl)methyl-4.4-dimethyl-3-isoxazolidinone) is a post emergence herbicide widely used in rice fields in Rio Grande do Sul (Brazil) with high activity against Gramineae at the recommended application rate(AR).of 700g/ha. The herbicide input into the aquatic ecosystem may occur by aerial application or water drainage. The presence of this chemical in the water may affect non-target organisms leading to impairments in the aquatic food chain. Studies were conducted in this work to evaluate the risk of Clomazone using the estimated mean affective concentration (EC50) for the microalgae Selenastrum capricornutum(96h), the duckweed Lemna valdiviana(96h) and the crustacean Daphnia similis(48h). The EC50 values were 11.2; 31.7 and 13.8 mg/l, respectively. According to the obtained data, and considering a direct input of the herbicide in a 10cm column water, the estimated maximum application rate that doesn't cause acute effects is 5.3 AR for S. capricornutum, 6.5 AR for D. similis and 15.0 AR for L. valdiviana. The estimated maximum application rate that doesn't cause chronic effects is 2.0 AR for D. similis, 1.6 AR for S. capricornutum and 4.5 AR for L. valviana.

Cadmium and Chromium Toxicity to Pseudokirchneriella subcapitata and Microcystis aeruginosa

The toxicity of cadmium and chromium to Pseudokirchneriella subcapitata and Microcystis aeruginosa was evaluated through algal growth rate during 96h exposure bioassays. Free metal ion concentrations were obtained using MINEQL(+) 4.61 and used for IC50 determination. Metal accumulations by the microorganisms were determined and they were found to be dependent on the concentration of Cd2+ and Cr6+. IC50 for P. subcapitata were 0.60 mu mol L-1 free Cd2+ and 20 mu mol L-1 free Cr6+, while the IC50 values for M. aeruginosa were 0.01 mu mol L-1 Cd2+ and 11.07 mu mol L-1 Cr6+. P. subcapitata accumulated higher metal concentrations (0.001 - 0.05 mu mol Cd mg(-1) dry wt. and 0.001 - 0.04 mu mol Cr mg(-1) dry wt) than the cyanobacteria (0.001 - 0.01 mu mol Cd mg(-1) dry wt and 0.001 - 0.02 mu mol Cr mg(-1) dry wt). Cadmium was more toxic than chromium to both the microorganisms.