Mutations impliquées dans la progression du cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus létal. Plus de 70% des patientes diagnostiquées avec une tumeur de stade avancé rechutent suite aux traitements chimiothérapeutiques de première ligne, la survie à cinq ans étant ainsi très faible. Afin de mieux comprendre l’évolution de la maladie, nous avons recherché de nouveaux gènes, responsables de l’initiation et de la progression du CEO. Précédemment, des lignées cellulaires ont été dérivées à partir de la tumeur primaire et récurrente et/ou d’ascites de trois patientes. Le séquençage de l’ARN de ces lignées par la technologie de séquençage de nouvelle génération (TSNG) nous a permis d’identifier des mutations ponctuelles qui pourraient nous indiquer des gènes dérégulés dans le CEO. La TSNG est un bon outil qui permet d’identifier et de cribler à grande échelle des mutations. Nous avons sélectionné PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE et ITGAE comme gènes candidats présentant des mutations dans nos lignées et ayant une relation fonctionnelle avérée avec le cancer. Étant donné que la TSNG est une technique à taux de fiabilité limité, nous avons validé ces mutations par séquençage Sanger. Ensuite, nous avons étudié l’effet de ces mutations sur la structure protéique et l’expression de PLEC1, de SCRIB et de SEMA6C. Seules certaines mutations dans les gènes PLEC1, SCRIB et SEMA6C ont pu être confirmées. PLEC1 et SCRIB sont deux protéines d’échafaudage dont la mutation, rapportée dans plusieurs cancers, pourrait induire des changements de leurs conformations et affecter leurs interactions et leurs fonctions. Les conséquences de ces mutations sur la tumorigenèse de l’ovaire devront être étudiées.

La génomique évolutive mitochondriale révèle des échanges génétiques et la ségrégation chez les Gloméromycètes

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) sont des organismes microscopiques du sol qui jouent un rôle crucial dans les écosystèmes naturels et que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils vivent en relation symbiotique avec la vaste majorité des plantes terrestres. Ils sont des biotrophes obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent croître qu'en présence d'une plante hôte. Cette symbiose permet entre autres à la plante d'acquérir des nutriments supplémentaires, en particulier du phosphore et du nitrate. Malgré le fait que cette symbiose apporte des services importants aux écosystèmes, la richesse des espèces, la structure des communautés, ainsi que la diversité fonctionnelle des CMA sont mal connues et l'approfondissement des connaissances dans ces domaines dépend d’outils de diagnostic moléculaire. Cependant, la présence de polymorphisme nucléaire intra-isolat combiné à un manque de données génomiques dans différents groupes phylogénétique de ces champignons complique le développement de marqueurs moléculaires et la détermination de l'affiliation évolutive à hauts niveaux de résolution (c.a.d. entre espèces génétiquement similaires et/ou isolats de la même espèce). . Pour ces raisons, il semble une bonne alternative d’utiliser un système génétique différent en ciblant le génome mitochondrial, qui a été démontré homogène au sein d'un même isolat de CMA. Cependant, étant donné le mode de vie particulier de ces organismes, une meilleure compréhension des processus évolutifs mitochondriaux est nécessaire afin de valoriser l'utilisation de tels marqueurs dans des études de diversité et en génétique des populations. En ce sens, mon projet de doctorat consistait à investiguerétudier: i) les vecteurs de divergences inter-isolats et -espèces génétiquement rapprochéesphylogénétiquement apparentées, ii) la plasticité des génomes mitochondriaux, iii) l'héritabilité mitochondriale et les mécanismes potentiels de ségrégation, ainsi que iv) la diversité mitochondriale intra-isolat in situ. À l'aide de la génomique mitochondriale comparative, en utilisant le séquençage nouvelle génération, on a démontré la présence de variation génétique substantielle inter-isolats et -espèces, engendrées par l'invasion d'éléments mobiles dans les génomes mitochondriaux des CMA, donnant lieu à une évolution moléculaire rapide des régions intergéniques. Cette variation permettait de développer des marqueurs spécifiques à des isolats de la même espèce. Ensuite, à l'aide d'une approche analytique par réseaux de gènes sur des éléments mobiles, on a été en mesure de démontrer des évènements de recombinaisons homologues entre des haplotypes mitochondriaux distincts, menant à des réarrangements génomiques. Cela a permis d'ouvrir les perspectives sur la dynamique mitochondriale et l'hétéroplasmie dans un même isolatsuggère une coexistence de différents haplotypes mitochondriaux dans les populations naturelles et que les cultures monosporales pourraient induirent une sous-estimation de la diversité allélique mitochondriale. Cette apparente contradiction avec l'homogénéité mitochondriale intra-isolat généralement observée, a amené à investiguer étudier les échanges génétiques à l'aide de croisements d'isolats génétiquement distincts. Malgré l'observation de quelques spores filles hétéroplasmiques, l'homoplasmie était le statut par défaut dans toutes les cultures monosporales, avec un biais en faveur de l'un des haplotypes parentaux. Ces résultats suggèrent que la ségrégation opère durant la formation de la spore et/ou le développement de la coloniedu mycélium. De plus, ils supportent la présence d'une machinerie protéique de ségrégation mitochondriale chez les CMAAMF, où l'ensemble des gènes impliqués dans ce mécanisme ont été retrouvé et sont orthologues aux autres champignons. Finalement, on est revenue aux sources avecon a étudié le polymorphisme mitochondrial intra-isolat à l'aide d'une approche conventionnelle de PCR en utilisant une Taq polymérase de haute fidélité, suivie de clonage et de séquençage Sanger, sur deux isolats de R. irregularis. Cela a permis l'observation d'hétéroplasmie in situ, ainsi que la co-expression de variantes de variantes de protéines'ARNm dans une souche in vitro. Les résultats suggèrent que d'autres études basées sur le séquençage nouvelle génération aurait potentiellement ignorée cette variation, offrant ainsi plusieurs nouveaux arguments permettant de considérer les CMA comme des organismes possédant une population de génomes mitochondriaux et nucléaires distincts.

Portrait of Molling and Sanger (Loewy) families on vacation; Marienbad Portraits Family

Therese Molling (1890-1981) is in back row in white dress, to her left is her mother Henny Molling nee Meyerhof (1864-1934), her husband (and Therese's father) Adolf Molling (1865-1921) is posing on the grass in front.

Portrait of Molling and Sanger (Loewy) families on vacation; Marienbad Portraits Family

Therese Molling (1890-1981) is in back row in white dress, to her left is her mother Henny Molling nee Meyerhof (1864-1934), her husband (and Therese's father) Adolf Molling (1865-1921) is posing on the grass in front.

Identification des bases génétiques des myopathies à multi-minicores avec ou sans cardiomyopathie

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris 6(UPMC, Paris, France).

Une nouvelle approche computationnelle pour la découverte des sites de fixation de facteurs de transcription à l’ADN, adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage

Les facteurs de transcription sont des protéines spécialisées qui jouent un rôle important dans différents processus biologiques tel que la différenciation, le cycle cellulaire et la tumorigenèse. Ils régulent la transcription des gènes en se fixant sur des séquences d’ADN spécifiques (éléments cis-régulateurs). L’identification de ces éléments est une étape cruciale dans la compréhension des réseaux de régulation des gènes. Avec l’avènement des technologies de séquençage à haut débit, l’identification de tout les éléments fonctionnels dans les génomes, incluant gènes et éléments cis-régulateurs a connu une avancée considérable. Alors qu’on est arrivé à estimer le nombre de gènes chez différentes espèces, l’information sur les éléments qui contrôlent et orchestrent la régulation de ces gènes est encore mal définie. Grace aux techniques de ChIP-chip et de ChIP-séquençage il est possible d’identifier toutes les régions du génome qui sont liées par un facteur de transcription d’intérêt. Plusieurs approches computationnelles ont été développées pour prédire les sites fixés par les facteurs de transcription. Ces approches sont classées en deux catégories principales: les algorithmes énumératifs et probabilistes. Toutefois, plusieurs études ont montré que ces approches génèrent des taux élevés de faux négatifs et de faux positifs ce qui rend difficile l’interprétation des résultats et par conséquent leur validation expérimentale. Dans cette thèse, nous avons ciblé deux objectifs. Le premier objectif a été de développer une nouvelle approche pour la découverte des sites de fixation des facteurs de transcription à l’ADN (SAMD-ChIP) adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. Notre approche implémente un algorithme hybride qui combine les deux stratégies énumérative et probabiliste, afin d’exploiter les performances de chacune d’entre elles. Notre approche a montré ses performances, comparée aux outils de découvertes de motifs existants sur des jeux de données simulées et des jeux de données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. SAMD-ChIP présente aussi l’avantage d’exploiter les propriétés de distributions des sites liés par les facteurs de transcription autour du centre des régions liées afin de limiter la prédiction aux motifs qui sont enrichis dans une fenêtre de longueur fixe autour du centre de ces régions. Les facteurs de transcription agissent rarement seuls. Ils forment souvent des complexes pour interagir avec l’ADN pour réguler leurs gènes cibles. Ces interactions impliquent des facteurs de transcription dont les sites de fixation à l’ADN sont localisés proches les uns des autres ou bien médier par des boucles de chromatine. Notre deuxième objectif a été d’exploiter la proximité spatiale des sites liés par les facteurs de transcription dans les régions de ChIP-chip et de ChIP-séquençage pour développer une approche pour la prédiction des motifs composites (motifs composés par deux sites et séparés par un espacement de taille fixe). Nous avons testé ce module pour prédire la co-localisation entre les deux demi-sites ERE qui forment le site ERE, lié par le récepteur des œstrogènes ERα. Ce module a été incorporé à notre outil de découverte de motifs SAMD-ChIP.

Syndrome du QT long: étude clinique à l’Institut Cardiologique de Montréal et recherche de nouvelles variantes causales par séquençage à haut débit

Le syndrome du QT long congénital (LQTS) est une canalopathie génétique, à l’origine de syncopes et mort subite. Le dépistage génétique identifie des variantes génétiques dans 50-70% des cas, suggérant l’implication d’autres gènes. Nous avons recueilli les caractéristiques des patients avec un LQTS à l’ICM, et recruté 12 patients avec un génotype négatif pour le LQTS pour un séquençage à haut débit des exons afin d’identifier de nouvelles variantes causales. Nous avons développé une approche analytique par étapes : (1) les gènes connus du, (2) les gènes dans des loci identifiés par des études d’association sur le QT, et (3) les gènes montrant la même variante chez plusieurs patients. L’analyse génétique a identifié de nouvelles variantes dans: (1) KCNJ2, ANK2 et AKAP9, et (2) dans NOS1AP. (3) Deux patientes avec des phénotypes semblables présentent la même variante homozygote dans TECRL, un nouveau gène candidat dont le rôle est inconnu.

Études génétiques de familles récessives d’ataxies et de paraplégies spastiques

Au cours des dernières années, la génétique a subi une progression phénoménale suite au développement de nouvelles technologies de séquençage. En effet, le séquençage de l’exome entier chez des familles a permis l’identification de nouveaux gènes impliqués pour plusieurs maladies. La neurologie a d’ailleurs bénéficié de ces avancées et plusieurs gènes ont été mis en évidence comme causatifs pour différents désordres neurologiques. Dans ce travail il sera question de deux désordres du mouvement pour lequel nous avons utilisés des technologies de séquençage traditionnelles, en l’occurrence le séquençage par Sanger, ainsi que de nouvelles technologies pour le séquençage de l’exome entier afin d’identifier de nouveaux gènes causatifs. Le premier désordre du mouvement qui sera décrit est l’ataxie, où ne seront abordées que les ataxies de cause génétiques, à transmission récessive. Le premier chapitre relatera les nouvelles mutations qui ont été trouvées chez des canadiens-français souffrant de l’ataxie de Beauce. Il sera aussi question de nouvelles mutations retrouvées dans deux autres populations, confirmant l’implication du gène SYNE1 dans les cas d’ataxie cérébelleuse à travers le monde. Le second chapitre fera la démonstration qu’il est souhaitable d’utiliser le séquençage de l’exome entier dans le but de poser un diagnostic clinique. En effet, il a été possible de trouver la cause génétique d’une famille comportant deux membres atteints d’atrophie congénitale du cervelet, où le symptôme prédominant est l’ataxie. Le séquençage de l’exome a permis la mise en évidence de mutations dans le gène PMM2, déjà connues pour cause le syndrome des glycoprotéines déficientes en hydrates de carbone. Dans un second temps, il sera question d’un autre désordre du mouvement la paraplégie spastique familiale (PSF). Le chapitre 3 relatera les mutations trouvées dans le gène CYP7B1 dans notre cohorte de patients PSF.

Exploration génomique de la déficience intellectuelle

La déficience intellectuelle (DI) définit un groupe de conditions génétiquement hétérogènes caractérisées par l’apparition de troubles cognitifs précoces chez l’enfant. Elle affecte 1-3% de la population dans les pays industrialisés. La prévalence de la DI est beaucoup plus élevée ailleurs dans le monde, en raison de facteurs sociodémographiques comme le manque de ressources dans le système de santé, la pauvreté et la consanguinité. Des facteurs non-génétiques sont mis en cause dans l’étiologie de la DI ; on estime qu’environ 25% des cas de DI sont d’origine génétique. Traditionnellement, les bases moléculaires de la DI ont été investiguées par des analyses cytogénétiques, les approches de cartographie génétique et le séquençage de gènes candidats ; ces techniques de génétiques classiques sont encore mises à rude épreuve dans l’analyse de maladies complexes comme la DI. La DI liée à l’X a été particulièrement étudiée, avec plus d’une centaine de gènes identifiés uniquement sur le chromosome X. Des mutations hétérozygotes composites sont mises en évidence dans la DI autosomique, dans le contexte d’unions non-consanguines. L’occurrence de ce type de mutations est rare, chez des individus non-apparentés, de sorte que les mutations dominantes de novo sont plus courantes. Des mutations homozygotes sont attendues dans les populations consanguines ou marquées par un effet fondateur. En fait, les bases moléculaires de la DI autosomique ont été presqu’exclusivement étudiées dans le contexte de populations avec des forts taux de consanguinité. L’origine de la DI demeure encore inconnue dans environ 60 % des cas diagnostiqués. En l’absence de facteurs environnementaux associés à la DI chez ces individus, il est possible d’envisager que des facteurs génétiques non identifiés entrent en jeu dans ces cas de DI inexpliqués. Dans ce projet de recherche, nous voulions explorer l’origine génétique de la DI, dans vingt familles, où une transmission de la maladie selon un mode autosomique récessif est suspectée. Nous avons mis de l’avant les techniques de séquençage de nouvelle génération, afin de mettre en évidence les déterminants génétiques de la DI, à l’échelle du génome humain. En fait, nous avons priorisé la capture et le séquençage de l’exome; soient la totalité des régions codantes du génome humain et leurs sites d’épissage flanquants. Dans nos analyses, nous avons ciblé les variants qui ne sont pas rapportés trop fréquemment dans différentes bases de données d’individus contrôles, ces mutations rares cadrent mieux avec une condition comme la DI. Nous avons porté une attention particulière aux mutations autosomiques récessives (homozygotes et hétérozygotes composites) ; nous avons confirmé que ces mutations ségréguent avec une transmission récessive dans la famille à l’étude. Nous avons identifié des mutations dans des gènes pouvant être à l’origine de la DI, dans certaines des familles analysées ; nous avons validé biologiquement l'impact fonctionnel des mutations dans ces gènes candidats, afin de confirmer leur implication dans la pathophysiologie de la DI. Nous avons élucidé les bases moléculaires de la DI dans huit des familles analysées. Nous avons identifié le second cas de patients avec syndrome de cassure chromosomique de Varsovie, caractérisé par des dysfonctions de l’ARN hélicase DDX11. Nous avons montré qu’une perte de l’activité de TBC1D7, une des sous-unités régulatrice du complexe TSC1-TSC2, est à l’origine de la pathologie dans une famille avec DI et mégalencéphalie. Nous avons mis en évidence des mutations pathogéniques dans le gène ASNS, codant pour l’Asparagine synthétase, chez des patients présentant une microcéphalie congénitale et une forme progressive d’encéphalopathie. Nous avons montré que des dysfonctions dans la protéine mitochondriale MAGMAS sont mises en cause dans une condition caractérisée par un retard prononcé dans le développement associé à une forme sévère de dysplasie squelettique. Nous avons identifié une mutation tronquant dans SPTBN2, codant pour la protéine spinocerebellar ataxia 5, dans une famille avec DI et ataxie cérébelleuse. Nous avons également mis en évidence une mutation dans PIGN, un gène impliqué dans la voie de biosynthèse des ancres de glycosylphosphatidylinositol , pouvant être à l’origine de la maladie chez des individus avec épilepsie et hypotonie. Par ailleurs, nous avons identifié une mutation - perte de fonction dans CLPB, codant pour une protéine chaperonne mitochondriale, dans une famille avec encéphalopathie néonatale, hyperekplexie et acidurie 3-méthylglutaconique. Le potentiel diagnostic des techniques de séquençage de nouvelle génération est indéniable ; ces technologies vont révolutionner l’univers de la génétique moléculaire, en permettant d’explorer les bases génétiques des maladies complexes comme la DI.

Comparative mitochondrial genomics toward understanding genetics and evolution of arbuscular mycorrhizal fungi

Les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) sont très répandus dans le sol où ils forment des associations symbiotiques avec la majorité des plantes appelées mycorhizes arbusculaires. Le développement des CMA dépend fortement de la plante hôte, de telle sorte qu'ils ne peuvent vivre à l'état saprotrophique, par conséquent ils sont considérés comme des biotrophes obligatoires. Les CMA forment une lignée évolutive basale des champignons et ils appartiennent au phylum Glomeromycota. Leurs mycélia sont formés d’un réseau d’hyphes cénocytiques dans lesquelles les noyaux et les organites cellulaires peuvent se déplacer librement d’un compartiment à l’autre. Les CMA permettent à la plante hôte de bénéficier d'une meilleure nutrition minérale, grâce au réseau d'hyphes extraradiculaires, qui s'étend au-delà de la zone du sol explorée par les racines. Ces hyphes possèdent une grande capacité d'absorption d’éléments nutritifs qui vont être transportés par ceux-ci jusqu’aux racines. De ce fait, les CMA améliorent la croissance des plantes tout en les protégeant des stresses biotiques et abiotiques. Malgré l’importance des CMA, leurs génétique et évolution demeurent peu connues. Leurs études sont ardues à cause de leur mode de vie qui empêche leur culture en absence des plantes hôtes. En plus leur diversité génétique intra-isolat des génomes nucléaires, complique d’avantage ces études, en particulier le développement des marqueurs moléculaires pour des études biologiques, écologiques ainsi que les fonctions des CMA. C’est pour ces raisons que les génomes mitochondriaux offrent des opportunités et alternatives intéressantes pour étudier les CMA. En effet, les génomes mitochondriaux (mt) publiés à date, ne montrent pas de polymorphismes génétique intra-isolats. Cependant, des exceptions peuvent exister. Pour aller de l’avant avec la génomique mitochondriale, nous avons besoin de générer beaucoup de données de séquençages de l’ADN mitochondrial (ADNmt) afin d’étudier les méchanismes évolutifs, la génétique des population, l’écologie des communautés et la fonction des CMA. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de doctorat consiste à: 1) étudier l’évolution des génomes mt en utilisant l’approche de la génomique comparative au niveau des espèces proches, des isolats ainsi que des espèces phylogénétiquement éloignées chez les CMA; 2) étudier l’hérédité génétique des génomes mt au sein des isolats de l’espèce modèle Rhizophagus irregularis par le biais des anastomoses ; 3) étudier l’organisation des ADNmt et les gènes mt pour le développement des marqueurs moléculaires pour des études phylogénétiques. Nous avons utilisé l’approche dite ‘whole genome shotgun’ en pyroséquençage 454 et Illumina HiSeq pour séquencer plusieurs taxons de CMA sélectionnés selon leur importance et leur disponibilité. Les assemblages de novo, le séquençage conventionnel Sanger, l’annotation et la génomique comparative ont été réalisés pour caractériser des ADNmt complets. Nous avons découvert plusieurs mécanismes évolutifs intéressant chez l’espèce Gigaspora rosea dans laquelle le génome mt est complètement remanié en comparaison avec Rhizophagus irregularis isolat DAOM 197198. En plus nous avons mis en évidence que deux gènes cox1 et rns sont fragmentés en deux morceaux. Nous avons démontré que les ARN transcrits les deux fragments de cox1 se relient entre eux par épissage en trans ‘Trans-splicing’ à l’aide de l’ARN du gene nad5 I3 qui met ensemble les deux ARN cox1.1 et cox1.2 en formant un ARN complet et fonctionnel. Nous avons aussi trouvé une organisation de l’ADNmt très particulière chez l’espèce Rhizophagus sp. Isolat DAOM 213198 dont le génome mt est constitué par deux chromosomes circulaires. En plus nous avons trouvé une quantité considérable des séquences apparentées aux plasmides ‘plasmid-related sequences’ chez les Glomeraceae par rapport aux Gigasporaceae, contribuant ainsi à une évolution rapide des ADNmt chez les Glomeromycota. Nous avons aussi séquencé plusieurs isolats de l’espèces R. irregularis et Rhizophagus sp. pour décortiquer leur position phylogénéque et inférer des relations évolutives entre celles-ci. La comparaison génomique mt nous montré l’existence de plusieurs éléments mobiles comme : des cadres de lecture ‘open reading frames (mORFs)’, des séquences courtes inversées ‘short inverted repeats (SIRs)’, et des séquences apparentées aux plasimdes ‘plasmid-related sequences (dpo)’ qui impactent l’ordre des gènes mt et permettent le remaniement chromosomiques des ADNmt. Tous ces divers mécanismes évolutifs observés au niveau des isolats, nous permettent de développer des marqueurs moléculaires spécifiques à chaque isolat ou espèce de CMA. Les données générées dans mon projet de doctorat ont permis d’avancer les connaissances fondamentales des génomes mitochondriaux non seulement chez les Glomeromycètes, mais aussi de chez le règne des Fungi et les eucaryotes en général. Les trousses moléculaires développées dans ce projet peuvent servir à des études de la génétique des populations, des échanges génétiques et l’écologie des CMA ce qui va contribuer à la compréhension du rôle primorial des CMA en agriculture et environnement.

Typage de la classe génotypique du gène PRDM9 à partir de données de séquençage de Nouvelle Génération

Les positions des évènements de recombinaison s’agrègent ensemble, formant des hotspots déterminés en partie par la protéine à évolution rapide PRDM9. En particulier, ces positions de hotspots sont déterminées par le domaine de doigts de zinc (ZnF) de PRDM9 qui reconnait certains motifs d’ADN. Les allèles de PRDM9 contenant le ZnF de type k ont été préalablement associés avec une cohorte de patients affectés par la leucémie aigüe lymphoblastique. Les allèles de PRDM9 sont difficiles à identifier à partir de données de séquençage de nouvelle génération (NGS), en raison de leur nature répétitive. Dans ce projet, nous proposons une méthode permettant la caractérisation d’allèles de PRDM9 à partir de données de NGS, qui identifie le nombre d’allèles contenant un type spécifique de ZnF. Cette méthode est basée sur la corrélation entre les profils représentant le nombre de séquences nucléotidiques uniques à chaque ZnF retrouvés chez les lectures de NGS simulées sans erreur d’une paire d’allèles et chez les lectures d’un échantillon. La validité des prédictions obtenues par notre méthode est confirmée grâce à analyse basée sur les simulations. Nous confirmons également que la méthode peut correctement identifier le génotype d’allèles de PRDM9 qui n’ont pas encore été identifiés. Nous conduisons une analyse préliminaire identifiant le génotype des allèles de PRDM9 contenant un certain type de ZnF dans une cohorte de patients atteints de glioblastomes multiforme pédiatrique, un cancer du cerveau caractérisé par les mutations récurrentes dans le gène codant pour l’histone H3, la cible de l’activité épigénétique de PRDM9. Cette méthode ouvre la possibilité d’identifier des associations entre certains allèles de PRDM9 et d’autres types de cancers pédiatriques, via l’utilisation de bases de données de NGS de cellules tumorales.