Synthèse et analyse conformationelle de dipeptides contenant l’isostère hydroxyéthylène

Dans ce mémoire, je présente mes études sur une stratégie efficace développée pour la synthèse de cétones homoallyliques substituées à partir de l’addition en cascade de réactifs de Grignard vinyliques substitués sur des α-amino esters catalysée par des sels de cuivre. L’utilisation de ces cétones homoallyliques a permis d’obtenir des mimes peptidiques comprenant un isostère de type hydroxyéthylène du lien amide. L’étape clé de cette stratégie repose sur la synthèse de cétones homoallyliques substituées intermédiaires à partir de la réaction d’additions en cascade catalysée au cuivre, de bromure de β,β-diméthylevinyle magnésium sur des analogues d’esters de la phénylalanine et de la sérine. Les cétones homoallyliques résultantes sont réduites sélectivement en alcool, la liaison double est clivée oxydativement et l’acide carboxylique résultant est couplé à un acide aminé. Afin d’évaluer l’effet qu’ont le remplacement du lien amide central dans un coude β par un hydroxyéthylène et de la présence d’un gem diméthyle sur la chaîne carbonée sur la conformation tridimensionnelle adoptée par les tripeptides générés, des analyses à l’état solide par diffraction aux rayons X, des analyses en solution par la spectroscopie RMN et des expériences de type NOESY ont été réalisées. Ces études ont permis de définir un nouveau type de coude β. La présence de pont hydrogène intramoléculaire et l’effet de restriction de conformation induit par le gem diméthyle, généralement appelé effet Thorpe-Ingold, favorisent la formation d’un coude β.

Développement de peptidomimétiques antagonistes du récepteur de l’interleukine-1β

Dans ce mémoire, je présente mes études sur la synthèse, la caractérisation et l’évaluation biologique de différentes séries d’analogues du D-heptapeptide appelé 101.10, un modulateur négatif allostérique du récepteur de l’interleukine-1β (IL-1β). Sachant que les peptides ont généralement de faibles propriétés pharmacologiques, le but de ce projet portait sur l’examen des structures nécessaires à la bioactivité, la conformation tridimensionnelle de ces derniers afin d’améliorer la droguabilité du peptide parent. Les stratégies d’optimisation du 101.10 utilisées furent : la coupure N- et C-terminale; la substitution par la proline, α-amino-γ-lactame (Agl), β-amino-γ-lactame (Bgl) et α-amino-β-hydroxy-γ-lactame (Hgl); et la rigidification du squelette à l’aide d’un bicycle, l’indolozidin-2-one (I2aa). Afin de clarifier certaines relations de structure-activité, quelques modifications furent apportées au peptide, incluant l’échange de la thréonine pour la valine, la permutation de la stéréochimie de certains résidus clés ainsi que le remplacement de certaines chaînes latérales par un méthyle. Pour pallier aux difficultés de reproductibilité des résultats avec des échantillons provenant de différentes sources, des études sur l’identité du contre-anion et la pureté du peptide furent conduites. Afin d’évaluer l’effet des modifications sur la conformation aqueuse et l’activité biologique du peptide, des analyses de dichroïsme circulaire et des tests in vitro mesurant l’inhibition de certains effets de l’IL-1β furent effectués. Ces essais cellulaires comportaient l’inhibition de la prolifération de cellules immunes et de l’activation des voies de signalisation inflammatoires du facteur nucléaire κB (NF-κB) et de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK), toutes deux stimulées par l’IL-1β. La compilation de ces données a permis de déceler certaines tendances entre la structure, la conformation et l’activité anti-IL-1β des peptidomimétiques.

Étude de tour béta actif dans les modulateurs allostériques du récepteur de la prostaglandine F2alpha

La naissance avant terme constitue un important problème de santé périnatale partout dans le monde. Chaque année près de 15 millions de bébés naissent prématurément. Notre laboratoire s’intéresse depuis une décennie à la conception et le développement de nouvelles classes thérapeutiques (appelés agents tocolytiques) capables d’inhiber les contractions utérines et prolonger le temps de gestation. Due à son implication directe dans le déclanchement des contractions utérines, la prostaglandine F2α (FP) est devenue notre cible de choix. Le PDC 113.824 et aza-glycinyl-proline sont apparus comme des inhibiteurs allostériques puissants du récepteur de la prostaglandine F2α, capables de prolonger la durée de gestation chez les souris. Le travail réalisé au cours de ce mémoire a pour objectif d’étudier le tour β nécessaire pour la reconnaissance sur le récepteur de la prostaglandine F2α. Dans la conception de mime peptidique sélectif efficace et puissant, le repliement β est un élément structural essentiel pour le maintien ou l’amélioration de l’activité du mime peptidique. Les études conformationelles du PDC113.824 et l’aza-glycinyl-proline montrent que les squelettes centraux de ces mimes peptidiques pourraient adopter essentiellement un tour β de type I ou II`, ce qui suggère l’implication des deux types de tours dans l’activité biologique. La synthèse de mimes peptidiques adoptant le tour β de type I et II` est devenue une stratégie logique dans la recherche de nouveaux agents tocolytiques. Au cours de ces études quatre analogues du PDC113.824 ont été synthétisés, un azabicyclo[5.3.0]alkanone et un dipeptide macrocyclique (mimes du tours β de type I) pour étudier l’implication du tour β type I. Par la suite la synthèse de glycinyl-proline et le D-alaninyl-proline (des mimes du tour β du type II`) a été réalisée afin de valider l’implication du tour β type II` dans la reconnaissance sur le récepteur. Nous avons utilisé une stratégie de synthèse efficace pour obtenir les deux analogues (azabicyclo [5.3.0]alkanone et dipeptides macrocycles) à partir d’un intermédiaire commun, en procédant par une cyclisation transannulaire diastéréosélective du tétra-peptide.

Étude du mécanisme de repliement de l'ubiquitine de levure par l'introduction de contraintes conformationnelles dans son état dénaturé

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude du mécanisme de repliement de l'ubiquitine de levure par l'introduction de contraintes conformationnelles dans son état dénaturé

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A family of simple benzene 1,3,5-tricarboxamide (BTA) aromatic carboxylic acid hydrogels.

We present the characterisation of a hydrogel forming family of benzene 1,3,5-tricarboxamide (BTA) aromatic carboxylic acid derivatives. The simple, easy to synthesise compounds presented here exhibit consistent gel formation at low concentrations through the use of a pH trigger.

Hydrothermal synthesis of the two-dimensional coordination polymer {[Fe(phen)(OH)](bta)(0.5)}(n) (phen=1,10-phenanthroline, bta=benzene-1,2,4,5-tetracaboxylate)

The title two-dimensional coordination polymer was synthesised and characterised by X-ray diffraction analysis.

The BTA stat test:A tumor marker for the detection of upper tract transitional cell carcinoma

Objectives. To conduct a prospective evaluation to determine the utility of the BTA stat test in the detection of upper tract transitional cell carcinoma (UTTCC). Monitoring for UTTCC currently relies on invasive procedures such as upper tract imaging, ureteral washing cytology (UWC) and/or ureteroscopy, or voided urine cytology (VUC). The BTA stat test is a sensitive qualitative immunoassay that detects human complement factor H-related protein in voided urine.

Methods. A total of 81 patients participated, 27 with histopathologically confirmed UTTCC, 26 with upper tract calculi, and 28 with microscopic hematuria but no evidence of urologic disease. Voided specimens collected before surgery or treatment were tested with the BTA stat test and VUC. UWC was performed in specimens collected by a ureteral catheter.

Results. The BTA stat test was significantly more sensitive and specific than VUC or UWC. The overall sensitivity for each was 82%, 11%, and 48%; the specificity was 89%, 54%, and 33%. The positive predictive value for the BTA stat test was 79% and the negative predictive value was 91%, both the highest of the three tests.

Conclusions. The BTA stat test was superior to VUC and UWC in the detection of UTTCC. These results may support the adoption of a less aggressive follow-up policy when monitoring for UTTCC when the BTA stat result is negative. If cystoscopy is negative and the BTA stat test is positive, upper tract investigations should be expedited and, if the bladder is in place, bladder biopsies performed. (C) 2001, Elsevier Science Inc.

Flores salesianas : ramillete escogido en la vida de la Bta. Margarita María Alacoque dedicado a las almas devotas del Sagrado Corazón de Jesús.

UANL

Caractérisation de la sous-unité bêta du translocon chez la levure Schizosaccharomyces pombe

La sécrétion des protéines est un processus essentiel à la vie. Chez les eucaryotes, les protéines sécrétées transitent dans le réticulum endoplasmique par le pore de translocation. Le translocon est composé de trois sous-unités fondamentales nommées Sec61α, β et γ chez les mammifères, ou Sec61p, Sbh1p et Sss1p chez les levures. Tandis que le rôle des sous-unités α et γ est bien connu, celui de la sous-unité β demeure énigmatique. Plusieurs phénotypes distincts sont associés à cette protéine dans différents organismes, mais le haut niveau de conservation de séquence suggère plutôt une fonction universelle conservée. Récemment, Feng et al. (2007) ont montré que le domaine transmembranaire (TMD) de Sbh1p était suffisant pour complémenter plusieurs phénotypes associés à la délétion du gène chez Saccharomyces cerevisiae, suggérant un rôle important de cette région. L’objectif de mon projet de recherche consiste à étudier la fonction biologique de la sous-unité β du translocon et de son TMD chez Schizosaccharomyces pombe. Dans cette levure, j’ai découvert que le gène sbh1+ n’était pas essentiel à la viabilité à 30oC, mais qu’il était requis pour la croissance à basse température. La délétion de sbh1+ entraîne une sensibilité aux stress de la paroi cellulaire et une diminution de la sécrétion des protéines à 23oC. La surexpression de Sbh1p diminue elle aussi la sécrétion des protéines et altère la morphologie cellulaire. Ces phénotypes sont distincts de ceux observés chez S. cerevisiae, où la délétion des deux paralogues de Sec61β entraîne une sensibilité à haute température plutôt qu’à basse température. Malgré cela, les homologues de Sec61β de S. pombe et de S. cerevisiae sont tout deux capables de complémenter la thermosensibilité respective de chaque levure. La complémentation est possible même avec l’homologue humain de Sec61β, indiquant la conservation d’une fonction de Sec61β de la levure à l’homme. Remarquablement, le TMD de Sec61β de S. pombe, de S. cerevisiae et de l’humain sont suffisants pour complémenter la délétion génomique autant chez la levure à fission que chez la levure à bourgeons. Globalement, ces observations indiquent que le TMD de Sec61β exerce une fonction cellulaire conservée à travers les espèces.

Étude de l'implication des navettes du pyruvate découlant du métabolisme mitochondrial du glucose dans la régulation de la sécrétion d'insuline par les cellules bêta pancréatiques

Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par une résistance à l’insuline des tissus périphériques et par une incapacité des cellules β pancréatiques à sécréter les niveaux d’insuline appropriés afin de compenser pour cette résistance. Pour mieux comprendre les mécanismes déficients dans les cellules β des patients diabétiques, il est nécessaire de comprendre et de définir les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Dans les cellules β pancréatiques, le métabolisme du glucose conduit à la production de facteurs de couplage métabolique, comme l’ATP, nécessaires à la régulation de l’exocytose des vésicules d’insuline. Le mécanisme par lequel la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose déclenche l’exocytose des vésicules d’insuline est bien décrit dans la littérature. Cependant, il ne peut à lui seul réguler adéquatement la sécrétion d’insuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage métaboliques qui ont été suggérés afin de relier le métabolisme du glucose à la régulation de la sécrétion d’insuline. Les mécanismes impliqués demeurent cependant à être caractérisés. Le but de la présente thèse était de déterminer l’implication des navettes du pyruvate, découlant du métabolisme mitochondrial du glucose, dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans les cellules β, les navettes du pyruvate découlent de la combinaison des processus d’anaplérose et de cataplérose et permettent la transduction des signaux métaboliques provenant du métabolisme du glucose. Dans une première étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la navette pyruvate/citrate dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose, puisque cette navette conduit à la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage métabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux métabolique à travers la glycolyse en réoxydation le NADH. Une étude effectuée précédemment dans notre laboratoire avait suggéré la présence de cette navette dans les cellules β pancréatique. Afin de tester notre hypothèse, nous avons ciblé trois étapes de cette navette dans la lignée cellulaire β pancréatique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et l’activité de l’ATP-citrate lyase (ACL) et l’enzyme malique (MEc), deux enzymes clés de la navette pyruvate/citrate. L’inhibition de chacune de ces étapes par l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interférant a corrélé avec une réduction significative de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Les résultats obtenus suggèrent que la navette pyruvate/citrate joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Parallèlement à notre étude, deux autres groupes de recherche ont suggéré que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate étaient aussi importantes pour la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ainsi, trois navettes découlant du métabolisme mitochondrial du glucose pourraient être impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’insuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage métabolique possiblement très important pour la sécrétion d’insuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est formé par MEc, alors que l’isocitrate déshydrogénase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate. Dans notre première étude, nous avions démontré l’importance de l’expression de ME pour la sécrétion adéquate d’insuline en réponse au glucose. Dans notre deuxième étude, nous avons testé l’implication de IDHc dans les mécanismes de régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. La diminution de l’expression de IDHc dans les INS 832/13 a stimulé la sécrétion d’insuline en réponse au glucose par un mécanisme indépendant de la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose. Ce résultat a ensuite été confirmé dans les cellules dispersées des îlots pancréatiques de rat. Nous avons aussi observé dans notre modèle que l’incorporation du glucose en acides gras était augmentée, suggérant que la diminution de l’activité de IDHc favorise la redirection du métabolisme de l’isocitrate à travers la navette pyruvate/citrate. Un mécanisme de compensation à travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la sécrétion d’insuline observée en réponse à la diminution de l’expression de IDHc. Les travaux effectués dans cette deuxième étude remettent en question l’implication de l’activité de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate, dans la transduction des signaux métaboliques reliant le métabolisme du glucose à la sécrétion d’insuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate à conduire à la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules β. Le malonyl-CoA régule le métabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transférase 1, l’enzyme limitante dans l’oxydation des acides gras. Ainsi, l’élévation des niveaux de malonyl-CoA en réponse au glucose entraîne une redirection du métabolisme des acides gras vers les processus d’estérification puis de lipolyse. Plus précisément, les acides gras sont métabolisés à travers le cycle des triglycérides/acides gras libres (qui combinent les voies métaboliques d’estérification et de lipolyse), afin de produire des molécules lipidiques signalétiques nécessaires à la modulation de la sécrétion d’insuline. Des études effectuées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que l’activité lipolytique de HSL (de l’anglais hormone-sensitive lipase) était importante, mais non suffisante, pour la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans une étude complémentaire, nous nous sommes intéressés au rôle d’une autre lipase, soit ATGL (de l’anglais adipose triglyceride lipase), dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et aux acides gras. Nous avons démontré que ATGL est exprimé dans les cellules β pancréatiques et que son activité contribue significativement à la lipolyse. Une réduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interférant ou son absence dans les îlots pancréatiques de souris déficientes en ATGL a conduit à une réduction de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose en présence ou en absence d’acides gras. Ces résultats appuient l’hypothèse que la lipolyse est une composante importante de la régulation de la sécrétion d’insuline dans les cellules β pancréatiques. En conclusion, les résultats obtenus dans cette thèse suggèrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ce mécanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du métabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question l’implication de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Le rôle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant à être déterminé. Finalement, nos travaux ont aussi démontré un rôle pour ATGL et la lipolyse dans les mécanismes de couplage métabolique régulant la sécrétion d’insuline.

Évaluation des désordres cardiovasculaires chez des souris bêta-thalassémiques

L’hémoglobine est une protéine contenue dans les globules rouges dont la principale fonction est le transport de l’oxygène. Chaque molécule d’hémoglobine est un tétramère constitué de deux paires de globines identiques de type α et β. La β-thalassémie est une maladie génétique hématopoïétique provenant de mutations du gène encodant l'hémoglobine. Ce désordre se caractérise par une diminution ou une absence totale de la synthèse de la chaîne β-globine résultant principalement en une anémie hémolytique sévère ainsi que des complications multisystémiques, telles que la splénomégalie, des déformations osseuses et une dysfonction hépatique et rénale. Actuellement, les transfusions sanguines chroniques représentent le traitement standard des patients β-thalassémiques. Cette thérapie nécessite l’administration conjointe d’un traitement chélateur de fer puisqu’elle entraîne une accumulation pathologique du fer, considéré à ce jour comme la source principale des complications cardiovasculaires de la β-thalassémie. Néanmoins, malgré le traitement efficace de la surcharge de fer transfusionnelle, l’insuffisance cardiaque demeure encore la principale cause de mortalité chez les patients atteints de β-thalassémie. Cette observation indique possiblement la présence d’un mécanisme complémentaire dans le développement de la physiopathologie cardiaque β-thalassémique. L’objectif du présent projet consistait donc à étudier les altérations cardiovasculaires de la β-thalassémie indépendamment de la surcharge de fer transfusionnelle. En utilisant un modèle murin non-transfusé de la β-thalassémie majeure, nous avons d’abord évalué in vivo, par méthode d’imagerie novatrice échographique à haute fréquence, les propriétés hémodynamiques vasculaires. Nos résultats d’index de Pourcelot ainsi que de résistance vasculaire périphérique totale ont démontré une perturbation de l’écoulement microcirculatoire chez les souris β-thalassémiques non-transfusées. Subséquemment, nous avons étudié la fonction endothéliale de régulation du tonus vasculaire de vaisseaux mésentériques isolés. Nos résultats ont révélé un dysfonctionnement de la réponse vasodilatatrice dépendante de l’endothélium chez les souris β-thalassémiques malgré une augmentation de l’expression de l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote ainsi qu’un remodelage de la carotide commune caractérisé par un épaississement de la paroi vasculaire. Finalement, notre étude échocardiographique de la fonction et la morphologie cardiaque a montré, chez les souris β-thalassémiques, le développement d’une hypertrophie et une dysfonction ventriculaire gauche en l’absence de transfusions sanguines chroniques ou de dépôts directs de fer dans le myocarde. L’ensemble des résultats présentés dans le cadre de cette thèse indique la présence d’une pathologie cardiovasculaire chez les souris β-thalassémiques non-transfusés. Nos travaux permettent de proposer un mécanisme de la pathophysiologie cardiovasculaire β-thalassémique, indépendant de la charge de fer transfusionnelle, impliquant les effets compensatoires d’une anémie chronique combinés à une vasculopathie complexe initiée par les érythrocytes endommagés et l’hémolyse intravasculaire.

L’arbre de régression multivariable et les modèles linéaires généralisés revisités : applications à l’étude de la diversité bêta et à l’estimation de la biomasse d’arbres tropicaux

En écologie, dans le cadre par exemple d’études des services fournis par les écosystèmes, les modélisations descriptive, explicative et prédictive ont toutes trois leur place distincte. Certaines situations bien précises requièrent soit l’un soit l’autre de ces types de modélisation ; le bon choix s’impose afin de pouvoir faire du modèle un usage conforme aux objectifs de l’étude. Dans le cadre de ce travail, nous explorons dans un premier temps le pouvoir explicatif de l’arbre de régression multivariable (ARM). Cette méthode de modélisation est basée sur un algorithme récursif de bipartition et une méthode de rééchantillonage permettant l’élagage du modèle final, qui est un arbre, afin d’obtenir le modèle produisant les meilleures prédictions. Cette analyse asymétrique à deux tableaux permet l’obtention de groupes homogènes d’objets du tableau réponse, les divisions entre les groupes correspondant à des points de coupure des variables du tableau explicatif marquant les changements les plus abrupts de la réponse. Nous démontrons qu’afin de calculer le pouvoir explicatif de l’ARM, on doit définir un coefficient de détermination ajusté dans lequel les degrés de liberté du modèle sont estimés à l’aide d’un algorithme. Cette estimation du coefficient de détermination de la population est pratiquement non biaisée. Puisque l’ARM sous-tend des prémisses de discontinuité alors que l’analyse canonique de redondance (ACR) modélise des gradients linéaires continus, la comparaison de leur pouvoir explicatif respectif permet entre autres de distinguer quel type de patron la réponse suit en fonction des variables explicatives. La comparaison du pouvoir explicatif entre l’ACR et l’ARM a été motivée par l’utilisation extensive de l’ACR afin d’étudier la diversité bêta. Toujours dans une optique explicative, nous définissons une nouvelle procédure appelée l’arbre de régression multivariable en cascade (ARMC) qui permet de construire un modèle tout en imposant un ordre hiérarchique aux hypothèses à l’étude. Cette nouvelle procédure permet d’entreprendre l’étude de l’effet hiérarchisé de deux jeux de variables explicatives, principal et subordonné, puis de calculer leur pouvoir explicatif. L’interprétation du modèle final se fait comme dans une MANOVA hiérarchique. On peut trouver dans les résultats de cette analyse des informations supplémentaires quant aux liens qui existent entre la réponse et les variables explicatives, par exemple des interactions entres les deux jeux explicatifs qui n’étaient pas mises en évidence par l’analyse ARM usuelle. D’autre part, on étudie le pouvoir prédictif des modèles linéaires généralisés en modélisant la biomasse de différentes espèces d’arbre tropicaux en fonction de certaines de leurs mesures allométriques. Plus particulièrement, nous examinons la capacité des structures d’erreur gaussienne et gamma à fournir les prédictions les plus précises. Nous montrons que pour une espèce en particulier, le pouvoir prédictif d’un modèle faisant usage de la structure d’erreur gamma est supérieur. Cette étude s’insère dans un cadre pratique et se veut un exemple pour les gestionnaires voulant estimer précisément la capture du carbone par des plantations d’arbres tropicaux. Nos conclusions pourraient faire partie intégrante d’un programme de réduction des émissions de carbone par les changements d’utilisation des terres.

Application des librairies de codons dégénérés à l'étude du mécanisme de repliement et de la stabilisation de la structure du domaine liant ras de Raf

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.