Die Regulation des Enzyms Paraoxonase-2 sowie dessen Einfluss auf die Hämatopoese

In der vorliegenden Arbeit wurden durch den Einsatz von drei unabhängigen Methoden Proteine und Faktoren identifiziert, die die PON2-mRNA-Expression beeinflussen. Anhand der erhaltenen Faktoren wurden verstärkt solche ausgewählt, die eine Rolle in der Tumorbiologie spielen. Unter Verwendung verschiedener Zellmodelle wurde schließlich der Effekt dieser Faktoren auf die PON2-Expression analysiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die PON2-Expression in K562-Zellen durch den PI3K / Akt-Signalweg, der in vielen Tumoren übermäßig aktiviert vorliegt, gesteigert wird. Auch eine Beteiligung des Wnt / β-Catenin-Signalweges kann nicht ausgeschlossen werden. Pharmakologische Inhibitoren von GSK-3β, einer Kinase die in beiden Signalwegen involviert ist, führt zu einer Steigerung der PON2-Expression durch den Transkriptionsfaktor LEF-1. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Familie der FoxO-Transkriptionsfaktoren an der Regulation der PON2-Expression in K562-Zellen beteiligt sind, wenn gleich es für die jeweiligen FoxO-Isoformen Unterschiede gibt.rnIm Hinblick auf die Assoziation von PON2 mit Leukämien wurde anhand eines PON2-/--Mausmodells, der Einfluss von PON2 auf die Hämatopoese untersucht. Dabei wurden signifikante Unterschiede in einigen Stammzellkompartimenten festgestellt. Ferner scheint PON2 die Entwicklung von Erythrozyten und Thrombozyten zu beeinflussen. Dies äußert sich in einer offensichtlichen Splenomegalie, zumindest bei alten weiblichen PON2-/--Mäusen.rnAbschließend wurde zur Generierung eines konditionalen PON2-Überexpressionsmausmodells erfolgreich ein Gene-Targeting-Vektor entwickelt. Durch eine gewebe-, zeit- und zellspezifische Steigerung der PON2-Expression ist es möglich, den Effekt einer PON2-Überexpression im Hinblick auf verschiedene Erkrankungen zu untersuchen.rnBisher war wenig über die Regulation des humanen PON2 bekannt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen erstmals, durch welche Signalwege und Transkriptionsfaktoren PON2 in Leukämiezellen reguliert wird. Im Hinblick auf die Rolle von PON2 in der Tumorbiologie ist es erstmals möglich, die PON2-Expression gezielt durch die Inhibition bzw. Aktivierung der PON2-regulierenden Faktoren zu beeinflussen, und damit neue Wege in der Krebstherapie zu beschreiten. rn

Expression und Funktion der Paraoxonase-2 im Hinblick auf oxidativen Stress im Gefäßsystem

Erhöhte Spiegel von oxidativem Stress bedingen Atherosklerose, eine Krankheit die über 50% aller Todesfälle in der westlichen Welt ausmacht. Es ist entscheidend Mechanismen zur Abwehr dieser Krankheit zu ergründen.rnDa genetische Polymorphismen des körpereigenen Enzyms Paraoxonase 2 (PON2) mit kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert sind, wurden ihre Regulation und potentiell antioxidativen Funktionen in vaskulären Zellen analysiert. Mittels verschiedener molekularbiologischer Methoden konnte ich erstmals zeigen, dass PON2 in vaskulären Zellen vornehmlich subzellulär im ER lokalisiert ist. Anhand verschiedener Experimente wurde PON2 als potenter Faktor zur Reduktion von ROS identifiziert. Erhöhte ROS-Spiegel führen zur Aktivierung eines als unfolded protein response (UPR) bekannten ER-Stress-Signalwegs. Dieser ist neben Atherosklerose in eine Vielzahl von Erkrankungen involviert und hat kritischen Einfluss auf das Überleben oder Absterben von Zellen. Durchgeführte Promoter-Reporter Studien bewiesen die Induktion der Protein-Expression von PON2 nach Aktivierung des UPR-Signalwegs, was als kompensatorischer Mechanismus der Zelle zur Vermeidung UPR-induzierter Apoptose verstanden werden könnte. PON2 wehrt oxidativen Stress und die UPR-induzierte Apoptose ab und ist ein protektiver Faktor vor Atherosklerose.rnIn einem Krebsmodell könnte PON2 aber als antiapoptotischer Faktor entscheidend am Überleben von Tumorzellen beteiligt sein. Gerade diese beiden gegensätzlichen Aspekte der antiapoptotischen Funktion des Proteins zeigen die Notwendigkeit für weitere Untersuchungen zu PON2 auf.rn

Der enzymatische und anti-oxidative Mechanismus des anti-atherogenen Enzyms Paraoxonase-2

Das humane Enzym PON2 ist in eine Vielzahl pathophysiologischer Prozesse involviert und ist durch zwei Funktionen gekennzeichnet - eine enzymatische Laktonase-Aktivität und eine anti-oxidative Aktivität. Durch die Laktonase-Aktivität hydrolysiert PON2 vorwiegend das bakterielle Signalmolekül 3oxoC12. PON2 ist als Bestandteil des angeborenen Immunsystems anzusehen und trägt wahrscheinlich zur Immunabwehr gegen Infektionen mit den human-pathogenen Pseudomonas aeruginosa Bakterien bei. Durch die anti-oxidative Aktivität vermindert PON2 oxidative Schäden und verringert redox-abhängige pro-apoptotische Stimulation. Diese einzigartige Funktion von PON2 ist jedoch ambivalent zu betrachten, da hohe PON2-Spiegel zwar Arteriosklerose reduzieren können, aber im Verdacht stehen Tumorzellen zu stabilisieren.rnIn dieser Arbeit wurden die noch unbekannten Mechanismen und der Zusammenhang der enzymatischen und der anti-oxidativen Aktivität analysiert. In diesem Rahmen wurde gezeigt, dass PON2 spezifisch die Superoxidfreisetzung an Komplex I und III der Atmungskette in der inneren Mitochondrienmembran reduzieren kann. PON2 veränderte dabei weder die Aktivitäten der Superoxiddismutasen noch die Cytochrom C-Expression. Weiterhin konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass PON2 O2- nicht direkt abbaut, sondern vielmehr dessen Bildung verhindert. Diese Erkenntnisse implizieren, dass PON2 die anti-oxidative Aktivität über eine Beeinflussung des Quinon-Pools vermittelt. Anhand von verschiedenen Punktmutationen konnte gezeigt werden, dass die Histidinreste-114 und -133 für die Laktonase-Aktivität essentiell sind. Weiterhin wurden die Glykosylierungsstellen von PON2 identifiziert und gezeigt, dass die Glykosylierung, nicht aber der natürliche Polymorphismus Ser/Cys311 für die Laktonase-Aktivität von Bedeutung ist. Von besonderer Bedeutung ist, dass keine dieser Mutationen die anti-oxidative Aktivität beeinflusste, wodurch erstmals die Unabhängigkeit der beiden Funktionen von PON2 gezeigt werden konnte. rnEs war bekannt, dass PON2 gegen intrinsische und ER-Stress-induzierte Apoptose schützt. Die Spezifität der anti-oxidativen / anti-apoptotischen Wirkung wurde hier an einem weiteren pathophysiologischen Modell untersucht. 7-Ketocholesterol (7-KC) ist der Hauptbestandteil des pro-arteriosklerotischen oxLDL und verursacht in Zellen des Gefäßsystems ER-Stress, oxidativen Stress und Apoptose. Unerwarteterweise konnte PON2 Endothelzellen nicht gegen den 7-KC-induzierten Zelltod schützen. Mehrere unabhängige experimentelle Ansätze belegen, dass 7-KC in Endothelzellen im Gegensatz zu Gefäßmuskelzellen den Zelltod über Autophagie und nicht über ER-Stress oder intrinsische Apoptose bewirkt. Weiterhin führt 7-KC, wie auch 3oxoC12 und Thapsigargin zu einem Abbau der PON2-mRNA, die über die 5’UTR der PON2-mRNA vermittelt wird. Diese Arbeit vermittelt detaillierte mechanistische Einsichten in die Funktionen von PON2, die für ihre Rolle bei Arteriosklerose, in der körpereigenen Immunabwehr und bei Krebs entscheidend sind.rn

Die Rolle der humanen Enzyme Paraoxonase-2 und -3 bei Krebserkrankungen und Pseudomonas-Infektionen

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Charakterisierung molekularer Funktionen humaner Paraoxonase (PON) Enzyme, insbesondere die der Proteine PON2 und PON3 im Hinblick auf medizinisch-relevante Fragestellungen. Zum einen wurde die Rolle von PON3 in der Tumorgenese und zum anderen eine mögliche Schutzfunktion von PON2 und PON3 gegenüber P. aeruginosa Infektionen untersucht. Bereits seit dem Jahr 2000 ist die anti-oxidative Eigenschaft von PON3 bekannt, jedoch war der zugrundeliegende Mechanismus bisher ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PON3 die Superoxid-Entstehung in den Mitochondrien abschwächt, wobei sie ihre anti-oxidative Eigenschaft vermutlich durch eine direkte Coenzym Q10-Interaktion in der inneren mitochondrialen Membran vermittelt. Dies führt zu weniger oxidativen Stress, zur Abschwächung mitochondrial-induzierter apoptotischer Signalwege und zur erhöhten Resistenz gegenüber Chemotherapeutika. Gleichzeitig wurde demonstriert, dass sich Tumorzellen diese anti-oxidative Eigenschaft zu Nutze machen. PON3 war in zahlreichen Tumorgeweben überexprimiert. Es konnte eine mögliche Funktion von PON3 als Tumormarker und Angriffspunkt in der Krebstherapie aufgezeigt werden. Die hier erlangten Daten liefern wertvolle Hinweise auf die Rolle von PON3 in Krebserkrankungen, welche eine Basis für zukünftige Analysen darstellen, die der Entwicklung neuer Krebstherapien dienen könnten. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit der gegenseitigen Beeinflussung der Enzyme PON2 / PON3 und der für P.aeruginosa essentiellen Virulenzfaktoren Pyocyanin (PCN) und dem Lacton 3OC12. Erstmalig wurde gezeigt, dass PON3 zellschädigende PCN-Effekte abschwächen kann, nämlich die PCN-induzierte Superoxid-Produktion, NF-kB-Aktivierung und IL-8-Sekretion. PON2 schützt in gleicher Weise gegen PCN und hydrolysiert zugleich noch das Lacton 3OC12. Folglich sind PON2 und PON3 wichtige Bestandteile der angeborenen Immunität, werden jedoch durch eine 3OC12-induzierte Ca2+-Mobilisation inaktiviert. Weitere Analysen ergaben, dass die PON2-Inaktivierung wahrscheinlich über einen Ca2+ / Calcineurin / Calmodulin-abhängigen Signalweg erfolgt, welcher eine offenbar regulative Serin311-Dephosphorylierung in PON2 vermittelt. Ähnliches könnte für PON3 gelten und wird derzeit erforscht, da eine Stabilisierung der enzymatischen Aktivitäten von PON2 und PON3 der bakteriellen Virulenz entscheidend entgegen wirken könnte.

The relationship between children's emotional and cognitive self-regulation at 2 to 3 years and prosocial behavior in the early years of school

This study used data from Growing Up in Australia: The Longitudinal Study of Australian Children (LSAC) to investigate how parent report of children’s emotional and cognitive regulation at age 2-3 years was associated with teacher ratings of children’s prosocial behaviors in the early years of school. A sample of 2,392 children was drawn from the LSAC Birth Cohort for the analyses. The analyses used structural equation modeling to estimate parameters of the relationships between key variables. Within the model, estimates of mother-reported emotional and cognitive regulation at age 2 to 3 years were significantly associated with teacher-reported prosocial behavior at 6 to 7 years. Emotional regulation was a slightly stronger indicator of prosocial behavior than cognitive regulation. Being female and from a family with a higher socioeconomic position were also associated with higher levels of prosocial behavior. Results are discussed in relation to the role of early childhood teachers in fostering children’s self-regulatory behaviors and in providing environments in which empathic and prosocial behaviors are modeled, guided, and scaffolded so that foundations are laid for caring behaviors to be understood and internalized by children.

Two papers on the effects of mandatory deposits on beverage containers. Paper 1. Employment effects of the mandatory deposit regulation. Paper 2. Employment effects of a ban on nonreturnable beverage containers in Minnesota

Mode of access: Internet.

The Economic impact of proposed regulation R82-2 : atomic radiation regulations /

Project no. 83/7010.

The Neurofibromatosis 2 tumor suppressor merlin in cytoskeleton organization and cell cycle regulation

Neurofibromatosis 2 (NF2) is a dominantly inherited disorder, which predisposes to multiple tumours of the nervous system, typically schwannomas and meningiomas. Biallelic inactivation of the NF2 gene occurs both in sporadic and NF2-related schwannomas and in most meningiomas. The NF2 gene product merlin (or schwannomin) is structurally related to the ERM proteins, ezrin, radixin and moesin, which act as molecular linkers between the actin cytoskeleton and the plasma membrane. Merlin is a tumor suppressor that participates in cell cycle regulation. Merlin s phosphorylation status appears to be associated with its tumour suppressor activity, i.e. non-phosphorylated merlin functions as a tumour suppressor, whereas protein phosphorylation results in loss of functional activity. This thesis study was initiated to investigate merlin s role as a tumor suppressor and growth inhibitor. These studies show, that like many other tumor suppressors, also merlin is targeted to the nucleus at some stages of the cell cycle. Merlin s nuclear localization is regulated by cell cycle phase, contact inhibition and adhesion. In addition, a potential nuclear binding partner for merlin was identified, Human Enhancer of Invasion 10 (HEI10), a cyclin B interacting protein. Many tumor suppressors interact with microtubules and this thesis work shows that also merlin colocalizes with microtubules in mitotic structures. Merlin binds microtubules directly, and increases their polymerization in vitro and in vivo. In addition, primary mouse Schwann cells lacking merlin displays disturbed microtubule cytoskeleton. Fourth part of this thesis work began from the notion that PKA phosphorylates an unidentified site from the merlin N-terminus. Our studies show that serine 10 is a target for PKA and modulation of this residue regulates cytoskeletal organization, lamellipodia formation and cell migration. In summary, this thesis work shows that merlin s role is much more versatile than previously thought. It has a yet unidentified role in the nucleus and it participates in the regulation of both microtubules and the actin cytoskeleton. These studies have led to a better understanding of this enigmatic tumor suppressor, which eventually will aid in the design of specific drugs for the NF2 disease.

Cyclooxygenase-2 protein levels are independent of epidermal growth factor receptor expression or activation in operable non-small cell lung cancer

Both cyclooxygenase (COX)-2 and epidermal growth factor receptor (EGFR) are thought to play important roles in the pathogenesis of non-small cell lung cancer (NSCLC). A number of in vitro studies have postulated a link between EGFR activation and subsequent COX-2 upregulation. The relationship between these factors has not been established in patients with NSCLC. COX-2 and EGFR expression were studied in 172 NSCLC specimens using standard immunohistochemical techniques. Western blotting was used to determine COX-2 and EGFR levels in five NSCLC cell lines. The effect of treatment with EGF on COX-2 expression in A549 cells was assessed. Results: Both EGFR and COX-2 are overexpressed in NSCLC. The predominant pattern of COX-2 and EGFR staining was cytoplasmic. Membranous EGFR staining was seen in 23.3% of cases. There was no relationship between COX-2 and EGFR expression and survival or any clinicopathological features. No correlation was seen between EGFR expression and COX-2 expression in the immunohistochemical series or in the cell lines. Treatment with EGF did not upregulate COX-2 levels in A549 cells, either in serum free or serum-supplemented conditions. Conclusions: Although COX-2 and EGFR are over-expressed in NSCLC neither was of prognostic significance in this series of cases. There is no correlation between these two factors in either tumour samples or cell lines. Although these factors show no correlation in NSCLC, they remain potential, though independent targets for treatment. © 2004 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

Specific Activation of Leukocyte β2 Integrins Lymphocyte Function–associated Antigen-1 and Mac-1 by Chemokines Mediated by Distinct Pathways via the α Subunit Cytoplasmic Domains

We show that CC chemokines induced a sustained increase in monocyte adhesion to intercellular adhesion molecule-1 that was mediated by Mac-1 (αMβ2) but not lymphocyte function–associated antigen-1 (LFA-1; αLβ2). In contrast, staining for an activation epitope revealed a rapid and transient up-regulation of LFA-1 activity by monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in monocytes and Jurkat CCR2 chemokine receptor transfectants or by stromal-derived factor-1α in Jurkat cells. Differential kinetics for activation of Mac-1 (sustained) and LFA-1 (transient) avidity in response to stromal-derived factor-1α were confirmed by expression of αM or αL in αL-deficient Jurkat cells. Moreover, expression of chimeras containing αL and αM cytoplasmic domain exchanges indicated that α cytoplasmic tails conferred the specific mode of regulation. Coexpressing αM or chimeras in mutant Jurkat cells with a “gain of function” phenotype that results in constitutively active LFA-1 demonstrated that Mac-1 was not constitutively active, whereas constitutive activity was mediated via the αL cytoplasmic tail, implying the presence of distinct signaling pathways for LFA-1 and Mac-1. Transendothelial chemotaxis of monocytes in response to MCP-1 was dependent on LFA-1; however, Mac-1 was involved at MCP-1 concentrations stimulating its avidity, showing differential contributions of β2 integrins. Our data suggest that a specific regulation of β2 integrin avidity by chemokines may be important in leukocyte extravasation and may be triggered by distinct activation pathways transduced via the α subunit cytoplasmic domains.