La protéine accessoire Vpu du VIH-1 inhibe l'activité antivirale des pDCs à travers un processus ILT7-dépendant

Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV‐1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN‐1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN­‐1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpu‐deficient HIV-­1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-­1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with anti­‐BST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-­1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDC‐bound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-­1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN‐1 production by pDCs in response to HIV­‐1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV‐1.

Caractérisation de l’activité transcriptionnelle antivirale et immunorégulatrice dépendante de STAT2 et IRF9, mais indépendante de STAT1, induite par la costimulation par TNF

Les cellules épithéliales pulmonaires constituent la première ligne de défense face aux virus respiratoires via la sécrétion de mucus, de peptides, de cytokines et chimiokines qui déterminent l'élimination ou la progression de l’infection. Les principales cytokines antivirales produites par les cellules épithéliales alvéolaires (AEC) sont les interférons (IFN) type I (α/β) et III (λ). La liaison d’IFNβ à son récepteur induit une voie antivirale bien caractérisée qui aboutit à l’activation du complexe ISGF3 (STAT1, STAT2 et IRF9) qui permet la transcription de multiples gènes codant pour des protéines à activité antivirale et immunorégulatrice. Il a récemment été démontré que la costimulation des cellules épithéliales pulmonaires par l’IFNβ et le Tumor Necrosis Factor α (TNFα), également produit lors d’une infection, synergisent pour induire un état antiviral tardif distinct. D’autre part, il a été montré que la synergie entre le TNFα et l'IFNβ induit une voie de signalisation impliquant STAT2 et IRF9, mais indépendante de STAT1 permettant l’expression du gène DUOX2. Notre but est de déterminer l’importance de cette nouvelle voie de signalisation induite par la costimulation du TNFα+IFNβ, impliquant STAT2 et IRF9 indépendamment de STAT1 dans la régulation d’un programme transcriptionnel antiviral et immunorégulateur tardif. Notre premier objectif est de déterminer si des gènes antiviraux et immunorégulateurs qui sont induits par la costimulation par TNFα+IFNβ sont dépendants de la voie STAT2/IRF9, indépendamment de STAT1. En utilisant la technique de qRT-PCR, nous avons identifié 3 gènes immunorégulateurs, CXCL10, IDO et APOBEC3G, induits de manière synergique en réponse à TNFα+IFNβ dans les cellules A549, un modèle de cellules épithéliales pulmonaires. Afin de confirmer que ces gènes sont induits indépendamment de STAT1, nous avons validé leur expression dans la lignée cellulaire U3A déficiente en STAT1. Par l'utilisation d'ARN interférants (ARNi) dirigés contre STAT2 et IRF9, nous avons confirmé que l’induction de ces gènes est dépendante de STAT2 et IRF9. Finalement, l’analyse de l’activité du promoteur de CXCL10 en réponse à TNFα+IFNβ par des essais rapporteurs luciférases a permis de montrer que la régulation se fait au niveau transcriptionnel. Notre deuxième objectif, est de déterminer si STAT6 pourrait remplacer STAT1 dans la voie de signalisation induite par TNFα+IFNβ. En effet, STAT6 est un inducteur connu de l’expression de DUOX2 en réponse à IL4+IL13. Contrairement à notre hypothèse, l’inhibition de STAT6 par ARNi augmente l’expression de DUOX2 en réponse à TNFα+IFNβ suggérant que STAT6 est un régulateur négatif. Nos résultats ont permis de comprendre de manière plus détaillée les mécanismes mis en place dans le développement d’une réponse antivirale. D’autre part, l’étude de l’effet de l’IFNβ et du TNFα est également pertinente pour les maladies chroniques inflammatoires et autoimmunes. De plus, nos résultats illustrent un nouveau paradigme concernant les mécanismes de signalisation cellulaire impliqués dans la synergie entre deux cytokines qui pourrait être applicable à des combinaisons de cytokines autres que TNFα+IFNβ.

Caractérisation de l’activité transcriptionnelle antivirale et immunorégulatrice dépendante de STAT2 et IRF9, mais indépendante de STAT1, induite par la costimulation par TNF

Les cellules épithéliales pulmonaires constituent la première ligne de défense face aux virus respiratoires via la sécrétion de mucus, de peptides, de cytokines et chimiokines qui déterminent l'élimination ou la progression de l’infection. Les principales cytokines antivirales produites par les cellules épithéliales alvéolaires (AEC) sont les interférons (IFN) type I (α/β) et III (λ). La liaison d’IFNβ à son récepteur induit une voie antivirale bien caractérisée qui aboutit à l’activation du complexe ISGF3 (STAT1, STAT2 et IRF9) qui permet la transcription de multiples gènes codant pour des protéines à activité antivirale et immunorégulatrice. Il a récemment été démontré que la costimulation des cellules épithéliales pulmonaires par l’IFNβ et le Tumor Necrosis Factor α (TNFα), également produit lors d’une infection, synergisent pour induire un état antiviral tardif distinct. D’autre part, il a été montré que la synergie entre le TNFα et l'IFNβ induit une voie de signalisation impliquant STAT2 et IRF9, mais indépendante de STAT1 permettant l’expression du gène DUOX2. Notre but est de déterminer l’importance de cette nouvelle voie de signalisation induite par la costimulation du TNFα+IFNβ, impliquant STAT2 et IRF9 indépendamment de STAT1 dans la régulation d’un programme transcriptionnel antiviral et immunorégulateur tardif. Notre premier objectif est de déterminer si des gènes antiviraux et immunorégulateurs qui sont induits par la costimulation par TNFα+IFNβ sont dépendants de la voie STAT2/IRF9, indépendamment de STAT1. En utilisant la technique de qRT-PCR, nous avons identifié 3 gènes immunorégulateurs, CXCL10, IDO et APOBEC3G, induits de manière synergique en réponse à TNFα+IFNβ dans les cellules A549, un modèle de cellules épithéliales pulmonaires. Afin de confirmer que ces gènes sont induits indépendamment de STAT1, nous avons validé leur expression dans la lignée cellulaire U3A déficiente en STAT1. Par l'utilisation d'ARN interférants (ARNi) dirigés contre STAT2 et IRF9, nous avons confirmé que l’induction de ces gènes est dépendante de STAT2 et IRF9. Finalement, l’analyse de l’activité du promoteur de CXCL10 en réponse à TNFα+IFNβ par des essais rapporteurs luciférases a permis de montrer que la régulation se fait au niveau transcriptionnel. Notre deuxième objectif, est de déterminer si STAT6 pourrait remplacer STAT1 dans la voie de signalisation induite par TNFα+IFNβ. En effet, STAT6 est un inducteur connu de l’expression de DUOX2 en réponse à IL4+IL13. Contrairement à notre hypothèse, l’inhibition de STAT6 par ARNi augmente l’expression de DUOX2 en réponse à TNFα+IFNβ suggérant que STAT6 est un régulateur négatif. Nos résultats ont permis de comprendre de manière plus détaillée les mécanismes mis en place dans le développement d’une réponse antivirale. D’autre part, l’étude de l’effet de l’IFNβ et du TNFα est également pertinente pour les maladies chroniques inflammatoires et autoimmunes. De plus, nos résultats illustrent un nouveau paradigme concernant les mécanismes de signalisation cellulaire impliqués dans la synergie entre deux cytokines qui pourrait être applicable à des combinaisons de cytokines autres que TNFα+IFNβ.

Études sur le rôle d’IL-18 dans l’immunopathogénèse du SIDA

Le virus de l’immunodéficience humaine ou VIH est l’agent qui cause le SIDA. Le VIH donne lieu à une dérégulation dans la production de certaines cytokines qui ont un rôle immunologique très important chez les patients infectés. L’IL-18, autrement nommé facteur inducteur d’IFN-γ, est une cytokine pro-inflammatoire qui affecte le système immunitaire de façon importante. Son activité est régulée par l’"IL-18 Binding Protein" (IL-18BP), une autre cytokine qui se lie avec l’IL-18 et inhibe son activité biologique. Des études ultérieures ont montré des niveaux élevés d’Il-18 chez les patients infectés par le VIH par rapport aux personnes saines. Cependant, aucune étude n’a été réalisée concernant la production d’IL-18BP chez ces patients. Due à sa relevance dans la régulation de l’IL-18, nous avons étudié l’effet de l’infection par le VIH sur l’équilibre entre ces deux facteurs et l’impact de cet équilibre sur l’homéostasie des cellules NK. Nous avons mesuré les taux de l’IL-18 et de l’IL-18BP circulantes dans les sérums des patients infectés par le VIH en les comparants avec le même nombre de personnes saines et séronégatives. Nous avons aussi déterminé le nombre total des différents sous-types de cellules NK et analysé l’activité des cellules NK (Natural Killer). Finalement nous avons cherché à déterminer si l’IL-18 pouvait induire l’apoptose des cellules NK en activant l’expression de Fas ligand. Nos résultats nous démontrent que les patients infectés par le VIH ont trois fois plus d’IL-18 que les donneurs sains. Cependant les niveaux d’IL-18BP sont plus bas chez les patients infectés comparés aux donneurs sains. Alors, le ratio IL-18/IL-18BP est augmenté chez les patients infectés, ce qui entraîne une grande quantité d’IL-18 libre et biologiquement active circulante dans leur organisme. Nos études démontrent que chez ces patients, les concentrations d’IL-18 sont en corrélation négative avec l’activité cytotoxique de leurs cellules NK. Nos études in vitro démontrent que le traitement des cellules NK par l’IL-18 induit de façon fratricide leur apoptose en augmentant l’expression de Fas ligand. Finalement, cette production non coordonnée de ces deux facteurs pourrait contribuer à une immunopathologie induite par l’IL-18 en entraînant une apoptose fratricide des cellules NK qui possèdent un rôle important dans la réponse antivirale. Le dérèglement de l’homéostasie des cellules NK pourrait donc contribuer à la pathogenèse induite par le VIH.

Mécanismes de subversion de l'immunité innée par le virus de l'Hépatite C (VHC)

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés.

Études sur la dérégulation des cytokines et des cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH-1

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1.

Étude de la fonction anti-apoptotique de la sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase des virus de l’herpès simplex

L’élimination des cellules infectées par apoptose constitue un mécanisme de défense antivirale. Les virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1 et 2 encodent des facteurs qui inhibent l’apoptose induite par la réponse antivirale. La sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase d’HSV-2 (ICP10) possède une fonction anti-apoptotique qui protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par les récepteurs de mort en agissant en amont ou au niveau de l’activation de la procaspase-8. Puisqu’une infection avec un mutant HSV-1 déficient pour la R1 diminue la résistance des cellules infectées vis à vis du TNFα, il a été suggéré que la R1 d’HSV-1 (ICP6) pourrait posséder une fonction anti-apoptotique. Le but principal de cette thèse est d’étudier le mécanisme et le potentiel de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV-1 et de la R1 d'HSV-2. Dans une première étude, nous avons investigué le mécanisme de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV en utilisant le TNFα et le FasL, deux inducteurs des récepteurs de mort impliqués dans la réponse immune anti-HSV. Cette étude a permis d’obtenir trois principaux résultats concernant la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Premièrement, la R1 d’HSV-1 inhibe l’apoptose induite par le TNFα et par le FasL aussi efficacement que la R1 d’HSV-2. Deuxièmement, la R1 d’HSV-1 est essentielle à l’inhibition de l’apoptose induite par le FasL. Troisièmement, la R1 d’HSV interagit constitutivement avec la procaspase-8 d’une manière qui inhibe la dimérisation et donc l’activation de la caspase-8. Ces résultats suggèrent qu’en plus d’inhiber l’apoptose induite par les récepteurs de mort la R1 d’HSV peut prévenir l’activation de la caspase-8 induite par d’autres stimuli pro-apoptotiques. Les ARN double-brins (ARNdb) constituant un intermédiaire de la transcription du génome des HSV et activant l’apoptose par une voie dépendante de la caspase-8, nous avons testé dans une seconde étude l’impact de la R1 d’HSV sur l’apoptose induite par l’acide polyriboinosinique : polyribocytidylique (poly(I:C)), un analogue synthétique des ARNdb. Ces travaux ont montré qu’une infection avec les HSV protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV-1 joue un rôle majeur dans l’inhibition de l’activation de la caspase-8 induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV interagit non seulement avec la procaspase-8 mais aussi avec RIP1 (receptor interacting protein 1). En interagissant avec RIP1, la R1 d’HSV-2 inhibe l’interaction entre RIP1 et TRIF (Toll/interleukine-1 receptor-domain-containing adapter-inducing interferon β), l’adaptateur du Toll-like receptor 3 qui est un détecteur d’ARNdb , laquelle est essentielle pour signaler l’apoptose induite par le poly(I:C) extracellulaire et la surexpression de TRIF. Ces travaux démontrent la capacité de la R1 d’HSV à inhiber l’apoptose induite par divers stimuli et ils ont permis de déterminer le mécanisme de l’activité anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Très tôt durant l’infection, cFLIP, un inhibiteur cellulaire de la caspase-8, est dégradé alors que la R1 d’HSV s’accumule de manière concomitante. En interagissant avec la procapsase-8 et RIP1, la R1 d’HSV se comporte comme un inhibiteur viral de l’activation de la procaspase-8 inhibant l’apoptose induite par les récepteurs de mort et les détecteurs aux ARNdb.

Caractérisation de la voie d'activation des interférons de type I

Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche

The nuclear pore complex and its transporters : from virus-host interactors to subverting the innate antiviral immunity

Les virus ont besoin d’interagir avec des facteurs cellulaires pour se répliquer et se propager dans les cellules d’hôtes. Une étude de l'interactome des protéines du virus d'hépatite C (VHC) par Germain et al. (2014) a permis d'élucider de nouvelles interactions virus-hôte. L'étude a également démontré que la majorité des facteurs de l'hôte n'avaient pas d'effet sur la réplication du virus. Ces travaux suggèrent que la majorité des protéines ont un rôle dans d'autres processus cellulaires tel que la réponse innée antivirale et ciblées pas le virus dans des mécanismes d'évasion immune. Pour tester cette hypothèse, 132 interactant virus-hôtes ont été sélectionnés et évalués par silençage génique dans un criblage d'ARNi sur la production interferon-beta (IFNB1). Nous avons ainsi observé que les réductions de l'expression de 53 interactants virus-hôte modulent la réponse antivirale innée. Une étude dans les termes de gène d'ontologie (GO) démontre un enrichissement de ces protéines au transport nucléocytoplasmique et au complexe du pore nucléaire. De plus, les gènes associés avec ces termes (CSE1L, KPNB1, RAN, TNPO1 et XPO1) ont été caractérisé comme des interactant de la protéine NS3/4A par Germain et al. (2014), et comme des régulateurs positives de la réponse innée antivirale. Comme le VHC se réplique dans le cytoplasme, nous proposons que ces interactions à des protéines associées avec le noyau confèrent un avantage de réplication et bénéficient au virus en interférant avec des processus cellulaire tel que la réponse innée. Cette réponse innée antivirale requiert la translocation nucléaire des facteurs transcriptionnelles IRF3 et NF-κB p65 pour la production des IFNs de type I. Un essai de microscopie a été développé afin d'évaluer l’effet du silençage de 60 gènes exprimant des protéines associés au complexe du pore nucléaire et au transport nucléocytoplasmique sur la translocation d’IRF3 et NF-κB p65 par un criblage ARNi lors d’une cinétique d'infection virale. En conclusion, l’étude démontre qu’il y a plusieurs protéines qui sont impliqués dans le transport de ces facteurs transcriptionnelles pendant une infection virale et peut affecter la production IFNB1 à différents niveaux de la réponse d'immunité antivirale. L'étude aussi suggère que l'effet de ces facteurs de transport sur la réponse innée est peut être un mécanisme d'évasion par des virus comme VHC.

Transient high level mammalian reovirus replication in a bat epithelial cell line occurs without cytopathic effect

Mammalian reoviruses exhibit a large host range and infected cells are generally killed; however, most studies examined only a few cell types and host species, and are probably not representative of all possible interactions between virus and host cell. Many questions thus remain concerning the nature of cellular factors that affect viral replication and cell death. In the present work, it was observed that replication of the classical mammalian reovirus serotype 3 Dearing in a bat epithelial cell line, Tb1.Lu, does not result in cell lysis and is rapidly reduced to very low levels. Prior uncoating of virions by chymotrypsin treatment, to generate infectious subviral particles, increased the initial level of infection but without any significant effect on further viral replication or cell survival. Infected cells remain resistant to virus reinfection and secrete an antiviral factor, most likely interferon, that is protective against the unrelated encephalomyocarditis virus. Although, the transformed status of a cell is believed to promote reovirus replication and viral “oncolysis”, resistant Tb1.Lu cells exhibit a classical phenotype of transformed cells by forming colonies in semisolid soft agar medium. Further transduction of Tb.Lu cells with a constitutively-active Ras oncogene does not seem cell growth or reovirus effect on these cells. Infected Tb1.Lu cells can produce low-level of infectious virus for a long time without any apparent effect, although these cells are resistant to reinfection. The results suggest that Tb1.Lu cells can mount an unusual antiviral response. Specific properties of bat cells may thus be in part responsible for the ability of the animals to act as reservoirs for viruses in general and for novel reoviruses in particular. Their peculiar resistance to cell lysis also makes Tb1.Lu cells an attractive model to study the cellular and viral factors that determine the ability of reovirus to replicate and destroy infected cells.

Amino acid substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins are selected during mammalian reovirus adaptation to Vero cells

Establishment of viral persistence in cell culture has previously led to the selection of mammalian reovirus mutants, although very few of those have been characterized in details. In the present study, reovirus was adapted to Vero cells that, in contrast to classically-used L929 cells, are inefficient in supporting the early steps of reovirus uncoating and are also unable to produce interferon as an antiviral response once infection occurs. The Vero cell-adapted reovirus exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 proteins. This contrasts with uncoating mutants from persistently-infected L929 cells, and various other cell types, that generally harbor amino acids substitutions in the σ3 outer capsid protein. The Vero cell-adapted virus remained sensitive to an inhibitor of lysosomal proteases; furthermore, in the absence of selective pressure for its maintenance, t he virus has partially lost its ability to resist interferon. The positions of the amino acids substitutions on the known protein structures suggest an effect on binding of the viral σ1 protein to the cell surface and on μ1 disassembly from the outer capsid.

Amino acids substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins of a Vero cell-adapted mammalian orthoreovirus are required for optimal virus binding and disassembly

In a recent study, the serotype 3 Dearing strain of mammalian orthoreovirus was adapted to Vero cells; cells that exhibit a limited ability to support the early steps of reovirus uncoating and are unable to produce interferon as an antiviral response upon infection. The Vero cell-adapted virus (VeroAV) exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 outer capsid proteins but no changes in the σ3 protein. Accordingly, the virus was shown not to behave as a classical uncoating mutant. In the present study, an increased ability of the virus to bind at the Vero cell surface was observed and is likely associated with an increased ability to bind onto cell-surface sialic acid residues. In addition, the kinetics of μ1 disassembly from the virions appears to be altered. The plasmid-based reverse genetics approach confirmed the importance of σ1 amino acids substitutions in VeroAV's ability to efficiently infect Vero cells, although μ1 co-adaptation appears necessary to optimize viral infection. This approach of combining in vitro selection of reoviruses with reverse genetics to identify pertinent amino acids substitutions appears promising in the context of eventual reovirus modification to increase its potential as an oncolytic virus.

The nuclear pore complex and its transporters : from virus-host interactors to subverting the innate antiviral immunity

Les virus ont besoin d’interagir avec des facteurs cellulaires pour se répliquer et se propager dans les cellules d’hôtes. Une étude de l'interactome des protéines du virus d'hépatite C (VHC) par Germain et al. (2014) a permis d'élucider de nouvelles interactions virus-hôte. L'étude a également démontré que la majorité des facteurs de l'hôte n'avaient pas d'effet sur la réplication du virus. Ces travaux suggèrent que la majorité des protéines ont un rôle dans d'autres processus cellulaires tel que la réponse innée antivirale et ciblées pas le virus dans des mécanismes d'évasion immune. Pour tester cette hypothèse, 132 interactant virus-hôtes ont été sélectionnés et évalués par silençage génique dans un criblage d'ARNi sur la production interferon-beta (IFNB1). Nous avons ainsi observé que les réductions de l'expression de 53 interactants virus-hôte modulent la réponse antivirale innée. Une étude dans les termes de gène d'ontologie (GO) démontre un enrichissement de ces protéines au transport nucléocytoplasmique et au complexe du pore nucléaire. De plus, les gènes associés avec ces termes (CSE1L, KPNB1, RAN, TNPO1 et XPO1) ont été caractérisé comme des interactant de la protéine NS3/4A par Germain et al. (2014), et comme des régulateurs positives de la réponse innée antivirale. Comme le VHC se réplique dans le cytoplasme, nous proposons que ces interactions à des protéines associées avec le noyau confèrent un avantage de réplication et bénéficient au virus en interférant avec des processus cellulaire tel que la réponse innée. Cette réponse innée antivirale requiert la translocation nucléaire des facteurs transcriptionnelles IRF3 et NF-κB p65 pour la production des IFNs de type I. Un essai de microscopie a été développé afin d'évaluer l’effet du silençage de 60 gènes exprimant des protéines associés au complexe du pore nucléaire et au transport nucléocytoplasmique sur la translocation d’IRF3 et NF-κB p65 par un criblage ARNi lors d’une cinétique d'infection virale. En conclusion, l’étude démontre qu’il y a plusieurs protéines qui sont impliqués dans le transport de ces facteurs transcriptionnelles pendant une infection virale et peut affecter la production IFNB1 à différents niveaux de la réponse d'immunité antivirale. L'étude aussi suggère que l'effet de ces facteurs de transport sur la réponse innée est peut être un mécanisme d'évasion par des virus comme VHC.

Étude de la modulation de la cascade de l'interféron suite à l'infection par le VIH

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude de la modulation de la cascade de l'interféron suite à l'infection par le VIH

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.