325 resultados para Réparation de l’ADN
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La réparation de l’ADN par excision des nuclotides (NER) est un mcanisme capable de retirer une large varit de lsions causant une distorsion de la double hlice, comme celles causes par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de réparation de l’ADN, la NER contribue la prvention de la carcinognse en prvenant la mutation de l’ADN. Lors de ce processus, il y a dabord reconnaissance de la lsion par la protine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe droule l’ADN par son activit hlicase et recrute lendonuclase XPG/Rad2 ainsi que dautres protines ncessaires lexcision de l’ADN. Lors de son arrive au site de lsion, XPG/Rad2 dplace XPC/Rad4. TFIIH agit galement lors de la transcription de l’ADN, entre autres par son activit hlicase. Outre cette similarit de la prsence de TFIIH lors de la transcription et la réparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intresss aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN. Nous avons donc entrepris une caractrisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons dcouvert que Rad2 et Rad4 possdent un motif dinteraction en nous basant sur dautres interactions de la sous-unit Tfb1 de TFIIH. Par calorimtrie titrage isotherme, nous avons observ que les segments de ces deux protines contenant ce motif interagissent avec une grande affinit au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est trs semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIE avec Tfb1PH, tel que dmontr par rsonance magntique nuclaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire comptition les uns aux autres pour la liaison Tfb1PH. Nous avons aussi dmontr in vivo chez la levure quune dltion de Tfb1PH cre une sensibilit aux radiations UV. De plus, la dltion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments dinteraction Tfb1PH, est ncessaire pour voir une sensibilit aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliques dans la liaison de Rad2 et Rad4 TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont t rsolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des rsidus hydrophobes interagissant avec des cavits peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont trs semblables la structure de TFIIE-p62PH. Ces dcouvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la réparation de l’ADN. De plus, elles permettent dmettre un modle du mcanisme de dplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage l’ADN. Ces connaissances aident mieux comprendre les mcanismes de maintient de la stabilit gnomique et peuvent ainsi mener dvelopper de nouvelles thrapies contre le cancer.
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Jusqu prsent, la metformine a principalement t employe comme mdicament contrlant lhyperglycmie des personnes atteintes de diabte de type II. Des tudes pidmiologiques ont dmontr que les personnes, prenant de la metformine, dveloppent moins de cancers. Par exemple, la prise de metformine rduit respectivement de 78% et de 46% les chances de dvelopper un cancer hpatique ou pancratique. Rcemment, il a t montr que la metformine permet de rduire le dveloppement de tumeur au niveau de la peau, suite lexposition des rayons UVB. Dans cette tude, jai dmontr que la prsence de metformine permet une meilleure survie de la levure Saccharomyces cerevisiae suite lexposition des rayons UVC ou UVA. De plus, jai dmontr que la prsence de metformine augmente le recrutement de lhistone Htz1 la chromatine. Pour une souche htz1, le niveau de survie suite lexposition aux rayons UVA est considrablement diminu. Htz1 permet le recrutement de Rad14 au site de dommages l’ADN faits par les rayons UV. Htz1 est donc important pour la dtection de ces sites. Enfin, le recrutement nuclaire de Rad14 en prsence de metformine a considrablement augment. En absence de Rad14, le niveau de survie suite lexposition aux rayons UVA diminue significativement. Donc, Htz1 et Rad14 sont deux protines cls dans la protection contre les rayons UV apports par la metformine. En conclusion, avec les diffrents rsultats de cette tude, il est possible de dire que la metformine permet une forme de protection contre les rayons UVC et UVA.
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Au Canada, en 2015, il tait estim que 78 000 personnes allaient mourir dun cancer, reprsentant 30 % de tous les dcs et faisant de celui-ci la premire cause de mortalit. De plus, 196 900 nouveaux cas de cancers seraient dcouverts au cours de cette mme anne (Canadian Cancer Societys Advisory Committee on Cancer Statistics. Canadian Cancer Statistics 2015. Toronto, ON : Canadian Cancer Society; 2015). Lintgrit du gnome est chaque jour menace par des conditions environnementales qui endommagent l’ADN (ultraviolets, produits chimiques divers, etc.). Parmi les diffrents types de lsions, lun des plus dltres et pouvant mener au cancer est la cassure double-brin (CDB). Celle-ci peut tre rpare suivant deux mcanismes majeurs : la jonction des extrmits non homologues (Non-Homologous End-Joining ou NHEJ) ou la Recombinaison Homologue (RH). Cette dernire, prpondrante pendant les phases S/G2, consiste en la réparation dune CDB grce lutilisation dune chromatide soeur comme modle, permettant une réparation fidle du dommage. La RH est sous la dpendance de diverses protines, dont RAD51, PALB2 et BRCA2. Ces deux dernires sont connues pour tre mutes dans les cancers du sein et des ovaires. Ainsi, la comprhension de limplication de chaque acteur dans la RH est un objectif fondamental dans la lutte contre le cancer et constitue lobjectif gnral de cette thse. En 2012, une tude a montr quune nouvelle protine, APRIN (Androgen-induced PRoliferation INhibitor), appartenant au complexe cohsine, interagissait avec BRCA2 et jouait un rle dans la RH. Les rles prcis dAPRIN dans ce mcanisme restaient toutefois tre dfinis. Le projet principal de cette thse repose sur la caractrisation fonctionnelle dAPRIN dans la réparation par RH. Nous rvlons quAPRIN aurait un rle spcifique et indpendant de celui de la cohsine dans la RH, et pourrait agir diverses tapes cruciales de ce mcanisme. De plus, nos donnes montrent que le niveau dexpression dAPRIN pourrait tre un marqueur de prdiction dans le cancer ovarien. tant donn quAPRIN interagit aussi avec PALB2, autre partenaire essentiel de BRCA2, nous avons galement tudi et caractris les fonctions de divers mutants de PALB2. Nous faisons ainsi la dcouverte inattendue dun nouveau phnotype induit par une troncation de cette protine associe certains cancers agressifs. Ainsi, cette thse apporte des informations supplmentaires et indispensables la comprhension de la réparation de l’ADN par RH et de la survenue de certains cancers.
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Les cellules humaines sont soumises des stress induisant des cassures double-brin de l’ADN (CDB). Ces CDB sont rpares notamment par la recombinaison homologue, impliquant les protines RAD51 et RAD52. Une stratgie thrapeutique mergente est de dvelopper des molcules inhibant RAD51 ou RAD52 afin daccentuer linstabilit gntique et la mort de la cellule cancreuse. En effet, dans certains cancers, lactivit de RAD51 est drgule promouvant la prolifration tumorale. Il existe plusieurs molcules inhibitrices de RAD51 et nous nous sommes intresss au DIDS dont le mode daction na pas encore t dtermin. Concernant RAD52, une ltalit synthtique a t montre lorsque celle-ci est inactive dans des cellules dficientes en BRCA1, BRCA2 ou PALB2, trois gnes muts dans de nombreux cancers. Rcemment, trois types de molcules inhibitrices de RAD52 ont t mis en vidence. Nous avons tout dabord tudi limpact du DIDS ainsi que des molcules drives afin de comprendre le mcanisme mis en jeu. Nous avons montr que le DIDS, ainsi que ses drivs inhibent la liaison de RAD51 l’ADN. Ces molcules empchent la formation du nuclofilament entrainant une diminution du nombre de foyers RAD51. Nous avons dvelopp une mthode de criblage par fluorescence pour valuer leffet dune banque de 696 molcules sur la capacit de RAD52 hybrider deux ADNsb. Deux molcules capables dinhiber la fonction dhybridation de RAD52 ont t mises au jour. In vivo, elles entrainent une diminution de la survie de cellules dficientes en PALB2. La recherche et le dveloppement de nouveaux inhibiteurs de RAD51 et RAD52 constituent des stratgies thrapeutiques davenir.
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Les plantes doivent assurer la protection de trois gnomes localiss dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mcanismes assurant la réparation de l’ADN nuclaire sont relativement bien compris, il nen va pas de mme pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mcanismes puisque des dommages l’ADN non ou mal rpars peuvent entraner des rarrangements dans les gnomes. Chez les plantes, de tels rarrangements dans l’ADN mitochondrial ou dans l’ADN chloroplastique peuvent conduire une perte de vigueur ou un ralentissement de la croissance. Rcemment, notre laboratoire a identifi une famille de protines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protines forment des ttramres qui lient l’ADN monocatnaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associes au mtabolisme de l’ADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protines ont t associes au maintien de la stabilit du gnome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protines sont impliques dans la réparation de l’ADN. Notre tude chez Arabidopsis dmontre que des cassures bicatnaires de l’ADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de réparation dpendant de trs courtes squences rptes (de cinq cinquante paires de bases) dADN. Nous avons galement montr que les protines Whirly modulent cette voie de réparation. Plus prcisment, leur rle serait de promouvoir une réparation fidle de l’ADN en empchant la formation de rarrangements dans les gnomes de ces organites. Pour comprendre comment les protines Whirly sont impliques dans ce processus, nous avons lucid la structure cristalline dun complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protgent l’ADN monocatnaire sans spcificit de squence. La liaison de l’ADN seffectue entre les feuillets de sous-units contigus du ttramre. Cette configuration maintient l’ADN sous une forme monocatnaire et empche son appariement avec des acides nucliques de squence complmentaire. Ainsi, les protines Whirly peuvent empcher la formation de rarrangements et favoriser une réparation fidle de l’ADN. Nous avons galement montr que, lors de la liaison de trs longues squences dADN, les protines Whirly peuvent sagencer en superstructures dhexamres de ttramres, formant ainsi des particules sphriques de douze nanomtres de diamtre. En particulier, nous avons pu dmontrer limportance dun rsidu lysine conserv chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilit de ces superstructures, dans la liaison cooprative de l’ADN, ainsi que dans la réparation de l’ADN chez Arabidopsis. Globalement, notre tude amne de nouvelles connaissances quant aux mcanismes de réparation de l’ADN dans les organites de plantes ainsi que le rle des protines Whirly dans ce processus.
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Les diffrents mcanismes de rgulation posttranscriptionnelle de lexpression des gnes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phnomnes physiologiques importants, comme la prolifration cellulaire et la rponse aux dommages l’ADN. Deux des protines impliques dans ce type de rgulation sont Staufen1 (Stau1) et Staufen2 (Stau2). Elles sont des protines de liaison lARN double brin qui contribuent au transport de lARN messager (ARNm), au contrle de la traduction, lpissage alternatif et sont responsables de la dgradation de certains ARNm spcifiques. Les protines Staufen peuvent en effet sassocier des ARNm bien prcis, dautant plus que, majoritairement, Stau1 et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mmes cibles. De nombreuses vidences rcentes montrent limplication de divers mcanismes de rgulation posttranscriptionnelle dans la rponse aux dommages l’ADN, plusieurs protines de liaison lARN y participant dailleurs. De faon importante, cette rponse dicte un ou plusieurs destin(s) la cellule qui doit ragir la suite de dommages lintgrit de son ADN: réparation de l’ADN, arrt de la prolifration cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait lhypothse que lexpression de Stau1 et/ou de Stau2 pourrait tre affecte en rponse un stress gnotoxique, ce qui pourrait avoir comme consquence de moduler lexpression et/ou la stabilit de leurs ARNm cibles. De mme, notre laboratoire a rcemment observ que lexpression de Stau1 varie pendant le cycle cellulaire, celle-ci tant plus leve jusquau dbut de la mitose (promtaphase), puis elle diminue alors que les cellules compltent leur division. Par consquent, nous avons fait lhypothse que Stau1 pourrait lier des ARNm de faon diffrentielle dans des cellules bloques en promtaphase et dans des cellules asynchrones. Dun ct, en employant la camptothcine (CPT), une drogue causant des dommages l’ADN, pour traiter des cellules de la ligne de cancer colorectal HCT116, nous avons observ que seule lexpression de Stau2 est rduite de faon considrable, tant au niveau de la protine que de lARNm. Lutilisation dautres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette observation initiale. De plus, nous avons constat que lexpression de Stau2 est touche mme dans des conditions nengendrant pas une rponse apoptotique, ce qui suggre que cette dpltion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place dune rponse approprie aux dommages l’ADN. Dailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec le traitement la CPT entrane un retard dans linduction de lapoptose dans les cellules HCT116. Nous avons aussi montr que la diminution de lexpression de Stau2 est due une rgulation de sa transcription en rponse au stress gnotoxique, ce pourquoi une rgion minimale du promoteur putatif de Stau2 est ncessaire. galement, nous avons identifi que le facteur de transcription E2F1, couramment impliqu dans la rponse aux dommages l’ADN, peut contrler lexpression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de lexpression de Stau2 dans des cellules non traites, mais cette hausse est abolie dans des cellules traites la CPT, ce qui suggre que la CPT pourrait agir en inhibant lactivation transcriptionnelle de Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observ que certains ARNm associs Stau2, et codant pour des protines impliques dans la rponse aux dommages l’ADN et lapoptose, sont exprims diffremment dans des cellules traites la CPT et des cellules non traites. Dun autre ct, nous avons identifi les ARNm associs Stau1 lors de la promtaphase, alors que lexpression de Stau1 est son niveau le plus lev pendant le cycle cellulaire, grce une tude grande chelle de micropuces dADN dans des cellules HEK293T. Nous avons par la suite confirm lassociation entre Stau1 et certains ARNm dintrts, donc codant pour des protines impliques dans la rgulation de la prolifration cellulaire et/ou le droulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm Stau1 dans des cellules bloques en promtaphase par rapport des cellules asynchrones nous a permis de constater une association prfrentielle dans les cellules en promtaphase. Ceci suggre une augmentation potentielle de la rgulation de ces ARNm par Stau1 ce moment du cycle cellulaire. Les donnes prsentes dans cette thse indiquent vraisemblablement que la rgulation posttranscriptionnelle de lexpression gnique contrle par les protines Staufen se fait en partie grce la modulation de lexpression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de lexpression des protines Staufen ait des consquences sur des sous-ensembles dARNm auxquels elles sont lies et que de cette faon, elles jouent un rle pour rguler des processus physiologiques essentiels comme la rponse aux dommages l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire.
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La chromatine possde une plasticit complexe et essentielle pour rpondre diffrents mcanismes cellulaires fondamentaux tels la rplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nuclosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire do lintrt de cette thse dy porter une attention particulire. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associ lmergence du cancer. Le chapitre II de cette thse focalise sur la rpression transcriptionnelle des gnes dhistones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en rponse au dommage l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage l’ADN en dbut de phase S, les kinases du point de contrle Mec1, Tel1 et Rad53 sassurent de bloquer les origines tardives de rplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagniques ou cytotoxiques entre les ADN polymrases et les lsions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthse totale dADN est soudainement ralentie par le point de contrle, laccumulation d'un excs d'histones nouvellement synthtises est nfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manire non-spcifique aux acides nucliques. L'un des mcanismes mis en place afin de minimiser la quantit dhistones libres consiste rprimer la transcription des gnes d'histones lors d'une chute rapide de la synthse d'ADN, mais les bases molculaires de ce mcanisme taient trs mal connues. Notre tude sur la rpression des gnes dhistones en rponse aux agents gnotoxiques nous a permis didentifier que les kinases du point de contrle jouent un rle dans la rpression des gnes dhistones. Avant le dbut de mon projet, il tait dj connu que le complexe HIR est requis pour la rpression des gnes dhistones en phase G1, G2/M et lors de dommage l’ADN en phase S. Par contre, la rgulation du complexe HIR en rponse au dommage l'ADN n'tait pas connue. Nous avons dmontr par des essais de spectromtrie de masse (SM) que Rad53 rgule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-units, Hpc2, de multiples rsidus in vivo et in vitro. La phosphorylation dHpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gnes dhistones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la prsence sur les promoteurs des gnes d'histones corrle avec leur rpression. De plus, nous avons mis jour un nouveau mcanisme de rgulation du complexe HIR durant la progression normale travers le cycle cellulaire ainsi qu'en rponse aux agents gnotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protine Hpc2 est trs instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gnes dhistones et la production d'un pool d'histones no-synthtises juste avant l'initiation de la rplication de l’ADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brve priode de temps durant la phase S. Ces rsultats suggrent qu'Hpc2 est une protine clef pour la rgulation de l'activit du complexe HIR et la rpression des gnes dhistones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en rponse au dommage l’ADN. Dans le but de poursuivre notre tude sur la rgulation des histones, le chapitre III de ma thse concerne lanalyse globale de lactylation des histones induite par les inhibiteurs dhistone dsactylases (HDACi) dans les cellules normales et cancreuses. Les histones dsactylases (HDACs) sont les enzymes qui enlvent lactylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent loncogense par leur fusion aberrante avec des complexes protiques oncogniques. Les perturbations causes mnent souvent un tat silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrs par ces protines de fusion. Notre tude de leffet sur lactylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et lentinostat (MS-275), a permis de dmontrer une augmentation leve de lactylation globale des histones H3 et H4, contrairement H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancreuses. Notre quantification en SM de l'actylation des histones a rvl de faon inattendue que la stchiomtrie d'actylation sur la lysine 56 de lhistone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manire surprenante, cette stchiomtrie n'augmente pas dans des cellules traites avec diffrents HDACi. Plusieurs tudes de H3K56Ac chez lhumain prsentes dans la littrature ont rapport des rsultats irrconciliables. Qui plus est, H3K56Ac tait considr comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. Cest pourquoi nous avons port notre attention sur la spcificit des anticorps utiliss et avons dtermin quune grande majorit danticorps utiliss dans la littrature reconnaissent dautres sites d'actylation de lhistone H3, notamment H3K9Ac dont la stchiomtrie d'actylation in vivo est beaucoup plus leve que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite notre tude sur lactylation des histones et consiste en un rapport spcial de recherche dcrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et lhomme et comporte galement une valuation dun anticorps supposment spcifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez lhumain.
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Les protines MCM (minichromosome maintenance) forment un complexe htrohexamrique compos des protines MCM2 MCM7 qui possde une activit hlicase ncessaire lors de la rplication de l’ADN. Ce complexe est la cible des protines ATM et ATR, kinases responsables de linitiation de la rponse cellulaires aux dommages l’ADN, pour permettre larrt de la rplication lors de la dtection de cassure double brin. De plus, les MCM permettent le remodelage de la chromatine par leur activit hlicase mais aussi par leur association avec une chaperone dhistone la protine ASF1. Toutefois, la majorit des complexes MCM ne co-localisent pas avec les origines de rplication. De plus, la quantit des protines MCM dans la cellule est nettement suprieure la quantit requise lors de la rplication. Ces deux faits laissent prsager que ce complexe hlicase pourrait jouer un second rle. Des tudes effectues au laboratoire ont dmontr une augmentation de la fixation la chromatine des protines MCM suite au traitement avec ltoposide, un inhibiteur de la topoisomrase II qui cause des cassures double brin. Ltude des interactions de la protine MCM2 par spectromtrie de masse ainsi que par immunobuvardage ont dmontr une augmentation de linteraction entre la protine MCM2 et ASF1 suite aux dommages. Ceci suggre que les protines MCM pourraient tre impliques dans les mcanismes de réparation de l’ADN. La nature de linteraction entre la protine MCM2 et ASF1 a t dtermine in vitro par des immunobuvardages de type Far western et des Dot blot avec des mutants de la protine MCM2. Des cellules U2OS-Flp-in ont t utilises pour gnrer des lignes stables exprimants les protines MCM2 MCM7 avec une tiquette GFP ou fusionnes avec une biotine-ligase (BirA). Les cellules ont t cultives dans du milieu SILAC et des immunoprcipitations ont t effectues sur des cellules contrles (R0K0), des cellules qui expriment MCM-GFP ou BirA (R6K4) non-traites et des cellules qui expriment MCM-GFP ou BirA traites ltoposide (R10K8). Les immunoprcipitations ont t analyss au spectromtre de masse pour dterminer la modulation des interactions avant et aprs dommages l’ADN. Les tudes dinteractions in vitro ont permis didentifier que linteraction entre la protine MCM2 et ASF1 se situe entre les acides amins 81-162 sur la protine MCM2. Lapproche de spectromtrie de masse a permis didentifier plusieurs protines liant le complexe MCM qui sont impliques non seulement dans la rplication de l’ADN mais aussi dans le remodelage de la chromatine. De plus, certains de ces nouveaux partenaires augmentent leur interaction avec le complexe suite linduction de dommages. Ces rsultats suggrent que les protines MCM jouent un rle dans la rorganisation de la chromatine dans les mcanismes de réparation de l’ADN.
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Le cancer du sein (CS) est la deuxime cause de dcs lis au cancer parmi les femmes dans la plupart des pays industrialiss. Les personnes qui ont le CS peuvent ne pas hriter des mutations causant le cancer de leurs parents. Ainsi, certaines cellules subissent des mutations qui mnent au cancer. Dans le cas de cancer hrditaire, les cellules tumorales contiennent gnralement des mutations qui ne sont pas trouves ailleurs dans l'organisme, mais peuvent maintenir des mutations qui vont rpartir dans toutes les cellules. La gense du CS est le rsultat des mutations de gnes qui assurent la rgulation de la prolifration cellulaire et la réparation de l’ADN. Deux gnes semblent particulirement concerns par les mutations. Les gnes Breast Cancer 1 (BRCA1) et Breast Cancer 2 (BRCA2), sont impliqus dans la prdisposition gntique de CS. On estime que 5-10% des cas de cancer du sein sont attribuables une prdisposition gntique. La plupart de ces cancers sont lis une anomalie du gne BRCA1 ou BRCA2. Plusieurs tudes ont t menes chez les femmes atteintes de CS sporadique et quelques tudes se sont concentres sur celles qui sont porteuses de mutations de BRCA. Alors, notre recherche a t entreprise afin de vrifier lhypothse dune association entre le CS, le mode vie et les habitudes alimentaires chez les Canadiennes-franaises non porteuses des 6 mutations de BRCA les plus frquentes parmi cette population. Nous avons men une tude cas-tmoins dans cette population. Quelque 280 femmes atteintes du cancer du sein et non-porteuses de mutations de BRCA, ont t recrutes en tant que cas. Les tmoins taient recruts parmi les membres de la famille des cas (n=15) ou partir d'autres familles atteintes de CS (n=265). Les participantes taient de tous ges, recrutes partir dune tude de cohorte qui est actuellement en cours, mene par une quipe de chercheurs au Centre Hospitalier Universitaire de Montral (CHUM) Htel-Dieu Montral. Les apports alimentaires ont t recueillis par un questionnaire de frquence semi-quantitatif valid et administr par une nutritionniste, qui portait sur la priode avant les deux ans prcdant le premier diagnostic de CS pour les cas et la priode avant les deux ans prcdant lentrevue tlphonique pour les tmoins. Un questionnaire de base tait administr par linfirmire de recherche aux participantes afin de colliger des renseignements sociodmographiques et sur les facteurs de risque du CS. Une association positive et significative a t dtecte entre lge (plus de 50 ans) auquel les sujets avaient atteint leur Indice de Masse Corporel (IMC) le plus lev et le CS rapport de cotes (OR) =2,83; intervalle de confiance 95% (IC95%) (2,34-2,91). De plus, une association positive a t dtecte entre un gain de poids de >34 lbs comparativement un gain de poids de 15 lbs, ds lge de 20 ans OR=1,68; IC95% (1,10-2,58). Un gain de poids de >24 lbs comparativement un gain de poids de 9 lbs, ds lge de 30 ans a aussi montr une augmentation de risque de CS OR=1,96; IC95% (1,46-3,06). Une association positive a aussi t dtect entre, un gain de poids de >12 lbs comparativement un gain de poids de 1 lb, ds lge de 40 ans OR=1,91; IC95% (1,53-2,66). Concernant le tabagisme, nous avons observ une association positive et significative relie la consommation de plus de 9 paquets-annes OR = 1,59; IC95% (1,57-2,87). Il fut suggr que lactivit physique modr confre une protection contre le CS: une pratique de > 24,8 (metabolic equivalent) MET-hrs par semaine par rapport 10,7 MET-hrs par semaine, diminue le risque du CS de 52% OR = 0,48 ; IC95% (0,31-0,74). Lactivit physique totale (entre 16,2 et 33,2 MET-hrs par semaine), a aussi montr une rduction de risque de CS de 43% OR = 0,57 ; IC95% (0,37-0,87). Toutefois, il n'y avait aucune association entre une activit physique vigoureuse et le risque de CS. Lanalyse portant sur les macro- et micro-nutriments et les groupes alimentaires a montr quun apport en nergie totale de plus de 2057 Kcal par jour augmentait le risque de CS de 2,5 fois OR = 2,54; IC95% (1,67-3,84). En ce qui concerne la consommation de caf, les participantes qui buvaient plus de 8 tasses de caf par jour avaient un risque de CS augment de 40% OR = 1,40; IC95% (1,09-2,24). Les sujets ayant une consommation dpassant 9 g dalcool (thanol) par jour avaient galement un risque lev de 55% OR = 1,55; IC95% (1,02-2,37). De plus, une association positive et significative a t dtecte entre le CS et la consommation de plus de deux bouteilles de bire par semaine OR = 1,34; IC95% (1,28-2,11), 10 onces de vin par semaine OR = 1,16; IC95% (1,08-2,58) ou 6 onces de spiritueux par semaine OR = 1,09; IC95% (1,02-2,08), respectivement. En rsum, les rsultats de cette recherche supportent lhypothse selon laquelle le mode de vie et les habitudes alimentaires jouent un rle important dans ltiologie de CS chez les Canadiennes-franaises non porteuses de mutations de BRCA. Les rsultats nous permettent de constater que le gain de poids et le tabagisme sont lis des risques levs de CS, tandis que l'activit physique modre aide rduire ce risque. De plus, nos rsultats suggrent quun apport nergtique total relativement lev et une consommation leve de caf et d'alcool peuvent accrotre le risque de ce cancer. Ce travail a permis de mettre laccent sur une nouvelle direction de recherche, jusqu' prsent non investigue. Les rsultats de ce travail de recherche pourraient contribuer recueillir de nouvelles informations et des conseils pouvant influencer et aider la population modifier son mode de vie et ses habitudes alimentaires afin de diminuer le risque de cancer du sein.
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La susceptibilit ou la rsistance aux cancers peuvent impliquer plusieurs mcanismes, incluant lapoptose, la croissance cellulaire et la diffrenciation, la rplication et la réparation de l’ADN. Mon projet porte plus particulirement sur lapoptose. Une drgulation dans les voies dactivation de lapoptose entrane une accumulation de cellules drgles, crant ainsi un environnement propice linstabilit gntique et au dveloppement du cancer. Comme lapoptose est une voie biologique hautement rgule, nous proposons lhypothse que des polymorphismes fonctionnels dans les rgions de rgulations des gnes (rSNPs) perturberaient cette voie cause de taux variables de transcrits et des protines correspondantes d la modification des sites de reconnaissances des facteurs de transcription. Les principaux objectifs de mon projet sont : (i) identifier les SNPs prsents dans la rgion promotrice des gnes dapoptose; (ii) dterminer les haplotypes de promoteurs les plus frquents prsents dans la population gnrale; (rHaps) (iii) vrifier leurs impacts fonctionnels sur lexpression gnique par des essais in vitro (gne rapporteur et retard sur gel). Cette tude permettra didentifier des rSNPs et rHaps ayant un impact sur le niveau dexpression des gnes dapoptose, au moins dans un contexte in vitro. Ces diffrences allliques au niveau de lexpression de ces gnes dapoptose pourraient contribuer la susceptibilit interindividuelle de dvelopper un cancer.
Resumo:
La stabilit gnomique, qui est essentielle la vie, est possible grce la rplication et la réparation de l’ADN. Une des enzymes responsables de la rplication et de la réparation de l’ADN est la ribonucleotide reductase (RNR), qui est retrouve chez la levure et chez lhumain. Cette enzyme catalyse la formation de doxyribonuclotides et maintien le pool de dNTP requis pour la réparation et la rplication de l’ADN. Lenzyme RNR est un ttramre 22 constitu dune grande (R1, 2) et dune petite (R2, 2) sous-unit. Chez S. cerevisiae, les gnes RNR1 et RNR3 encodent la sous-unit 2 (R1). Lactivit catalytique de RNR dpend dune interaction avec le fer et de la formation dun complexe entre R1 et R2. Lexpression de toutes les sous-units est inductible par les dommages causs l’ADN. Dans cette tude, nous dmontrons que des cellules qui nexpriment pas une des sous-units, Rnr4, du complexe RNR sont sensibles divers agents endommageant l’ADN, tels que le mthyl mthane sulfonate, la blomycine, le proxyde dhydrogne et les rayons ultraviolets (UVC 254 nm). Au contraire, le mutant est rsistant au 4-nitroquinoline-1- oxide (4-NQO), un compos qui engendre des lsions encombrantes. Par consquent, le mutant rnr4 dmontre une rduction marque en mutations induites par le 4-NQO comparativement la souche parentale. Nous voulions identifier la voie de réparation de l’ADN qui confrait cette rsistance au 4-NQO ainsi que les protines impliques. Les voies BER, NER et MMR nont pas aboli la rsistance au 4-NQO de la souche rnr4. La protine recombinante Rad51 ne joue pas un rle critique dans la réparation de l’ADN et dans la rsistance au 4-NQO. La dltion du gne REV3, qui encode une polymrase de contournement, implique dans la réparation post-rplication, a partiellement aboli la rsistance au 4-NQO dans rnr4. Ces rsultats suggrent que la polymrase Rev3 et possiblement dautres polymrases translsion (Rev1, Rev7, Rad30) pourraient tre impliques dans la réparation de lsions encombrantes dans l’ADN dans des conditions de carence en dNTP. La réparation de l’ADN, un mcanisme complexe chez la levure, implique une vaste gamme de protines, dont certaines encore inconnues. Nos rsultats indiquent quil y aurait plus quune protine implique dans la rsistance au 4-NQO. Des investigations plus approfondies seront ncessaires afin de comprendre la recombinaison et la réparation post-rplication.
Resumo:
Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) reprsentent une forme de dommage l’ADN hautement mutagne et ce type de dommage peut survenir spontanment ou tre induit par une varit dagents. Afin de prserver la stabilit gnomique, deux familles dendonuclases de type AP, endo-IV et exo-III, sont ncessaires pour contrecarrer les effets mutagnes des sites AP. Malgr lidentification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV na t identifi chez les organismes multicellulaires lexception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc dcid dinvestiguer limportance biologique de APN-1 chez C. elegans par lutilisation dune approche de knockdown du gne. Dans notre tude, nous avons montr que le knockdown du gne apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN dinterfrence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanes et induites par des drogues rsultant en un dlai de lclosion des ufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longvit des vers adultes. De plus, nous avons montr que cette accumulation de mutations mne un dlai dans la progression du cycle cellulaire durant lembryognse, reprsentant possiblement une explication du dlai dans lclosion des ufs. Nous avons montr quil y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possde une tiquette GFP. Les animaux transgniques APN-1-GFP nexprimaient pas suffisamment de la protine de fusion pour permettre une visualisation laide dun microscope fluorescence, mais la protine a t dtecte par immunobuvardage de type western. Les animaux transgniques APN-1-GFP taient instables et avaient des phnotypes concordants avec les dfauts gntiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie volu afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rle versatile afin de maintenir lintgrit gntique dautant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base.
Resumo:
Le virus de limmunodficience humaine de type 1 (VIH-1), lagent tiologique du SIDA, est un rtrovirus complexe arborant plusieurs protines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliques dans la modulation de la rplication virale, dans lvasion immunitaire et dans la progression de la pathogense du SIDA. Dans ce contexte, il a t dmontr que la protine virale R (Vpr) induit un arrt de cycle cellulaire en phase G2. Le mcanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est lactivation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dpendante, du point de contrle de dommage l’ADN, mais les facteurs et mcanismes molculaires directement impliqus dans cette activit demeurent inconnus. Afin didentifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilis une purification daffinit en tandem (TAP) pour isoler des complexes protiques natifs contenant Vpr. Nous avons dcouvert que Vpr sassociait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire dE3 ubiquitine ligase, comprenant les protines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos tudes ont mis en vidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr tait ncessaire mais non suffisant pour linduction de larrt de cycle cellulaire en G2, suggrant ainsi que des vnements additionnels seraient impliqus dans ce processus. cet gard, nous apportons des preuves directes que Vpr dtourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dgradation protosomale de protines cellulaires encore inconnues. Ces vnements dubiquitination induits par Vpr ont t dmontrs comme tant ncessaire lactivation dATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrs la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi quavec des facteurs impliqus dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers reprsente un vnement essentiel et prcoce dans linduction de larrt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous dmontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu cibl par Vpr est une protine associe la chromatine. Globalement, nos rsultats rvlent certains des mnanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette tude contribue notre comprhension de la modulation du systme ubiquitine-protasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de lenvironnement cellulaire de lhte.
Resumo:
Les sites apuriniques/apyrimidiniques (AP) sont des sites de l’ADN hautement mutagne. Les dommages au niveau de ces sites peuvent survenir spontanment ou tre induits par une varit dagents. Chez lhumain, les sites AP sont rpars principalement par APE1, une enzyme de réparation de l’ADN qui fait partie de la voie de réparation par excision de base (BER). APE1 est une enzyme multifonctionnelle; cest une AP endonuclase, 3-diestrase et un facteur redox impliqu dans lactivation des facteurs de transcription. Rcemment, il a t dmontr quAPE1 interagit avec lenzyme glycolytique GAPDH. Cette interaction induit lactivation dAPE1 par rduction. En outre, la dltion du gne GAPDH sensibilise les cellules aux agents endommageant l’ADN, induit une augmentation de formation spontane des sites AP et rduit la prolifration cellulaire. A partir de toutes ces donnes, il tait donc intressant dtudier leffet de la dltion de GAPDH sur la progression du cycle cellulaire, sur la distribution cellulaire dAPE1 et didentifier la cystine(s) dAPE1 cible(s) de la rduction par GAPDH. Nos travaux de recherche ont montr que la dficience en GAPDH cause un arrt du cycle cellulaire en phase G1. Cet arrt est probablement d laccumulation des dommages engendrant un retard au cours duquel la cellule pourra rparer son ADN. De plus, nous avons observ des foci nuclaires dans les cellules dficientes en GAPDH qui peuvent reprsenter des agrgats dAPE1 sous sa forme oxyde ou bien des focis de la protine inactive au niveau des lsions dADN. Nous avons utilis la mutagnse dirige pour crer des mutants (Cys en Ala) des sept cystines dAPE1 qui ont t clon dans un vecteur dexpression dans les cellules de mammifres. Nous mettons lhypothse quau moins un mutant ou plus va tre rsistant linactivation par oxydation puisque lalanine ne peut pas sengager dans la formation des ponts disulfures. Par consquent, on anticipe que lexpression de ce mutant dans les cellules dficientes en GAPDH pourrait restaurer une distribution cellulaire normale de APE1, librerait les cellules de larrt en phase G1 et diminuerait la sensibilit aux agents endommageant l’ADN. En conclusion, il semble que GAPDH, en prservant lactivit dAPE1, joue un nouveau rle pour maintenir lintgrit gnomique des cellules aussi bien dans les conditions normales quen rponse au stress oxydatif.
Resumo:
La leucmie lymphoblastique aige (LLA) est une maladie gntique complexe. Malgr que cette maladie hmatologique soit le cancer pdiatrique le plus frquent, ses causes demeurent inconnues. Des tudes antrieures ont dmontres que le risque la LLA chez lenfant pourrait tre influenc par des gnes agissant dans le mtabolisme des xnobiotiques, dans le maintient de lintgrit gnomique et dans la rponse au stress oxydatif, ainsi que par des facteurs environnementaux. Au cours de mes tudes doctorales, jai tent de dissquer davantage les bases gntiques de la LLA de lenfant en postulant que la susceptibilit cette maladie serait module, au moins en partie, par des variants gntiques agissant dans deux voies biologiques fondamentales : le point de contrle G1/S du cycle cellulaire et la réparation des cassures double-brin de l’ADN. En utilisant une approche unique reposant sur lanalyse dune cohorte cas-contrles jumele une cohorte de trios enfants-parents, jai effectu une tude dassociation de type gnes/voies biologiques candidats. Ainsi, jai valuer le rle de variants provenant de la squence promotrice de 12 gnes du cycle cellulaire et de 7 gnes de la voie de réparation de l’ADN, dans la susceptibilit la LLA. De tels polymorphismes dans la rgion promotrice (pSNPs) pourraient perturber la liaison de facteurs de transcription et mener des diffrences dans les niveaux dexpression des gnes pouvant influencer le risque la maladie. En combinant diffrentes mthodes analytiques, jai valu le rle de diffrents mcanismes gntiques dans le dveloppement de la LLA chez lenfant. Jai tout dabord tudi les associations avec gnes/variants indpendants, et des essaies fonctionnels ont t effectus afin dvaluer limpact des pSNPs sur la liaison de facteurs de transcription et lactivit promotrice allle-spcifique. Ces analyses ont men quatre publications. Il est peu probable que ces gnes de susceptibilit agissent seuls; jai donc utilis une approche intgrative afin dexplorer la possibilit que plusieurs variants dune mme voie biologique ou de voies connexes puissent moduler le risque de la maladie; ces travaux ont t soumis pour publication. En outre, le dveloppement prcoce de la LLA, voir mme in utero, suggre que les parents, et plus particulirement la mre, pourraient jouer un rle important dans le dveloppement de cette maladie chez lenfant. Dans une tude par simulations, jai valu la performance des mthodes danalyse existantes de dtecter des effets fto-maternels sous un design hybride trios/cas-contrles. Jai galement investigu limpact des effets gntiques agissant via la mre sur la susceptibilit la LLA. Cette tude, rcemment publie, ft la premire dmontrer que le risque de la leucmie chez lenfant peut tre modul par le gnotype de sa mre. En conclusions, mes tudes doctorales ont permis didentifier des nouveaux gnes de susceptibilit pour la LLA pdiatrique et de mettre en vidence le rle du cycle cellulaire et de la voie de la réparation de l’ADN dans la leucmogense. terme, ces travaux permettront de mieux comprendre les bases gntiques de la LLA, et conduiront au dveloppement doutils cliniques qui amlioreront la dtection, le diagnostique et le traitement de la leucmie chez lenfant.
