Neurotoxicidade do metotrexato : utilização da proteína S100B como um marcador e estudo do envolvimento do sistema glutamatérgico

O metotrexato (MTX) é um antagonista do ácido fólico amplamente utilizado no tratamento de doenças neoplásicas e não neoplásicas. Entretanto, o uso terapêutico desse fármaco pode levar à neurotoxicidade que pode se manifestar na forma aguda, subaguda e crônica, abrangendo os seguintes sintomas: cefaléia, sonolência, confusão, edema cerebral, convulsões, encefalopatia, coma e prejuízo das funções cognitivas. Os achados neuropatológicos consistem de astrogliose reativa, desmielinização, dano axonal e necrose da substância branca. Em nível celular, o MTX parece afetar primeira e seletivamente os astrócitos, quando comparados com os neurônios.O exato mecanismo neurotóxico do MTX continua não esclarecido, e parece ser multifatorial. Visando ampliar os conhecimentos a respeito dos efeitos do MTX no SNC, foram desenvolvidos dois trabalhos com diferentes modelos em animais, nos quais foram estudados os possíveis mecanismos de ação tóxica desse fármaco, como também propomos a utilização do marcador bioquímico S100B na detecção de injúrias cerebrais associadas ao tratamento. A partir dos resultados obtidos nos experimentos de captação de glutamato in vitro, verificamos que o MTX interfere na remoção do glutamato da fenda sináptica, podendo levar à excitotoxicidade. Também, o aumento da proteína S100B auxilia no entendimento dos mecanismos de ação do MTX, pois sugere que os astrócitos estão respondendo a um insulto na tentativa de neuroproteção Além disso, a S100B, aliada a outros marcadores neuroquímicos e técnicas de diagnóstico por imagem, seria muito importante no monitoramento terapêutico, pois poderia detectar alterações celulares sutis e ajudaria a prevenir a neurotoxicidade pelo MTX. Os resultados que obtivemos nos experimentos de convulsões induzidas pelo MTX demonstraram a participação do sistema glutamatérgico na neurotoxicidade desse fármaco. Especificamente, evidenciamos o envolvimento dos receptores inotrópicos glutamatérgicos na patogênese das convulsões. Porém, neste modelo experimental, a captação de glutamato possivelmente diminuiu em decorrência das manifestações das convulsões e não por uma ação direta, ou indireta, do MTX. O entendimento dos mecanismos de ação é muito importante para a clínica médica, pois permite que novas ferramentas sejam criadas no intuito de prevenir os danos tóxicos induzidos por fármacos. Assim, mais estudos devem ser realizados para tentar desvendar os mecanismos de neurotoxicidade do MTX, como também para estudar potenciais marcadores bioquímicos de injúria cerebral que auxiliem no monitoramento terapêutico.

Efecto de diferentes estrategias de fertilización nitrogenada y aplicación de fungicidas sobre el rendimiento y porcentaje de proteina en grano de soja

Resumen: En el periodo 2006 / 2007 se realizó un ensayo de campo sobre el cultivo de Soja (Glycine max) en la localidad de Chacabuco, Provincia de Buenos Aires, con el propósito de estudiar los efectos de diferentes estrategias de fertilización nitrogenada y de aplicación de fungicidas sobre el rendimiento y porcentaje de proteína en grano de soja. El ensayo constó de 8 tratamientos (7 + 1 testigo), los cuales se realizaron en 4 repeticiones y en 2 estadios fenológicos del cultivo, en V4 (vegetativo) y en R3 (reproductivo). Se procedió utilizando un diseño de bloques completos aleatorizados (DBA). Las parcelas han sido de 2 m de ancho por 10 m de largo dando un total de 20 m2 por cada una. Los tratamientos fueron los siguientes:  Testigo  UREA aplicado en V4/V6  Entec + UAN aplicado en V4/V6  Nitrofoska + Nutrimix aplicado en R3  Foliarsol aplicado en R5  Nitrofoska + Nutrimix + Opera aplicado en R3  Foliarsol + Opera aplicado en R3  Opera aplicado en R5 Las conclusiones a las que se han llegado en este ensayo han sido que todos los tratamientos experimentados trajeron aumentos en el rendimiento, en comparación al testigo. El mayor aumento se dio por el agregado de fungicida en las etapas reproductivas del cultivo. Por el contrario, no se ha encontrado efecto sobre el tenor de proteína en granos, por lo que para la condiciones en que se realizó el ensayo, no sería recomendable la fertilización nitrogenada si se busca un aumento en dicho tenor

Evaluación de dieciseis variedades de maiz (Zea mays L.) normal y de alta calidad de proteina en cinco ambientes de Nicaragua

Con el fin de identificar variedades de maíz que respondan consistentemente a las diferentes condiciones ambientales y con buen potencial de rendimiento se realizó el presente estudio en época de primera (Mayo-Junio) del 2004, donde se evaluaron 16 genotipos de alta calidad de proteína y normales en cinco localidades de Nicaragua. El diseño utilizado fue un Látice simple 4 x 4 con 3 réplicas, cada tratamiento estuvo formado por 2 hileras de 5 metros de longitud con separación de 0.25 y 0.80 metros entre plantas e hileras, respectivamente. La parcela útil estuvo formada por las dos hileras. Se realizó análisis de varianza para el rendimiento de grano por localidad y a través de las localidades; y se calculó la Diferencia Mínima Significativa (∝=0.05). La interacción genotipo x ambiente (G-A) se determinó a través del análisis Efectos Principales Aditivos e Interacciones Multiplicativas(AMMI). El modelo AMMI identificó las localidades de Santa Rosa, Jucuapa y Melchorita como ambientes desfavorables (con rendimientos de 2.40, 3.17 y 4.48 t ha-1 y puntuaciones AMMI de 0.44, 1.07 y 0.11, respectivamente) y a Campos Azules y Quilalí (con rendimientos de 8.46 y 7.40 t ha-1 y puntuaciones AMMI de -1.02 y -0.60, respectivamente) como ambientes favorables o productivos. Las variedades que menos interactuaron con el ambiente(-0.04, 0.03 y-0.10 valores AMMI, respectivamente) fueron ACROS0043, S00TLWQ-B, y S00SEQTLW. En general ninguna variedad estudiada superó significativamente al testigo TLAYOLLY (5.59 tha-1) en cuanto a rendimiento de grano, aunque algunas variedades fueron superiores al testigo NB-NUTRINTA (4.38 t ha-1), pero con niveles de estabilidad inferior a ACROS0043, S00TLWQ-B, y S00SEQTLW.

Efecto del nivel de proteina en la ración inicial sobre el peso vivo de pollos de engorde

Con el objeto de determinar el efecto del nivel de proteína en la ración inicial sobre el peso vivo de pollos de engorde, se realizo un ensayo en la Escuela Nacional de Agricultura utilizando 100 pollos (Vantres Cross) sin sexsar, de un dia de nacidos, se dividieron en grupos de 25 pollos, correspondiendo cada grupo a un tratamiento. La unidad experimental fueron 5 pollos. El diseño estadistico que se uso fue completamente al azar. Los tratamientos probados fueron: 1). Una racion que contenia 20 por ciento de proteina. 2). Una racion que contenia 22 por ciento de proteina. 3). Una racion que contenia 24 por ciento de proteina. 4). Una racion que contenia 26 por ciento de proteina. El grupo de aves que mejor respondio fue el que se alimento con la racion C, dando una ganancia promedio por unidad experimental de 7.16 kg. mientras que las raciones A, B y D reflejaron en los pollos pesos de 6.55 kg., 6.69 kg. y 6.98 kg., respectivamente. El analisis estadistico mostro que las diferencias de ganancias de pesos entre los tratamientos no fueron significativos para los diferentes niveles de proteina dando como resultado una ecuacion de regresion lineal. Con respecto a un estimado de la eficiencia alimenticia, se observo mayor eficiencia para el tratamiento C, con 0.474, mientras que los tratamientos A, B, D presentaron una eficiencia de 0.468, 0.451 y 0.456, respectivamente. Segun los resultados de este ensayo la mejor racion fue la que contenia 24 por ciento de proteina (racion C) ya que con ella se obtuvo mayores beneficios economicos.

ClpB proteina: informazio-bilketa eta proteomika ituratuaren bidez aztertzeko esperimentuaren diseinua

Zelulen bizi zikloan zehar zein inguruneko estimulu edo erasoen aurrean, geneek adierazpenean aldaketak pairatzen dituzte; proteinen sintesia beraz, prozesu dinamikoa da. Proteomikak izugarrizko jauzia suposatu du egoera ezberdinetan sintetizatzen diren proteinen inguruko ezagutzan. Hasiera batean esfortzu gehienak identifikaziora bideratzen ziren arren, azken hamarkadetan identifikazioaz gain, kuantifikazioak indar handia hartu du. Hala izanik, gaur egun ikerkuntza arloan lagin biologiko konplexuetako proteinen identifikazio eta kuantifikazioa bereizmen handiz eta era errepikakorrean burutzeko metodoen behar handia dago. Proteomika diziplina sortu zenetik eta berrikuntza teknologikoek lagunduta, geneen adierazpen mailaren, isoformen eta itzulpen ondoko eraldaketen inguruko geroz eta informazio gehiago lortzen den arren, egunera arte erabilitako metodo guztiek zenbait muga edo traba agertzen dituztela ukaezina da. 2D geletako proteinen analisiarekin hasi eta masa espektrometrian oinarritutako eskala handiko proteomikatik igarota, gaur egun masa espektrometrian oinarritzen den eta puri-purian dagoen proteomika ituratura heldu gara. Azken hurbilketa honek lagin konplexuetan bereizmen eta espezifikotasun handiz, interesekoa den proteina jakin bat edo batzuk identifikatu eta kuantifikatzeko aukera eskaintzen du. Proteomika ituratua SRM (Single Reaction Monitoring) teknikaren eskutik agertu zen arren, gaur egun PRM (Parallel Reaction Monitoring) teknika ari da aurrekoarekiko gailentzen are bereizmen eta sentikortasun handiagoa eskaintzen baitu. Testuingurua hau izanik, aurkezten den lan honetan, Escherichia coliren (E. coli) ClpB proteinaren identifikazioa burutzeko PRM bidezko esperimentu bat diseinatu da. Batetik, proteina honen jarraipena egiteko erabiliko diren peptido proteotipikoen aukeraketa eskala handiko MS/MS esperimentuen bidez zein eskuragarri dauden datu-baseak erabilita burutu daitekeela frogatu da. Bestetik, PRM esperimentua lagin konplexu batekin burutu eta hautatutako peptidoak behatu daitezkeela ikusi da. Are gehiago, lortutako emaitzei erreparatuta, peptidoen aukeraketa esperimentuaren arrakastarako faktore erabakigarria dela ondorioztatu da. Gainera, proiektu honetan aurkezten den lanarekin, orain arteko biokimikako beste teknikek eskatzen duten lan eskerga ekiditen da. Hortaz, PRM teknika lagin konplexuetan inolako frakzionamendu, purifikazio edo aberastasun pausorik gabe intereseko proteina baten kuantifikazioa burutzeko metodo egokia dela frogatu da.

IQ motif selectivity in human IQGAP1: binding of myosin essential light chain and S100B.

IQGAPs are cytoskeletal scaffolding proteins which link signalling pathways to the reorganisation of actin and microtubules. Human IQGAP1 has four IQ motifs each of which binds to calmodulin. The same region has been implicated in binding to two calmodulin-like proteins, the myosin essential light chain Mlc1sa and the calcium and zinc ion binding protein S100B. Using synthetic peptides corresponding to the four IQ motifs of human IQGAP1, we showed by native gel electrophoresis that only the first IQ motif interacts with Mlc1sa. This IQ motif, and also the fourth, interacts with the budding yeast myosin essential light chain Mlc1p. The first and second IQ motifs interact with S100B in the presence of calcium ions. This clearly establishes that S100B can interact with its targets through IQ motifs in addition to interacting via previously reported sequences. These results are discussed in terms of the function of IQGAP1 and IQ motif recognition.

Fermentación de los granos agotados en la industria cervecera para producir proteina unicelular

Tesis (Maestría en Ciencias Especialidad Microbiología Industrial)U.A.N.L.

Alterações do conteúdo de S100B durante o desenvolvimento em tecido encefálico, líquor e cultura de astrócitos corticais de rato

A S100B é uma proteína ligante de cálcio expressa e secretada por astrócitos. Em culturas de neurônios a S100B estimula a sobrevivência e extensão de neuritos. Estudos de imunocitoquímica e hibridização do RNAm in situ indicaram um aumento pós-natal desta proteína num período coincidente com a sinaptogênese em ratos. Neste trabalho foi investigado o imunoconteúdo da S100B por ELISA no tecido cerebral e no líquor de ratos durante o desenvolvimento pós-natal bem como o conteúdo e secreção de S100B em culturas de astrócitos corticais de diferentes idades. Também foi avaliada a ontogenia da GFAP e GAP-43, dois possíveis alvos da S100B. Os resultados mostram um acúmulo de S100B em hipocampo, córtex cerebral e cerebelo entre a segunda e quarta semana pós-natal. Uma redução da S100B no líquor foi observada após um período considerado crítico para a sinaptogênese em roedores. Um perfil semelhante foi observado durante o envelhecimento das culturas. Este estudo contribui com a idéia de que a S100B é uma proteína glial importante durante o desenvolvimento cerebral e que alterações nos seus níveis extracelulares devem estar envolvidos com a plasticidade sináptica.

Marcadores periféricos de dano ao sistema nervoso central : a proteína S100B e atividades ecto-nucleotidásicas

A S100B é uma proteína ligante de cálcio, de massa molecular de 21kDa, expressa principalmente por astrócitos. Esta proteína tem sido implicada em atividades funcionais tanto intra quanto extracelulares. Muitos estudos têm sugerido que intracelularmente ela está envolvida na modulação de proteínas do citoesqueleto e na regulação do ciclo celular. A proteína S100B pode ser secretada pelos astrócitos e desenvolver atividades extracelulares, que parecem depender de sua concentração. Em concentração nanomolar ela atua como fator trófico às células neurais, enquanto que em concentrações micromolar ela pode ser neurotóxica. A quantificação da proteína S100B no sangue e líquor se correlaciona com a extensão e intensidade do dano ao sistema nervoso central (SNC) o que permite sua utilização em estudos como marcador bioquímico de dano ou disfunção cerebral. Esta tese está dividida em três partes. A primeira parte propõe a utilização clínica da proteína S100B em patologias com envolvimento do SNC como a síndrome de Down, mielopatia associada ao vírus HTLV-I, lupus eritematoso sistêmico, epilepsia secundária a neurocisticercose e, além disso demonstramos a curva de ontogenia da S100B no sangue. Na segunda parte descrevemos uma atividade de nucleotidases presente em líquor de ratos, e finalmente, na terceira parte abordamos as perspectivas para futuros trabalhos. Os resultados obtidos pelo nosso grupo e por outros grupos internacionais relatam que a proteína S100B é um marcador inespecífico para evidenciar dano ou disfunção em doenças agudas e crônicas com envolvimento do SNC. Apesar de ser um marcador inespecífico, medidas dos níveis da proteína S100B tem grande sensibilidade para detectar uma resposta celular cerebral inespecífica. Além disso, demonstramos que estudos clínicos com esta proteína necessitam controles pareados por idade e sexo. A atividade nucleotidásica descrita no líquor de ratos hidrolisa preferencialmente o GDP e UDP comparado aos outros nucleotídeos. Nas perspectivas, os resultados mostrados são referentes a experimentos preliminares o que torna prematuro qualquer tipo de conclusão.

Efeito do glutamato sobre a secreção da proteína S100B em cultura de astrócitos hipocampais

A proteína S100B pertence à família S100 de proteínas ligantes de Ca+2. Sua expressão dá-se primariamente em astrócitos, os quais também secretam esta proteína, exercendo um papel trófico sobre as células vizinhas. A adição de S100B tem promovido a sobrevivência de neurônios em cultura e, recentemente, tem sido proposto um papel protetor da S100B contra a excitoxicidade. Neste trabalho investigamos a liberação de S100B na presença de alta concentração de glutamato. A secreção de S100B em astrócitos de ratos em cultura foi quantificada, pelo método de ELISA, durante 24 horas após uma privação de soro de 30 minutos (condição estimulada) ou não (condição basal). A integridade dos astrócitos foi analisada por ensaios de exclusão de azul de tripan e medida da LDH. Glutamato (1 mM) não teve efeito sobre a secreção basal de S100B, mas diminuiu a liberação 1h depois da privação de soro. A privação de soro que estimulou a liberação de S100B foi dependente de síntese protéica e reduzida por Rp-AMPc e H-89, sugerindo o envolvimento da via AMPc/PKA, possivelmente sobre o elemento sensível ao AMPc no gene de S100B. Além disso, a privação de soro foi acompanhada por um aumento transitório do conteúdo intracelular de AMPc. Nossos resultados sugerem que o proposto papel neurotrófico da S100B, pelo menos em cultura de astrócitos hipocampais, poderia estar prejudicado por altos níveis de glutamato. Não está claro ainda se o efeito do glutamato é medeado por receptores. Na tentativa de investigar o mecanismo envolvido usamos inibidores do transporte de glutamato e agonistas de glutamato. Os resultados indicam que ambos receptores metabotrópicos do Grupo I/II e transportadores de glutamato estão envolvidos no decréscimo da secreção de S100B induzida pelo glutamato.