Cerebral vasculature is the major target of oxidative protein alterations in bacterial meningitis

We have previously shown that antioxidants such as a-phenyl-tert-butyl nitrone or N-acetylcysteine attenuate cortical neuronal injury in infant rats with bacterial meningitis, suggesting that oxidative alterations play an important role in this disease. However, the precise mechanism(s) by which antioxidants inhibit this injury remain(s) unclear. We therefore studied the extent and location of protein oxidation in the brain using various biochemical and immunochemical methods. In cortical parenchyma, a trend for increased protein carbonyls was not evident until 21 hours after infection and the activity of glutamine synthetase (another index of protein oxidation) remained unchanged. Consistent with these results, there was no evidence for oxidative alterations in the cortex by various immunohistochemical methods even in cortical lesions. In contrast, there was a marked increase in carbonyls, 4-hydroxynonenal protein adducts and manganese superoxide dismutase in the cerebral vasculature. Elevated lipid peroxidation was also observed in cerebrospinal fluid and occasionally in the hippocampus. All of these oxidative alterations were inhibited by treatment of infected animals with N-acetylcysteine or alpha-phenyl-tert-butyl nitrone. Because N-acetylcysteine does not readily cross the blood-brain barrier and has no effect on the loss of endogenous brain antioxidants, its neuroprotective effect is likely based on extraparenchymal action such as inhibition of vascular oxidative alterations.

Antioxidants and protein oxidation

Proteins are susceptible to oxidation by reactive oxygen species, where the type of damage induced is characteristic of the denaturing species. The induction of protein carbonyls is a widely applied biomarker, arising from primary oxidative insult. However, when applied to complex biological and pathological conditions it can be subject to interference from lipid, carbohydrate and DNA oxidation products. More recently, interest has focused on the analysis of specific protein bound oxidised amino acids. Of the 22 amino acids, aromatic and sulphydryl containing residues have been regarded as being particularly susceptible to oxidative modification, with L-DOPA from tyrosine, ortho-tyrosine from phenylalanine; sulphoxides and disulphides from methionine and cysteine respectively; and kynurenines from tryptophan. Latterly, the identification of valine and leucine hydroxides, reduced from hydroperoxide intermediates, has been described and applied. In order to examine the nature of oxidative damage and protective efficacy of antioxidants the markers must be thoroughly evaluated for dosimetry in vitro following damage by specific radical species. Antioxidant protection against formation of the biomarker should be demonstrated in vitro. Quantification of biomarkers in proteins from normal subjects should be within the limits of detection of any analytical procedure. Further to this, the techniques for isolation and hydrolysis of specific proteins should demonstrate that in vitro oxidation is minimised. There is a need for the development of standards for quality assurance material to standardise procedures between laboratories. At present, antioxidant effects on protein oxidation in vivo are limited to animal studies, where dietary antioxidants have been reported to reduce dityrosine formation during rat exercise training. Two studies on humans have been reported last year. The further application of these methods to human studies is indicated, where the quality of the determinations will be enhanced through inter-laboratory validation.

P4-235 protein oxidation, lipid peroxidation and antioxidant status are similarly altered in Alzheimer disease and vascular dementia

Background: A large body of evidence supports a role of oxidative stress in Alzheimer disease (AD) and in cerebrovascular disease. A vascular component might be critical in the pathophysiology of AD. Objective(s): To evaluate the simultaneous behavior of a broad spectrum of peripheral antioxidants and biomarkers of oxidative stress in AD and vascular dementia (VaD). Methods: Sixty-three AD patients, 23 VaD patients and 55 controls were included in the study. We measured plasma levels of water-soluble (vitamin C and uric acid) and lipophilic (vitamin E, vitamin A, carotenoids including lutein, zeaxanthin, [3-cryptoxanthin, lycopene, c~- and [3-carotene) antioxidant micronutrients as well as levels of biomarkers of lipid peroxidation [malondialdehyde (MDA)] and of protein oxidation [immunoglobniin G (Ig G) levels of protein carbonyls and dityrosine] in patients and controls. Results: AD and VaD patients showed significantly decreased plasma levels of the water-soluble vitamin C and uric acid, of the lipophilic vitamin Eand vitamin A, and of the carotenoids lutein, zeaxanthin, 13-cryptoxanthin, lycopene and (x-carotene as compared to controls; among biomarkers of oxidative stress, only the content of dityrosine in Ig G was found to be significantly higher (p < 0.01) in AD patients as compared to controls; although a trend towards higher levels of dityrosine was also observed in VaD subjects compared to controls (6.3 4- 1.7 ~M in VaD patients vs. 5.1 4- 1.6 IxM in controls; p = 0.06), it did not reach statistical significance. In a cumulative analysis of all patient samples, a significant inverse association was found between plasma lycopene and MDA levels (r = -0.53, p < 0.0001). Conclusions: Independent of its nature-vascular or degenerativedementia is associated with the depletion of a large spectrum of antioxidant micronutrients and with increased protein oxidative modification. This might be relevant to the pathophysiology of dementing disorders, particularly in light of the recently suggested importance of the vascular component in AD development.

Oxidation of protein in human low-density lipoprotein exposed to peroxyl radicals facilitates uptake by monocytes; protection by antioxidants in vitro

Generation of neoepitopes on apolipoprotein B within oxidised low-density lipoprotein (LDL) is important in the unregulated uptake of LDL by monocytic scavenger receptors (CD36, SR-AI, LOX-1). Freshly isolated LDL was oxidised by peroxyl radicals generated from the thermal decomposition of an aqueous azo-compound. We describe that formation of carbonyl groups on the protein component is early as protein oxidation was seen after 90min. This is associated with an increased propensity for LDL uptake by U937 monocytes. Three classes of antioxidants (quercetin, dehydroepiandrosterone (DHEA) and ascorbic acid) have been examined for their capacity to inhibit AAPH-induced protein oxidation, (protein carbonyls, Δ electrophoretic mobility and LDL uptake by U937 monocytes). CD36 expression was assessed by flow cytometry and was seen to be unaltered by oxidised LDL uptake. All three classes were effective antioxidants, quercetin (P<0.01), ascorbic acid (P<0.01), DHEA (P<0.05). As LDL protein is the control point for LDL metabolism, the degree of oxidation and protection by antioxidants is likely to be of great importance for (patho)-physiological uptake of LDL by monocytes. © 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

Validation of protein carbonyl measurement:a multi-centre study

Protein carbonyls are widely analysed as a measure of protein oxidation. Several different methods exist for their determination. A previous study had described orders of magnitude variance that existed when protein carbonyls were analysed in a single laboratory by ELISA using different commercial kits. We have further explored the potential causes of variance in carbonyl analysis in a ring study. A soluble protein fraction was prepared from rat liver and exposed to 0, 5 and 15 min of UV irradiation. Lyophilised preparations were distributed to six different laboratories that routinely undertook protein carbonyl analysis across Europe. ELISA and Western blotting techniques detected an increase in protein carbonyl formation between 0 and 5 min of UV irradiation irrespective of method used. After irradiation for 15 min, less oxidation was detected by half of the laboratories than after 5 min irradiation. Three of the four ELISA carbonyl results fell within 95% confidence intervals. Likely errors in calculating absolute carbonyl values may be attributed to differences in standardisation. Out of up to 88 proteins identified as containing carbonyl groups after tryptic cleavage of irradiated and control liver proteins, only seven were common in all three liver preparations. Lysine and arginine residues modified by carbonyls are likely to be resistant to tryptic proteolysis. Use of a cocktail of proteases may increase the recovery of oxidised peptides. In conclusion, standardisation is critical for carbonyl analysis and heavily oxidised proteins may not be effectively analysed by any existing technique.

Ankyrin is the major oxidised protein in erythrocyte membranes from end-stage renal disease patients on chronic haemodialysis and oxidation is decreased by dialysis and vitamin C supplementation

Chronically haemodialysed end-stage renal disease patients are at high risk of morbidity arising from complications of dialysis, the underlying pathology that has led to renal disease and the complex pathology of chronic kidney disease. Anaemia is commonplace and its origins are multifactorial, involving reduced renal erythropoietin production, accumulation of uremic toxins and an increase in erythrocyte fragility. Oxidative damage is a common risk factor in renal disease and its co-morbidities and is known to cause erythrocyte fragility. Therefore, we have investigated the hypothesis that specific erythrocyte membrane proteins are more oxidised in end-stage renal disease patients and that vitamin C supplementation can ameliorate membrane protein oxidation. Eleven patients and 15 control subjects were recruited to the study. Patients were supplemented with 2 × 500 mg vitamin C per day for 4 weeks. Erythrocyte membrane proteins were prepared pre- and post-vitamin C supplementation for determination of protein oxidation. Total protein carbonyls were reduced by vitamin C supplementation but not by dialysis when investigated by enzyme linked immunosorbent assay. Using a western blot to detect oxidised proteins, one protein band, later identified as containing ankyrin, was found to be oxidised in patients but not controls and was reduced significantly by 60% in all patients after dialysis and by 20% after vitamin C treatment pre-dialysis. Ankyrin oxidation analysis may be useful in a stratified medicines approach as a possible marker to identify requirements for intervention in dialysis patients.

Avaliação do estrese oxidativo e da via L-arginina-óxido nítrico em plaquetas na gestação normal e na pré-eclâmpsia

A Pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome hipertensiva específica da gravidez, atualmente compreendida como uma doença sistêmica que cursa com inflamação, distúrbios da coagulação, desordens metabólicas, disfunção endotelial e desequilíbrio entre agentes vasoconstrictores e vasodilatadores. Contudo, a fisiopatologia da PE ainda não foi completamente elucidada. Este estudo investigou, em 51 gestantes, o estresse oxidativo, a via L-arginina-óxido nítrico e agregação plaquetária, na gestação normal (n=27) e na PE (n=24). Amostras de soro e plaquetas de gestantes normotensas e com PE, foram utilizadas para a medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a carbonilação de proteínas, a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), assim como a produção de óxido nítrico (NO) pela formação de nitrito. Nas plaquetas foram avaliados, também, o transporte de L-arginina, a atividade da óxido nítrico sintase (NOS) e a agregação plaquetária. Em amostras de plasma foram realizadas medidas da proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e do aminoácido L-arginina. Estes resultados demonstram que não há diferença nas medidas da proteína C reativa e da L-arginina entre gestantes normotensas e com PE. A formação de nitritos e a atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GPx se encontram reduzidas no soro de gestantes com PE, enquanto a medida de TBARS e a carbonilação de proteínas não foi diferente das gestantes normotensas. Em plaquetas, o transporte de L-arginina pelo sistema y+L está diminuído na PE, ao passo que, a atividade da NOS, a formação de nitrito e a agregação plaquetária não modificaram em relação a gestação normal. A carbonilação de proteínas está aumentada em plaquetas na PE e a atividade da CAT está reduzida. Concluiu-se, que a menor formação de nitrito no soro sugere uma menor produção de NO em pacientes com PE. Este dado correlaciona com uma redução da defesa antioxidante observada pela menor atividade das enzimas SOD, CAT, GPx que deve contribuir para uma maior inativação do NO. Apesar dos níveis plasmáticos normais de L-arginina na PE, o sistema de transporte via y+L está reduzido em plaquetas, o que pode estar associado em parte ao estresse oxidativo que contribui para alterações físicas e estruturais da membrana, podendo afetar o influxo do aminoácido. Apesar do transporte de L-arginina reduzido e do aumento do estresse oxidativo em plaquetas na PE, não houve alteração da atividade da NOS, da produção de NO e da agregação plaquetária, indicando que mecanismos compensatórios possam estar contribuindo para a manutenção da produção de NO e de sua função modulatória sobre a agregação

Função pulmonar, estresse oxidativo e marcadores inflamatórios na lesão pulmonar aguda induzida por lipopolissacarídeo: diferentes efeitos da atorvastatina, pravastatina e simvastatina

Nosso objetivo foi determinar que tipo de estatina pode atenuar a lesão pulmonar aguda (LPA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos da linhagem C57Bl/6. Trinta camundongos machos ( 23 g) foram divididos em 5 grupos (n=6 cada): grupo LPS (10 mg/kg) administrado intraperitonealmente (i.p.), LPS mais atorvastatina (10 mg/kg/dia; grupo LPS+A), LPS mais pravastatina (5 mg/kg/dia; grupo LPS+P) e LPS mais sinvastatina (20 mg/kg/dia; grupo LPS+S). O grupo controle recebeu salina i.p.. Em um grupo separado de camundongos (n=5), a soma das pressões pulmonares resistivas e viscoelásticas (DeltaPtot) e elastância estática (E[st]) foram medidas. Um dia após a administração de LPS os camundongos foram sacrificados (24 h) por deslocamento cervical e logo em seguida foi realizado lavado broncoalveolar (LBA). Os pulmões foram removidos para análise histopatológica e homogeneizados para análises bioquímicas (ELISA, catalase, superóxido dismutase, mieloperoxidase, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, carbonilação de proteínas e método de Griess). A quantidade de leucócitos foi menor no grupo LPS+P (p<0,01) e LPS+S (p<0,05) em comparação ao grupo LPS. Os níveis de MCP-1 e IL-6 reduziram no grupo LPS+P (p<0,01), enquanto o grupo LPS + S mostrou redução apenas nos níveis de IL-6 (p<0,05) em comparação ao grupo LPS. Marcadores redox (superóxido dismutase e catalase) foram menores no grupo LPS+A (p<0,01) em comparação ao grupo LPS. A peroxidação lipídica (malondialdeído e hidroperóxidos) diminuiu em todos os grupos tratados (p<0,05) quando comparados ao grupo LPS. A mieloperoxidase foi menor no grupo LPS+P (p<0,01) quando comparado ao grupo LPS. DeltaPtot e E(st) foram, significativamente, maiores no grupo LPS do que nos outros grupos. Nossos resultados sugerem que atorvastatina e pravastatina, mas não a sinvastatina, exibiram ações anti-inflamatórias e antioxidantes na LPA induzida por LPS.

Papel do sistema renina-angiotensina e do desequilíbrio redox em modelo experimental de pré-eclâmpsia induzida por L-NAME

Pré-eclâmpsia (PE), uma síndrome sistêmica da gestação caracterizada por proteinúria e hipertensão, está associada a uma significativa mortalidade tanto materna quanto fetal. Eentretanto, sua fisiopatologia ainda não é totalmente compreendida. Apesar de um expressivo aumento da atividade do sistema renina-angiotensina (SRA) na gestação normal, a pressão arterial não aumenta. Além disso, a redução da pressão de perfusão intra-uterina promove um aumento na liberação de espécies reativas de oxigênio que podem contribuir para a hipertensão na gestação. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi estudar o papel do SRA vascular, assim como, do estresse oxidativo plasmático, cardiorenal e placentário para a regulação cardiovascular materna em ratas normotensas e em modelo de PE induzida por L-NAME. Foi observado um aumento da pessão arterial em animais que receberal L-NAME. As ratas grávidas + L-NAME apresentaram um menor ganho de massa corporal durante a gestação, menor múmero de filhotes vivos, maior número de abortos, menor massa placentária total e fetos com menor massa corporal. Foi observada uma redução na resposta vasodilatadora induzida por acetilcolina (ACh) e angiotensina (Ang) II, aumento na resposta vasodilatadora induzida por nitroglicerina (NG) e aumento na resposta vasoconstritora induzida por fenilefrina (Phe) e Ang II em LAM de ratas grávida e não grávidas que receberam L-NAME. Não foi observada diferença na expressão dos receptores AT1 e AT2 e das enzimas ECA, ECA2 e eNOS. Foi observado um aumento na concentração plasmática de renina e bradicinina (BK) em ratas grávidas + L-NAME e uma redução na concentração de Ang 1-7. As ratas grávidas e grávidas + L-NAME apresentaram um aumento nos níveis séricos de estradiol. Os níveis de malondialdeído e carbonilação de proteínas estava aumentados e a atividade das enzimas antioxidantes SOD e GPx estavam reduzidas em ratas grávidas e não grávidas que receberam L-NAME. A atividade da CAT não apresentou diferença entre os grupos. Em conclusão, uma redução na vasodilatação induzida pela Ang II associada a um aumento da vasoconstrição promovida por este peptídeo, sugerem uma contribuição do SRA no desenvolvimento das complicações características da PE observadas no modelo experimental de PE induzido por L-NAME. Do mesmo modo, a peroxidação lipídica e oxidação de proteínas aumentadas, assim como, as atividades enzimáticas antioxidantes reduzidas sugerem a contribuição de uma defesa antioxidante comprometida e um dano oxidativo aumentado para o desenvolvimento da hipertensão e disfunção endotelial, aumento da mortalidade fetal e retardo do crescimento intra-uterino observados no modelo de PE estudado.

Efeito do extrato de Euterpe oleracea Mart.(Açaí) sobre a disfunção endotelial, estresse oxidativo e alterações vasculares e renais associados à hipertensão renovascular dois rins, 1 clip (2R,1C)

Estudos recentes mostram que o açaí é rico em polifenóis e uma dieta rica em polifenóis pode estar envolvida na proteção contra o risco cardiovascular. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento crônico de animais hipertensos 2R,1C com extrato hidroalcoólico do caroço do açaí (ASE) sobre o desenvolvimento da hipertensão e disfunção endotelial; estresse oxidativo e sobre as alterações vasculares e renais. Ratos Wistar machos foram utilizados para obtenção da hipertensão renovascular 2R,1C e ratos controles 2R (sham) foram somente submetidos à laparotomia e receberam tratamento diário com veículo ou ASE (200 mg/Kg/dia) durante 40 dias. A pressão arterial sistólica (PAS) foi aferida por pletismografia de cauda e os efeitos vasodilatadores da acetilcolina (ACh) e nitroglicerina (NG) foram estudados em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido e pré-contraído com norepinefrina. A atividade das enzimas SOD, CAT, GPx, os níveis de MDA, a carbonilação de proteínas e os níveis de nitrito foram avaliados por espectrofotometria. As expressões de enzimas pró e antioxidantes foram avaliadas por western blot. A atividade de MMP-2 foi avaliada por zimografia. Os níveis séricos de creatinina foram avaliados através de kit, por espectrofotometria. As alterações vasculares e renais foram avaliadas por microscopia de luz. A PAS foi maior nos animais 2R,1C, e o tratamento com ASE preveniu o desenvolvimento da hipertensão. O efeito vasodilatador reduzido da ACh em animais 2R,1C foi recuperado pelo ASE. O efeito vasodilatador da NG não foi diferente entre os grupos. O dano oxidativo avaliado pela peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas foi maior nos animais 2R,1C, e reduzido pelo tratamento com ASE. As atividades da SOD, CAT e GPx foram menores em amostras de mesentério, plasma, rim e coração de animais 2R,1C e o tratamento com ASE aumentou estas atividades. A produção de NO foi menor no plasma, mesentério e rim dos animais 2R,1C, e o tratamento com ASE aumentou a produção de NO somente no rim e mesentério destes animais. A expressão de SOD-1, 2, eNOS e TIMP-1 foram menores nos animais 2R,1C e o tratamento com ASE aumentou a expressão destas enzimas. A expressão de NOX-4 e MMP-2 e a atividade de MMP-2 foram maiores nos animais 2R,1C e o tratamento com ASE reduziu a expressão destas enzimas e a atividade de MMP-2. Os animais 2R,1C apresentaram um aumento na espessura da camada média da aorta e artéria mesentérica e um aumento na relação média/lúmen da aorta, e estas alterações foram prevenidas pelo ASE. Os níveis séricos aumentados de creatinina nos animais 2R,1C foram reduzidos por ASE. As alterações morfológicas renais nos animais 2R,1C foram prevenidas pelo ASE. Portanto, o tratamento com ASE previne o desenvolvimento da hipertensão, melhora a disfunção endotelial e previne as alterações vasculares e renais em ratos 2R,1C. A redução da atividade antioxidante e o aumento na peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas sugerem o envolvimento de um mecanismo deficiente da defesa antioxidante e de um dano oxidativo aumentado, os quais foram revertidos pelo ASE.

Efeito protetor do extrato hidroalcoólico de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) nas alterações renais, cardiovasculares e metabólicas induzidas pela restrição protéica materna durante a gestação

Alguns trabalhos demonstraram que a planta, Euterpe oleracea Mart. (açaí) é rica em polifenóis e que uma dieta rica em polifenóis pode estar envolvida na proteção contra o risco cardiovascular. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o extrato hidroalcoólico do caroço do açaí (ASE) (200mg/Kg/dia), sobre as alterações renais, cardiovasculares, metabólicas, morfológicas e o estresse oxidativo na prole adulta com dezesseis semanas, cujas mães foram submetidas a uma dieta hipoprotéica durante a gestação. Quatro grupos de ratas foram alimentados com dietas experimentais: controle (20% de proteínas); controle + ASE (20% de proteína + ASE); hipoprotéica (6% de proteína); hipoprotéica + ASE (6% de proteína + ASE) durante a gestação. Após o desmame, todos os filhotes passaram a ser alimentados com uma dieta controle e foram sacrificados com 4 meses de idade. A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida por pletismografia de cauda e o efeito vasodilatador da acetilcolina (ACh) e nitroglicerina (NG) foi avaliado em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido. Foram determinados o peso corporal, níveis séricos de colesterol total, triglicerídeos, lipoproteína de alta densidade (HDL), albumina, uréia, creatinina, glicose, insulina, resistência à insulina (índice de Homa IR), sódio, potássio e a renina plasmática. Foi avaliada a depuração de creatinina, volume de urina, excreção fracionada de sódio (EFNa) e o número de glomérulos renais. O dano oxidativo, níveis de nitrito e a atividade das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase foram dosados no plasma e homogenato de rim. O peso corporal foi menor no grupo hipoprotéico e recuperado com ASE. A PAS foi aumentada no grupo hipoprotéico e revertida pelo tratamento com ASE. Os níveis de renina plasmática foram aumentados no grupo hipoprotéico e reduzidos com ASE. A resposta vasodilatadora à ACh em LAM estava reduzida no grupo hipoprotéico com ASE houve uma melhora dessa resposta.O efeito vasodilatador da NG não foi diferente entre os grupos. No grupo hipoprotéico também foi observado o aumento dos níveis de triglicerídeos, colesterol total, uréia, creatinina, glicose e insulina, os mesmos foram reduzidos pelo ASE. Não houve diferença nos níveis de HDL, sódio, potássio, depuração de creatinina e volume urinário nos grupos estudados. Os níveis de malondialdeído e carbonilação de proteínas estavam aumentados e os níveis de nitrito reduzidos no grupo hipoprotéico e foram revertidos pelo ASE. As atividades das enzimas antioxidantes no plasma e no rim foram reduzidas no grupo hipoprotéico e aumentadas pelo ASE, com exceção da catalase que não apresentou diferença entre os grupos. Os animais hipoprotéicos apresentaram redução no número de glomérulos renais e aumento da EFNa e o tratamento com ASE preveniu as alterações renais encontradas neste modelo. Em conclusão, o ASE parece proteger a prole, cujas mães foram expostas a uma dieta com pouca proteína durante a gestação, através do efeito anti-hipertensivo, vasodilatador e antioxidante observado neste trabalho.

Active paraplegics are protected against exercise-induced oxidative damage through the induction of antioxidant enzymes

Exercise improves functional capacity in spinal cord injury (SCI). However, exhaustive exercise, especially when sporadic, is linked to the production of reactive oxygen species that may have a detrimental effect on SCI. We aimed to study the effect of a single bout of exhaustive exercise on systemic oxidative stress parameters and on the expression of antioxidant enzymes in individuals with paraplegia. The study was conducted in the Physical Therapy department and the Physical Education and Sports department of the University of Valencia. Sixteen paraplegic subjects were submitted to a graded exercise test (GET) until volitional exhaustion. They were divided into active or non-active groups. Blood samples were drawn immediately, 1 and 2 h after the GET. We determined plasma malondialdehyde (MDA) and protein carbonylation as markers of oxidative damage. Antioxidant gene expression (catalase and glutathione peroxidase-GPx) was determined in peripheral blood mononuclear cells. We found a significant increase in plasma MDA and protein carbonyls immediately after the GET (P<0.05). This increment correlated significantly with the lactate levels. Active paraplegics showed lower levels of exercise-induced oxidative damage (P<0.05) and higher exercise-induced catalase (P<0.01) and GPx (P<0.05) gene expression after the GET. These results suggest that exercise training may be useful in SCI patients to develop systemic antioxidant defenses that may protect them against exercise-induced oxidative damage.

Proteomic approach to oxidative stress in Daphnia magna

The keystone aquatic organism Daphnia magna is extensively used to assess the toxicity of chemicals. This has recently lead to an increase in the omics literature focusing on daphnids, an increase fuelled by the sequencing of the Daphnia pulex genome. Yet, no omics study has looked directly at oxidative stress (OS) in daphnids, even though OS is of primary importance in the response of aquatic organisms to their changing environment and is often induced by anthropogenic xenobiotics. This thesis thus focuses on the application of redox-proteomics, the study of the oxidative modification of proteins, to D. magna Specifically, daphnids were exposed to copper or paraquat, two well studied prooxidants, and protein carbonyls were labelled with fluorescein-5-thiosemicarbazide prior to twodimensional electrophoresis (2DE). This showed clearly that both compounds affect a different portion of the proteome. The identified proteins indicated that energy metabolism was affected by paraquat, while copper induced a reduction of the heat shock response (heat shock proteins, proteases and chaperones) a counterintuitive result which may be adaptative to metal toxicity in arthropods. The same approach was then applied to the study of the toxicity mechanism of silver nanoparticles (AgNP), an increasingly utilised form of silver with expected environmental toxicity, and its comparison to silver nitrate. The results demonstrate that, although less toxic than silver ions, AgNP toxicity functions through a different mechanism. AgNP toxicity is thus not a product of silver dissolution and increased protein carbonylation indicates that AgNP cause OS. Interestingly three of the four tested compounds altered vitellogenin levels and oxidation. Vitellogenins could thus represent an interesting subproteome for the detection of stress in daphnids. Finally, an experiment with oxidised BSA demonstrates the applicability of solid phase hydrazide in the enrichment of undigested carbonylated proteins.

Antioxidants and oxidative stress in BAL fluid of atopic asthmatic children

Earlier studies in adults have indicated that increased oxidative stress may occur in the blood and airways of asthmatic subjects. Therefore the aim of this study was to compare the concentrations of antioxidants and protein carbonyls in bronchoalveolar lavage fluid of clinically stable atopic asthmatic children (AA, n = 78) with our recently published reference intervals for nonasthmatic children (C, n = 124). Additionally, lipid peroxidation products (malondialdehyde) in bronchoalveolar lavage fluid and several antioxidants in plasma were determined. Bronchoalveolar lavage concentrations (median and interquartile range) of ascorbate [AA: 0.433 (0.294-0.678) versus C: 0.418 (0.253-0.646) micromol/L], urate [AA: 0.585 (0.412-0.996) versus C: 0.511 (0.372-0.687) micromol/L], alpha-tocopherol [AA: 0.025 (0.014-0.031) versus C: 0.017 (0.017-0.260) micromol/L], and oxidized proteins as reflected by protein carbonyls [AA: 1.222 (0.970-1.635) versus C: 1.243 (0.813-1.685) nmol/mg protein] were similar in both groups (p > 0.05 in all cases). The concentration of protein carbonyls correlated significantly with the number of eosinophils, mast cells, and macrophages in AA children only. Concentrations of oxidized proteins and lipid peroxidation products (malondialdehyde) correlated significantly in AA children (r = 0.614, n = 11, p = 0.044). Serum concentrations of ascorbate, urate, retinol, alpha-tocopherol, beta-carotene, and lycopene were similar in both groups whereas alpha-carotene was significantly reduced in asthmatics. Overall, increased bronchoalveolar lavage eosinophils indicate ongoing airway inflammation, which may increase oxidatively modified proteins as reflected by increased protein carbonyl concentrations.