Associação entre o proteassoma e o inibidor de protease BTCI : caracterização fisico-química e efeitos moleculares em células de câncer de mama (MCF-7)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2010.

Uso terapêutico de chaperones em doenças conformacionais

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Evolution and functional relevance of Ataxin-3 paralogues

O gene ataxin-3 (ATXN3; 14q32.1) codifica uma proteína expressa ubiquamente, envolvida na via ubiquitina-proteassoma e na repressão da transcrição. Grande relevância tem sido dada ao gene ATXN3 após a identificação de uma expansão (CAG)n na sua região codificante, responsável pela ataxia mais comum em todo o mundo, SCA3 ou doença de Machado-Joseph (DMJ). A DMJ é uma doença neurodegenerativa, autossómica dominante, de início tardio. O tamanho do alelo expandido explica apenas uma parte do pleomorfismo da doença, evidenciando a importância do estudo de outros modificadores. Em doenças de poliglutaminas (poliQ), a toxicidade é causada por um ganho de função da proteína expandida; no entanto, a proteína normal parece ser, também, um dos agentes modificadores da patogénese. O gene ATXN3 possui dois parálogos humanos gerados por retrotransposição: ataxin-3 like (ATXN3L) no cromossoma X, e LOC100132280, ainda não caracterizado, no cromossoma 8. Estudos in vitro evidenciaram a capacidade da ATXN3L para clivar cadeias de ubiquitina, sendo o seu domínio proteolítico mais eficiente do que o domínio da ATXN3 parental. O objetivo deste estudo foi explorar a origem e a evolução das retrocópias ATXN3L e LOC100132280 (aqui denominadas ATXN3L1 e ATXN3L2), assim como testar a relevância funcional de ambas através de abordagens evolutivas e funcionais. Deste modo, para estudar a divergência evolutiva dos páralogos do gene ATXN3: 1) analisaram-se as suas filogenias e estimou-se a data de origem dos eventos de retrotransposição; 2) avaliaram-se as pressões seletivas a que têm sido sujeitos os três parálogos, ao longo da evolução dos primatas; e 3) explorou-se a evolução das repetições CAG, localizadas em três contextos genómicos diferentes, provavelmente sujeitos a diferentes pressões seletivas. Finalmente, para o retrogene que conserva uma open reading frame (ORF) intacta, ATXN3L1, analisou-se, in silico, a conservação dos locais e domínios proteicos da putativa proteína. Ademais, para este retrogene, foi estudado o padrão de expressão de mRNA, através da realização de PCR de Transcriptase Reversa, em 16 tecidos humanos. Os resultados obtidos sugerem que dois eventos independentes de retrotransposição estiveram na origem dos retrogenes ATXN3L1 e ATXN3L2, tendo o primeiro ocorrido há cerca de 63 milhões de anos (Ma) e o segundo após a divisão Platirrínios-Catarrínios, há cerca de 35 Ma. Adicionalmente, outras retrocópias foram encontradas em primatas e outros mamíferos, correspondendo, no entanto, a eventos mais recentes e independentes de retrotransposição. A abordagem evolutiva mostrou a existência de algumas constrições selectivas associadas à evolução do gene ATXN3L1, à semelhança do que acontece com ATXN3. Por outro lado, ATXN3L2 adquiriu codões stop prematuros que, muito provavelmente, o tornaram num pseudogene processado. Os resultados da análise de expressão mostraram que o gene ATXN3L1 é transcrito, pelo menos, em testículo humano; no entanto, a optimização final da amplificação específica dos transcriptos ATXN3L1 permitirá confirmar se a expressão se estende a outros tecidos. Relativamente ao mecanismo de mutação inerente à repetição CAG, os dois parálogos mostraram diferentes padrões de evolução: a retrocópia ATXN3L1 é altamente interrompida e pouco polimórfica, enquanto a ATXN3L2 apresenta tratos puros de (CAG)n em algumas espécies e tratos hexanucleotídicos de CGGCAG no homem e no chimpanzé. A recente aquisição da repetição CGGCAG pode ter resultado de uma mutação inicial de CAG para CGG, seguida de instabilidade que proporcionou a expansão dos hexanucleótidos.Estudos futuros poderão ser realizados no sentido de confirmar o padrão de expressão do gene ATXN3L1 e de detetar proteína endógena in vivo. Adicionalmente, a caracterização da proteina ataxina-3 like 1 e dos seus interatores moleculares poderá povidenciar informação acerca da sua relevância no estado normal e patológico.

Characterization of proteotoxic stress in zebrafish

A fidelidade da síntese proteica é fundamental para a estabilidade do proteoma e para a homeostasia celular. Em condições fisiológicas normais as células têm uma taxa de erro basal associada e esta muitas vezes aumenta com o envelhecimento e doença. Problemas na síntese das proteínas estão associados a várias doenças humanas e aos processos de envelhecimento. De facto, a incorporação de erros nas proteínas devido a tRNAs carregados pelas aminoacil-tRNA sintetases com o amino ácido errado causa doenças neurodegenerativas em humanos e ratos. Ainda não é claro como é que estas doenças se desenvolvem e se são uma consequência directa da disrupção do proteoma ou se são o resultado da toxicidade produzida pela acúmulação de proteínas mal traduzidas ao nível do ribossoma. Para elucidar como é que as células eucarióticas lidam com proteínas aberrantes e agregados proteicos (stress proteotóxico) desenvolvemos uma estratégia para destabilizar o proteoma. Para isso estabelecemos um sistema de erros de tradução em embriões de peixe zebra que assenta em tRNAs mutantes capazes de incorporar erradamente serina nas proteínas. As proteínas produzidas neste sistema despoletam as vias de resposta ao stress, nomeadamente a via da ubiquitina-proteassoma (UPP – “ubiquitin protesome pathway”) e a via do retículo endoplasmático (UPR – “unfolded protein response”). O stress proteotóxico gerado pelos erros de tradução altera a expressão génica e perfis de expressão de miRNAs, o desenvolvimento embrionário e viabilidade, aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), leva ainda à acumulação de agregados proteicos e à disfunção mitocondrial. As malformações embrionárias e fenótipos de viabilidade que observámos foram revertidos por antioxidantes, o que sugere que os ROS desempenham papéis importantes nos fenótipos degenerativos celulares induzidos pela produção de proteínas aberrantes e agregação proteica. Estabelecemos ainda uma linha de peixe zebra transgénica para o estudo do stress proteotóxico. Este trabalho mostra que a destabilização do proteoma em embriões de peixe zebra com tRNAs mutantes é uma boa metodologia para estudar a biologia do stress proteotóxico visto que permite a agregação controlada do proteoma, mimetizando os processos de agregação de proteínas que ocorrem naturalmente durante o envelhecimento e em doenças conformacionais humanas.

Estudo do efeito de contaminantes na espécie sentinela, a amêijoa Ruditapes decussatus, por intermédio da análise da expressão proteica: aplicação à monitorização do meio marinho

Tese dout., Ciências e Tecnologias do Ambiente, 2009, Universidade do Algarve

Dissection of the early steps in the assembly of the 20S proteasome in Saccharomyces cerevisiae

Tese de dout., Bioquímica (Biologia Celular e Molecular), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010

The role of alpha-synuclein phosphorylation in synucleinopathies

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Adipose stromal vascular fraction cell sheets as vascular strategies for tissue engineering and regenerative medicine applications

Tese de mestrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015

Proteômica como estratégia para estudos dos mecanismos de ativação de mastócitos de ratos causados pelo peptídeo Protopolybia MP-III

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterização do Pythium insidiosum por abordagem proteômica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Metabolismo de proteínas na musculatura esquelética de animais diabéticos tratados com iogurte enriquecido com curcumina

A perda de massa muscular observada no diabetes mellitus (DM) tipo 1 é consequência da combinação entre redução na velocidade de síntese proteica e aumento na velocidade de proteólise. A curcumina, pigmento amarelo extraído dos rizomas de Curcuma longa L., promove diversos benefícios no metabolismo de carboidratos e lipídeos no DM. Deste modo, buscamos avaliar o efeito do tratamento de ratos diabéticos com curcumina incorporada em iogurte sobre o metabolismo proteico muscular. Ratos Wistar machos (150±10 g) receberam estreptozotocina (40 mg/kg, i.v.) para indução do DM e foram divididos nos grupos (n=8): diabético tratado com iogurte (DIOG), 90 mg/kg de curcumina (DC90), 4U de insulina (DINS) e ratos normais, não diabéticos, tratados com iogurte (NIOG). Após 35 dias de tratamento, os animais foram eutanasiados e os músculos esqueléticos soleus e extensor digitorium longus (EDL) foram retirados e utilizados para a determinação das atividades proteolíticas de caspase-3, calpaína e proteassoma (atividade quimiotripsina-like). O tratamento de animais diabéticos com curcumina incorporada em iogurte reduziu a glicemia, os níveis de ureia urinária e promoveu um maior ganho de peso corporal em relação aos animais diabéticos tratados somente com iogurte (DIOG). Animais DIOG apresentaram um aumento nas atividades de calpaína e proteassoma em músculos soleus e EDL em relação aos valores encontrados em músculos de animais NIOG; já o tratamento com curcumina reduziu as atividades de calpaína e proteassoma em EDL de ratos diabéticos, o que explica, pelo menos em parte, a menor perda de massa deste músculo em ratos DC90. Houve uma redução na atividade de caspase-3 em músculos de animais DIOG em comparação aos grupos...

Metabolismo de proteínas na musculatura esquelética de animais diabéticos tratados com iogurte enriquecido com curcumina

A perda de massa muscular observada no diabetes mellitus (DM) tipo 1 é consequência da combinação entre redução na velocidade de síntese proteica e aumento na velocidade de proteólise. A curcumina, pigmento amarelo extraído dos rizomas de Curcuma longa L., promove diversos benefícios no metabolismo de carboidratos e lipídeos no DM. Deste modo, buscamos avaliar o efeito do tratamento de ratos diabéticos com curcumina incorporada em iogurte sobre o metabolismo proteico muscular. Ratos Wistar machos (150±10 g) receberam estreptozotocina (40 mg/kg, i.v.) para indução do DM e foram divididos nos grupos (n=8): diabético tratado com iogurte (DIOG), 90 mg/kg de curcumina (DC90), 4U de insulina (DINS) e ratos normais, não diabéticos, tratados com iogurte (NIOG). Após 35 dias de tratamento, os animais foram eutanasiados e os músculos esqueléticos soleus e extensor digitorium longus (EDL) foram retirados e utilizados para a determinação das atividades proteolíticas de caspase-3, calpaína e proteassoma (atividade quimiotripsina-like). O tratamento de animais diabéticos com curcumina incorporada em iogurte reduziu a glicemia, os níveis de ureia urinária e promoveu um maior ganho de peso corporal em relação aos animais diabéticos tratados somente com iogurte (DIOG). Animais DIOG apresentaram um aumento nas atividades de calpaína e proteassoma em músculos soleus e EDL em relação aos valores encontrados em músculos de animais NIOG; já o tratamento com curcumina reduziu as atividades de calpaína e proteassoma em EDL de ratos diabéticos, o que explica, pelo menos em parte, a menor perda de massa deste músculo em ratos DC90. Houve uma redução na atividade de caspase-3 em músculos de animais DIOG em comparação aos grupos...

Análise proteômica de células não fagocíticas na fase inicial da infecção por trypanosoma cruzi

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015.