Inibi����o do v��rus da hepatite C utilizando siRNAs direcionados para o genoma viral e proteínas celulares Hsps

P��s-gradua����o em Microbiologia - IBILCE

An��lise da express��o das proteínas celulares p53, p16 e ciclina D1 em amostras de tumores penianos

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Imunidade celular: caracteriza����o das proteínas celulares que inibem a infec����o viral

Disserta����o para obten����o do grau de Mestre no Instituto Superior de Ci��ncias da Sa��de Egas Moniz

Caracteriza����o da intera����o entre a proteínas NS5 do v��rus da febre amarela e EIF3L

P��s-gradua����o em Microbiologia - IBILCE

Caracteriza����o funcional de HTRA1 em linhagens celulares HPV positiva e HPV negativa

Coordena����o de Aperfei��oamento de Pessoal de N��vel Superior (CAPES)

UMA ABORDAGEM YEAST TWO-HYBRID PARA O ESTUDO DA REPLICA����O E PATOG��NESE DO V��RUS DA HEPATITE DELTA

O v��rus da hepatite delta (HDV) �� o agente etiol��gico de uma das formas mais graves de hepatite viral e �� ainda end��mico em diversas regi��es do globo, nomeadamente em ��frica, na Amaz��nia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepat��citos infectados com o v��rus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associa����o cl��nica entre os dois v��rus deve-se ao facto do inv��lucro do HDV ser constitu��do pelos antig��nios de superf��cie do HBV (HBsAgs) que s��o necess��rios para a propaga����o da infec����o. O genoma do HDV �� constitu��do por uma mol��cula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma ��nica grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antig��nio delta (HDAg). A ocorr��ncia de um mecanismo de editing do RNA, resulta na express��o de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). V��rias fun����es essenciais para a replica����o do HDV t��m sido atribu��das a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumula����o de RNA viral e a L-HDAg respons��vel pela interac����o com os HBsAgs para formar part��culas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replica����o viral depende das interac����es estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do n��mero consider��vel de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a import��ncia de muitas destas interac����es n��o foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replica����o do HDV permanecem pouco claras. Para al��m disso, dado o n��mero limitado de factores do hospedeiro que est��o envolvidos na sua replica����o, �� muito prov��vel que um n��mero elevado de interactores do HDV permane��a por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identifica����o de proteínas de f��gado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta proteínas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas proteínas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas caracter��sticas funcionais, foram seleccionadas tr��s destas proteínas e as suas interac����es com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As tr��s proteínas seleccionadas foram a ribonucleoprote��na nuclear heterog��nea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a prote��na 2 de liga����o a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras s��o proteínas de liga����o a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replica����es de outros v��rus com genoma RNA, enquanto a EBP2, �� uma prote��na de localiza����o preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interac����es foram analisadas recorrendo a v��rios ensaios bioqu��micos. No caso da hnRNPC e da HuR, ap��s valida����o no sistema YTH, a capacidade de interac����o com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipita����o em c��lulas de hepatoma humano. Nas mesmas c��lulas, observou-se uma co-localiza����o consider��vel entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribui����o das proteínas hnRNPC e HuR na replica����o do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas proteínas pela utiliza����o de short hairpin RNAs (shRNAs) espec��ficos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as proteínas hnRNPC e HuR end��genas, individualmente resultou numa diminui����o acentuada nos n��veis de express��o dos HDAgs. No que respeita �� EBP2, a interac����o com a S-HDAg foi confirmada em condi����es in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A an��lise por imunofluoresc��ncia indirecta e microscopia confocal revelou co-localiza����o elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nucl��olos de c��lulas de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importa����o dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o prop��sito de identificar proteínas celulares capazes de interagir com um dom��nio espec��fico dos HDAgs, o sinal de localiza����o nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina ��4 (KPNA4). A interac����o da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condi����es in vitro atrav��s de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas proteínas. Este trabalho permitiu identificar v��rias proteínas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evid��ncias sugestivas de que algumas das proteínas identificadas podem desempenhar fun����es importantes no ciclo de replica����o do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replica����o do v��rus.

Avalia����o de efeitos de um extrato aquoso de cinnamomum zeylanicum L. na marca����o de constituintes sangu��neos com tecn��cio-99m e na morfologia das hem��cias de ratos wistar

Radiobiocomplexes are used to obtain images in nuclear medicine and employed in basic research. Blood constituents labeled with technetium-99m (99mTc) have also been employed as radiobiocomplexes and used also experimental model for evaluation of the biological effects of natural or synthetic drugs. The analysis of the morphology and the morphometrics parameters (perimeter/��rea ratio) can be used to evaluate the effects of drugs upon the structure of the membrane of red blood cells. Cinnamomum zeylanicum (cinnamon) is a spice used as herbal medicine to treat diseases. The aim of this study was to evaluate the effect of in vitro and in vivo treatment with an aqueous cinnamon extract on the labeling of blood constituents with 99mTc and on the morphology of red blood cells from Wistar rats. In the in vitro treatment, isolated blood sample from animals were incubated with cinnamon extract. In the in vivo treatment, blood samples were also withdrawn from animals treated with cinnamon extract. In both cases, the radiolabeling of blood constituents was done. The morphological analysis of red blood cells was also done. As control, blood or animals treated with NaCl 0.9%. The data obtained on the labeling of blood constituents with 99mTc experiments indicated that the in vitro treatment with cinnamon extract was capable to decrease signiicantly (p<0.05) the percentage of radioactivity in cellular compartments and on the fixation of cellular and plasma proteins. These effects were not observed on the in vivo treatment. The results obtained for the morphology of red blood cells suggest that the in vitro and in vivo treatments did not alter the morphology and the perimeter/area ratio. The in vitro treatment with aqueous cinnamon extract could affect the membrane structures related with the oxidation status of the stannous ion pertechnetate ion, altering the labeling of blood constituentes with 99mTc. This study was a multidisciplinary experimental research. It was developed with the contribution of the different Departments and Services of the Hospital Universit��rio Pedro Ernesto of the Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Efeito de um extrato de Artem��sia Vulgaris L. marca����o in vitro de constituintes sangu��neos com tecn��cio-99m em ratos wistar

Artemisia vulgaris L..is used in folk medicine and in Traditional Chinese Medicine (TCM). This medicinal plant has been utilized as anticonvulsive, analgesic, antispasmodic effect, rheumatic pains, menstrual dyspepsia, asthenia, epilepsy, hepatitis, fevers, anemia and to expel parasites. In nuclear medicine, blood constituents are labeled with technetium-99m (99mTc) and used as radiopharmaceuticals (radiobiocomplexes). Authors have been described that synthetic and/or natural drugs could modify the labeling of blood constituents with 99mTc. The aim of this work was to evaluate the effects of an aqueous extract of Artemisia vulgaris L. on the labeling of blood constituents with 99mTc. Blood samples withdrawn of Wistar rats were incubated with Artemisia vulgaris L, stannous chloride and 99mTc, as pertechnetate ion. Aliquots of plasma (P) and blood cells (BC) were isolated. Aliquots of P and BC were also precipitated with trichloroacetic acid and soluble (SF) and insoluble (IF) fractions were separated. The radioactivity in each fraction was counted and the percentages of radioactivity (%ATI) were calculated. Artemisia vulgaris L. extract decreased significantly (p<0.05) the %ATI on BC and on IF-BC. The analysis of the results indicates that the extract could have substances that could interfere on the transport of stannous through the erythrocyte membrane altering the labeling of blood cells with 99mTc. Working in this study was a multidisciplinary group, with Phisical therapists, Biomedicals, Physicals, Pharmacists, Biologists, Statistics and Physicians.

Avalia����o de efeitos de um extrato de "tr��s bailarinas" em modelos experimentais em diferentes n��veis de organiza����o biol��gica

Drogas naturais ou sint��ticas podem ser capazes de alterar a sobreviv��ncia de culturas bacterianas, interferir na marca����o de estruturas sangu��neas com tecn��cio- 99m (99mTc) e alterar a morfologia das hem��cias. De acordo com as instru����es do fabricante, a formula denominada de Tr��s Bailarinas (TB) �� sugerida para ser usada, como bebida, por pessoas que desejam ajustar o peso sem dieta. Os ingredientes dessa f��rmula s��o a Cassia angustifolia e a Malva verticellate. Informa����es cientificas sobre TB n��o foram encontradas no indexador PubMed, e esse fato tem estimulado nossas investiga����es sobre seus efeitos biol��gicos. O objetivo deste estudo foi avaliar, em diferentes modelos experimentais, o efeito de um extrato aquoso de Tr��s Bailarinas: (i) na sobreviv��ncia de culturas de E. coli AB1157, ii) efeito do SnCl2 em culturas bacterianas, iii) na marca����o das hem��cias e proteínas plasm��ticas e celulares com 99mTc e iv) na morfologia de hem��cias de sangue de ratos Wistar. Os resultados encontrados demonstram que o extrato de TB n��o alterou a sobreviv��ncia de cultura de E. coli AB1157 e aboliu o efeito letal do SnCl2 na sobreviv��ncia dessa cultura bacteriana. Na marca����o de estruturas sang����neas com 99mTc o extrato de TB reduziu a percentagem de atividade (%ATI) referente ao 99mTc no compartimento celular e nas proteínas plasm��ticas, mas n��o alterou a %ATI nas proteínas celulares. O extrato de TB n��o foi capaz de alterar a morfologia das hem��cias. Os modelos experimentais realizados mostram a import��ncia dos mesmos na avalia����o de efeitos biol��gicos de agentes qu��micos, e contribui para um melhor entendimento das propriedades do extrato de Tr��s Bailarinas. Esse trabalho abrange varias ��reas do conhecimento, tais como: radiobiologia, bot��nica, fitoterapia e hematologia

An��lise comparativa dos genomas de Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Gallinarum biovares Gallinarum 287/91 e Pullorum 449/87 para identifica����o de regi��es de diferen��as (RODs)

P��s-gradua����o em Microbiologia Agropecu��ria - FCAV

Complexo xilanol��tico de Penicillium sclerotiorum: produ����o, purifica����o e caracteriza����o de xilanases e de ��-xilosidases

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Associa����o entre o proteassoma e o inibidor de protease BTCI : caracteriza����o fisico-qu��mica e efeitos moleculares em c��lulas de c��ncer de mama (MCF-7)

Disserta����o (mestrado)���Universidade de Bras��lia, Instituto de Ci��ncias Biol��gicas, Departamento de Biologia Celular, P��s-Gradua����o em Biologia Molecular, 2010.

Avalia����o do potencial antiproliferativo do Dendr��mero de Poliglicerol associado ao celecoxibe em linhagens celulares de carcinoma epidermoide de cabe��a e pesco��o

Diversos mecanismos celulares est��o associados �� patog��nese do Carcinoma Epidermoide de Cabe��a e Pesco��o (CECP). Algumas dessas altera����es envolvem proteínas pertencentes �� via de sinaliza����o do Akt, e o fator de transcri����o NF-kB, o qual t��m importante papel na fisiologia normal e no c��ncer. A prote��na COX-2, descrita em processos inflamat��rios, tamb��m participa da carcinog��nese e est�� associada com a via de sinaliza����o do Akt e com o NF-kB. Dendr��meros s��o uma forma ��nica de nanotecnologia, surgindo como nanotransportadores com a capacidade de penetrar na c��lula tumoral liberando drogas quimioter��picas em seu interior. Os benef��cios desta tecnologia s��o o aumento da eficic��cia do princ��pio ativo utilizado e a redu����o dos seus efeitos secund��rios t��xicos. O Celecoxibe, antiinflamat��rio n��o esteroidal, inibidor seletivo da COX-2, tem se mostrado um importante agente anticarcinog��nico, no entanto seu mecanismo de a����o no CECP n��o �� totalmente compreendido. Neste trabalho, um Dendr��mero de Poliglicerol associado ao Celecoxibe (PGLD-celecoxibe) foi sintetizado e caracterizado por t��cnicas de espectroscopia ��H-RMN, ����C-RMN, Maldi-Tof, TLC e DSC. Al��m disso, o conjugado foi testado in vitro em tr��s linhagens celulares de CECP. O PGLD-Celecoxibe foi sintetizado com sucesso e promoveu a redu����o da dose capaz de inibir a prolifera����o celular, reduzindo o IC 50 do Celecoxibe de forma significativa em todas as linhagens celulares, se aproximando da dose s��rica alcan��ada por este medicamento, resultado corroborado pelo Ensaio de Migra����o Celular. O mecanismo de morte celular observado foi a apoptose, associada a diminui����o significativa da express��o de COX-2 ou por uma via alternativa independente. Alguns dos grupos tratados apresentaram altera����o na express��o das proteínas pAkt e NF-kB.

Caracteriza����o bioqu��mica de soros de bezerros utilizados na manuten����o de culturas celulares usadas em virologia

Oito lotes de soros de bezerros com idade maior ou menor de seis meses, usados para suplementar meios de cultivo de linhagens de c��lulas de uso difundido em virologia, foram testados quanto �� sua capacidade promotora de crescimento (CPC) e classificados como bons promotores ou promotores pobres. Foram pesquisados par��metros relacionados com macronutrientes para estabelecer o perfil bioqu��mico daqueles lotes. Os resultados obtidos podem ser considerados valores normais para animais aparentemente sadios. As varia����es que ocorreram para um mesmo par��metro bioqu��mico, entre os resultados da pesquisa e os de alguns estudos existentes na literatura, podem ser atribu��das �� metodologia utilizada, �� ra��a e idade dos animais, ou mesmo �� pr��pria dieta regional. A an��lise estat��stica, realizada pela aplica����o do teste "t" de Student aos valores das m��dias e dos desvios padr��o, demonstrou que, com rela����o ��s fra����es s��ricas, n��o ocorreram diferen��as significantes entre soros de CPC celular boa ou pobre, considerando-se t c=2,45, enquanto que, para soros animais maiores ou menores de seis meses, apenas os resultados relativos ��s fra����es alfa e beta (t=2,68 e 2,61, respectivamente) apresentaram signific��ncia, sendo superiores ao t cr��tico. Ficou evidenciado que a avalia����o do conjunto de par��metros bioqu��micos pesquisados n��o permite diferenciar soros pertencentes aos dois grupos de animais, isto ��, identificar soros de boa ou de pobre CPC, ou soros de bezerros maiores ou menores de seis meses de idade

Estudios sobre aspectos bioqu��micos, moleculares y funcionales de proteínas del citoesqueleto

Los microt��bulos son elementos del citoesqueleto celular y est��n constituidos por tubulina, la prote��na cuantitativamente m��s importante y proteínas asociadas a microt��bulos (MAPs) conocidas como HMW y tau. En la c��lula los microt��bulos participan en numerosas funciones. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, la red de microt��bulos se encuentra disminuida y se observa un ac��mulo de manojos de filamentos de tau hiperfosforilada. En este proyecto se estudiar�� de qu�� manera el grado de fosforilaci��n de tau influye sobre la formaci��n de microt��bulos y sobre la interacci��n con tubulina, tau normal, MAP 1 Y MAP 2. Se espera tener un mayor conocimiento acerca de las causas por las cuales, en la enfermedad de Alzheimer, hay una alteraci��n en la formaci��n de microt��bulos y un ac��mulo de filamentos helicoidales de tau hiperfosforilada. Otros aspectos de nuestros estudios est��n dirigidos a conocer la funci��n post-traducci��n de detirosinaci��n-tirosinaci��n de la tubulina. En esta reacci��n participan dos enzimas: una carboxipeptidasa que remueve la tirosina del terminal COOH de la tubulina alfa y una ligasa que es capaz de reincorporar la tirosina removida. En este proyecto est�� programado obtener el cDNA de la ligasa de rata y analizar la secuencia y la expresi��n de la enzima, "in vivo", en diferentes tejidos. El rol funcional de la ligasa ser�� analizado en l��neas celulares y en cultivos primarios de c��lulas neuronales y no neuronales. Por ��ltimo, otro aspecto en estudio est�� relacionado al reciente hallazgo en nuestro laboratorio, de que la tubulina hidrof��bica de membrana no es, como se ven��a sosteniendo desde hac��a varios a��os, una prote��na integral de membrana sino una prote��na perif��rica. De acuerdo a nuestros resultados esta prote��na contiene una alta proporci��n de la isoespecie acetilada. Aparentemente nuestros resultados indican que la prote��na hidrof��bica proviene de microt��bulos que interaccionan con membranas. Nuestro objetivo es establecer si el car��cter hidrof��bico constituye una propiedad intr��nseca de la tubulina (que parece poco probable) o a la interacci��n con un componente de membrana. Los objetivos generales correspondientes al presente proyecto comprenden: a) Estudios acerca del rol que cumplen las MAPs en el mecanismo de la degeneraci��n neurofibrilar en la Enfermedad de Alzheimer. b) Estudios moleculares acerca de la reacci��n de tirosinaci��n/detirosinaci��n de la tubulina: Rol funcional de la tubulina tirosina ligasa. c) Estudios acerca de las propiedades de la tubulina de membrana.