Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados como método de genotipificación de aislamientos clínicos de mycobacterium tuberculosis.

Tesis (Doctor en Ciencias con Especialidad en Biotecnología) UANL, 2009.

Utilización de marcadores morfológicos y moleculares AFLP en la identificación de germo plasma nativo y cultivado de Elymus scabrifolius (Poaceae)

Elymus scabrifolius es una gramínea perenne nativa de Sudamérica con gran potencial como recurso forrajero para ambientes con limitantes edáficas. En el presente trabajo se analizó la utilización de caracteres morfológicos y marcadores moleculares AFLP para la identificación genotípica de seis accesiones, un cultivar comercial y siete híbridos artificiales de esta especie. Ambos tipos de marcadores permitieron diferenciar a los materiales analizados en los respectivos dendrogramas, aunque las relaciones entre materiales variaron según el tipo de marcador. El Análisis de Componentes Principales permitió identificar las variables más relevantes para la diferenciación morfológica. Los híbridos se diferenciaron morfológicamente de ambos parentales, excepto un híbrido que se agrupó con su material paterno. Aunque en el análisis de los marcadores AFLP los híbridos se agruparon con uno de sus parentales, se pudo corroborar su origen híbrido mediante el registro de bandas paternas y polimórficas entre parentales. Se concluye que las metodologías empleadas para caracterizar los materiales analizados de E. scabrifolius serían de gran utilidad para el manejo eficiente de colecciones de germoplasma como así también para su utilización en programas de mejoramiento genético.

Caracterización de un cepario de levaduras para uso enológico mediante técnicas moleculares

La Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Cuyo posee una colección de levaduras vínicas provenientes de Departamentos de importancia vitivinícola de la provincia de Mendoza. Esta colección ha sido constituida a fin de disponer de material para su uso de acuerdo a diferentes objetivos enológicos. La finalidad de este estudio fue caracterizar microorganismos representantes de esta colección mediante técnicas moleculares. Para un total de 56 cepas analizadas se encontraron 39 patrones diferentes según la técnica de diferenciación intraespecífica para S. cerevisiae, PCR interdelta. La mayoría de las levaduras analizadas mostraron un perfil molecular único, aunque se observaron algunas coincidencias. Cinco patrones moleculares interdelta agruparon individuos que presentaron similitudes en su perfil de bandas aún cuando fenotípicamente habían sido considerados como diferentes en trabajos anteriores. Mediante la construcción de un dendrograma, utilizando la metodología UPGMA, se realizó el agrupamiento de los patrones PCR interdelta obtenidos para todas las cepas analizadas, con la finalidad de visualizar cómo se relacionan y/o agrupan la totalidad de los individuos en base a las semejanzas en sus perfiles moleculares. Por otro lado, se analizó la similitud encontrada a nivel molecular entre cepas con respecto a las características fenotípicas generales y de importancia tecnológica para poder comparar si su comportamiento también fue similar a este nivel, observándose que las cepas agrupadas en tres de estos cinco patrones repetidos, también presentaron similitudes en las mencionadas características coincidiendo también en su procedencia. Por otro lado, se realizó una comparación visual de los principales patrones obtenidos con respecto a patrones Interdelta de cepas comerciales, pudiendo verificarse la similitud de dos patrones de la colección con aislados comerciales. Con el propósito de confirmar si efectivamente las levaduras que presentaron similitud según el análisis interdelta, corresponden a una misma cepa, se realizó un nuevo análisis intraespecífico aplicando otro marcador molecular: polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción del ADN mitocondrial (RFLP del ADN mitocondrial). Finalmente pudo observarse que de 56 cepas analizadas solo tres pares resultaron idénticos y las restantes 50 cepas serían diferentes entre sí según las técnicas utilizadas. Además podemos agregar que 11 de 56 individuos analizados no resultaron idénticos pero, dada su elevada similitud, probablemente comparten un parentesco cercano. El uso de herramientas moleculares es necesario por la importancia de preservar los recursos genéticos. La completa y correcta caracterización de los cultivos microbianos, requiere de la inclusión de herramientas moleculares que permitan asignar una identidad completa a los aislados y evitar errores como la repetición de cepas idénticas o el descarte de cepas consideradas iguales por falta de información.

Caracterização e diversidade molecular do transposon Tn1546, carreador do gene vanA, responsável pela expressão de resistência à vancomicina, em amostras clínicas de diferentes espécies de Enterococcus

Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são reconhecidos como importantes patógenos causadores de infecções nosocomiais, configurando um grave problema de saúde pública, principalmente pela escassez de opção terapêutica eficaz. O fenótipo de resistência VanA é o mais frequente, sendo definido pela resistência a altos níveis de vancomicina e teicoplanina. VanA é caracterizado por um conjunto gênico (vanRSHAXYZ) localizado no elemento genético móvel denominado transposon Tn1546. A diversidade de Tn1546 resulta de alterações estruturais promovidas por deleções ou integração de sequências de inserção (IS) que, exercem papel chave na evolução do elemento VanA, modificando os aspectos relacionados à sua transferência e expressão do fenótipo. O objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar o polimorfismo de elementos Tn1546 presentes em amostras de diferentes espécies de Enterococcus isoladas em instituições hospitalares do Estado do Rio de Janeiro no período de 2000 a 2012. Foram incluídas neste estudo 70 amostras VRE que foram caracterizadas quanto ao gênero, espécies e genótipo de resistência aos glicopeptídeos por métodos convencionais e PCR multiplex. A susceptibilidade a 17 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em ágar, e concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina e teicoplanina foi determinada por microdiluição em caldo. O tranposon foi obtido após lise das células bacterianas e amplificação por PCR longo, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para a região repetida e invertida que flanqueia este elemento genético. A diversidade dos elementos Tn1546 foi avaliada por um conjunto de métodos moleculares que incluiu a análise do polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), utilizando-se a endonuclease ClaI, amplificação de segmentos internos por PCR de sobreposição de oligonucleotídeos (overlapping PCR) e detecção de sequências de inserção (ISs). A caracterização em espécies considerada para as demais análises foi obtida pela metodologia de PCR de acordo com a seguinte distribuição: E. avium (N=6), E. faecalis (N=12), E. faecium (N=46), E. gallinarum (N=4) e E. raffinosus (N=2). Todas as amostras apresentaram o genótipo vanA. Nos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foi observado que todas as amostras foram multirresistentes, sendo resistente de 6 a 13 dentre os 17 antimicrobianos testados. A presença de elementos semelhantes ao arquétipo de Tn1546 foi observada em 61,5% das amostras; entretanto, 27 amostras apresentaram perfis variantes de Tn1546. Foram identificados nove perfis de RFLP, dentre 66 avaliadas, sendo o perfil I, prevalente e semelhante ao arquétipo de Tn1546. Não foi possível analisar quatro amostras por RFLP. Os produtos de amplificação de Tn1546 alterados, obtidos pela overlapping PCR e pelo rastreamento de IS, levaram à classificação de 15 tipos polimórficos, nomeados de A a O. A maioria dos Tn1546 polimórficos teve suas regiões de ORF1 e/ou ORF2 deletadas; e IS1542 juntamente com IS1216V foram as inserções mais frequentes, que em muitas situações compartilhavam a mesma região de inserção. IS19 foi detectada apenas na região vanS-vanH. Os dados apresentados neste estudo indicam que o polimorfismo de Tn1546 pode ser explorado no rastreamento de rotas de transmissão, acompanhamento da dispersão de elementos VanA e investigação da evolução de amostras VRE.

Epidemiologia molecular da tuberculose resistente a múltiplos fármacos no Rio Grande do Sul

A tuberculose resistente a múltiplos fármacos (TB MDR) é definida como uma forma de tuberculose (TB) causada por Mycobacterium tuberculosis resistente a pelo menos isoniazida e rifampicina. A TB MDR é um problema mundial crescente resultante da não adesão dos pacientes ao tratamento e pelo gerenciamento ineficaz da doença pelos sistemas de saúde. Este estudo foi realizado com o objetivo de identificar os fatores de risco e os padrões de transmissão da TB MDR no Estado do Rio Grande do Sul, comparando os resultados obtidos com aqueles casos de TB suscetíveis aos fármacos. Durante os anos de 1999 e 2000 foram identificados 60 isolados MDR no Laboratório Central do RS (LACEN) e 202 isolados suscetíveis aos fármacos anti-TB. Estes isolados foram analisados utilizando a técnica de Polimorfismo do Tamanho dos Fragmentos de Restrição (RFLP) baseado no IS6110. Os dados clínicos e demográficos dos pacientes portadores destas linhagens também foram analisados. Nos isolados que apresentaram seis ou menos cópias de IS6110 foi realizada uma segunda técnica de genotipagem, o Spoligotyping. Os pacientes portadores de linhagens de M. tuberculosis com padrões idênticos foram considerados clusters. Foi observado que entre os 262 isolados, 94 (36%) pertenciam a 20 distintos clusters, e após a análise por Spoligotyping, 89 destes isolados (34%) permaneceram em cluster. Os isolados MDR não diferiram estatisticamente dos isolados suscetíveis na proporção de formação de cluster. Foi observada associação significante entre a ocorrência de TB MDR e tratamento prévio (p < 0,001) e falência no tratamento (p < 0,001). No entanto, os pacientes HIV positivos foram associados com TB suscetível (p = 0,024). Também foi identificado que pacientes não casados desenvolveram mais TB devida à transmissão recente (p < 0,005). A introdução da terapia supervisionada de curta duração (DOTS) no RS será importante, pois auxiliará na diminuição das taxas de falência e abandono de tratamento, evitando o desenvolvimento de novas linhagens MDR.

Tuberculose e o estudo molecular da sua epidemiologia

Systems that can distinguish epidemiologically-related Mycobacterium tuberculosis strains from unrelated ones are extremely valuable. Molecular biology techniques have allowed a great deal of information to be acquired about the infectious disease tuberculosis (TB) that was very hard or impossible to obtain by conventional epidemiology. A typing method based on bacterial DNA genome differences, known as RFLP (restriction fragment length polymorphism), is widely used to discriminate strains in the epidemiologic study of TB. However, RFLP is laborious and there is a tendency to replace it by other methods. Thus, other DNA sequences have been employed as epidemiological markers, as in Spoligotyping, a fast technique based on PCR followed by differential hybridization of amplified products. The polymorphism observed among different isolates is probably the product of strain-dependent recombination. MIRU (mycobacterial interspersed repetitive unit) typing is a reproducible and fast assay, involving the generation of genotypes based on the study of 12 loci containing VNTRs (variable-number tandem repeats) in strains of the M. tuberculosis complex. It compares strains from different geographic areas and allows the movement of individual lineages to be tracked, as in RFLP. This approach enables a greater number of isolates to be analyzed, leading to the identification of a larger number of foci of transmission within the population and thus to improved ways of slowing the progress of the disease.

Papel de polimorfismos genéticos nos genes IL10, TNF e LTA na hanseníase

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Diagnóstico e caracterização molecular de Giardia duodenalis e Cryptosporidium spp. em amostras fecais de bovinos e ovinos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Micropropagação e uso de marcadores moleculares na determinação do sexo do mamoeiro

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Verificação da associação da variabilidade genética da Alfa-1-antitripsina e do fator de necrose tumoral com a asma brônquica

A asma brônquica é uma desordem inflamatória crônica, complexa, na qual estão envolvidos fatores genéticos e ambientais. A inflamação das vias aéreas na asma é regulada, predominantemente, por células do sistema imunológico e por uma vasta rede de citocinas que interagem mutuamente e com as vias aéreas. O exato desempenho funcional de cada citocina na fisiopatologia da asma ainda necessita ser completamente estabelecido. A presente investigação teve como objetivo comparar a distribuição dos alelos S e Z do gene da A1AT e do polimorfismo do gene do TNF-α (-308 G/A) em uma população de 110 asmáticos, divididos em dois níveis de severidade da asma (com 54 pacientes no nível da doença moderada persistente e 56 pacientes no nível da doença severa persistente). Os genótipos da A1AT e do TNF-α (-308 G/A) foram determinados pela técnica de digestão enzimática (polimorfismo no comprimento dos fragmentos de restrição). O polimorfismo no promotor do gene do fator de necrose tumoral TNF-α (-308G/A), citocina pro-inflamatória que participa da reação inflamatória em pacientes com asma, contribuindo para a hiperreatividade brônquica, não foi na presente investigação, associado com a doença ou com o aumento da hiperreatividade brônquica, nos níveis de severidade sintomática mais graves da doença.

Caracterização genotípica de amaostras de Toxoplasma gondii isoladas de ovinos de abatedouro

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Molecular characterization of accessions of crabgrass (Digitaria nuda) and response to ametryn

Digitaria species are sugar cane crop weeds in Brazil and are being controlled with herbicides, although there are some reports of control failure, notably to the triazine group. Molecular techniques are recommended to analyze the genetic variability in weeds. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) and, in combination with sequencing, allow the localization of resistance genes, as well as possible mutations related to the onset of resistant individuals in some species. Thus, the objective of this work was to characterize ten accessions of Digitaria spp. by RAPD and PCR-RFLP markers, to sequence a conserved region of the psbA gene and evaluate the accessions response to ametryn. As showed by molecular analysis there was high genetic similarity among the accessions, all of them presented similar genetics profiles and were susceptible to ametryn.

Diferentes métodos de diagnóstico molecular na diferenciação das espécies de Sarcocystis spp

The Sarcocystis genus includes obligatory two-host life cycle protozoan parasites. It is the most numerous of the six genera of the Sarcocystidae family. The infection caused by parasites of this genus is a zoonotic and cosmopolitan disease known as sarcosistosis or sarcosporidiosis. The sarcositosis though frequently asymptomatic in its definitive hosts can be fatal in its intermediate hosts. The usual diagnoses of sarcosistosis takes place through a histological demonstration of schizonts in blood vessels and organs, and the presence of cysts in muscle tissue by necropsy or biopsy, this second method still more common and based on morphological features of the sarcocyst. However, these methods can be inadequate to a precise identification of the infector species once that, besides the genus being of numerous species, these often present similar morphological features. Another factor that makes the diagnostic more difficult is the non specificity of some Sacocystis species to their hosts. Consequently, molecular diagnostic methods have been used in order to identify the infector species and the parasite specific biological cycles, demonstrating also new species and coevolutive aspects between parasite and host. Among the most employed molecular techniques the Polimerase Chain Reaction (PCR), the nested-PCR and the Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) stands out

Ocorrência de Angiostrongylus cantonensis (Nematoda, Angiostrongylidae) em Achatina fulica (Mollusca, Gastropoda) na Baixada Santista

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Estudo do polimorfismo Ser49Gly do gene do receptor beta adrenérgico 1 (β-adr 1) na população do estado do Rio de Janeiro, Brasil estratificada por cor da pele e ancestralidade genômica

As doenças cardiovasculares possuem a maior taxa de óbitos no mundo, e notavelmente nos últimos anos as pesquisas genéticas sobre as mesmas estão baseadas em estudos de associação, no qual o gene suspeito que esteja em maior frequência entre os pacientes passa a ser considerado um possível fator causal. Os polimorfismos genéticos que ocorrem no receptor beta-adrenérgico podem resultar em mudanças significativas na função do receptor, podendo acarretar fisiopatologias. Neste trabalho, o objetivo foi estimar a diversidade e a frequência do polimorfismo Ser49Gly do gene do receptor beta-adrenérgico 1 a partir de uma amostra de 188 indivíduos da população do Estado do Rio de Janeiro. As frequências também foram analisadas a partir da estratificação da amostra por critério fenotípico em função do padrão de cor da pele em (negros e não negros) ou ancestralidade genética em (afrodescendente e não afrodescendente), definida através da informação dos marcadores de ancestralidade Indels e SNP de cromossomo Y, para avaliar se os padrões de ancestralidade ou cor da pele são fundamentais para a diferenciação e distanciamento genético. Fragmentos de interesse foram amplificados por PCR (reação de cadeia de polimerase) com primers específicos para o marcador Ser49Gly e as reações de genotipagem foram realizadas com enzimas de restrição Eco0109I. Os valores da heterozigosidade variaram entre 0,25-0,50 e 0,20-0,41 nos grupos estratificados por ancestralidade e cor da pele, respectivamente. No que diz respeito à análise do equilíbrio de Hardy-Weinberg, não houve um desvio significativo na distribuição do marcador nas amostras gerais do Estado do Rio de Janeiro, ou mesmo nas amostras estratificadas. A distribuição dos alelos na amostra dos 188 indivíduos da população geral do Rio de Janeiro (AC_RJ) mostrou uma frequência de 80,30% e 19,70% para o alelo selvagem e mutado Ser49Gly, respectivamente. A comparação das análises sobre a distribuição das frequências alélicas para este marcador mostrou a ocorrência de diferenças significativas na distribuição das frequências alélicas entre negros e não negros e afrodescendentes e não afrodescendentes. A diferença significativa observada entre os negros e afrodescendentes, foi em menor grau de distanciamento. A informação obtida em relação à ancestralidade foi crucial para a obtenção dos dados sobre o aumento da variável mutada do polimorfismo Ser49Gly nas populações negras e afrodescendentes do Estado Rio de Janeiro. Tal evidência, em combinação com estudos clínicos podem contribuir para uma análise pormenorizada do padrão de susceptibilidade à doença em questão, em falhas do mecanismo deste receptor.