A role for the phagosome in cytokine secretion

Membrane traffic in activated macrophages is required for two critical events in innate immunity: proinflammatory cytokine secretion and phagocytosis of pathogens. We found a joint trafficking pathway linking both actions, which may economize membrane transport and augment the immune response. Tumor necrosis factor α (TNFα) is trafficked from the Golgi to the recycling endosome (RE), where vesicle-associated membrane protein 3 mediates its delivery to the cell surface at the site of phagocytic cup formation. Fusion of the RE at the cup simultaneously allows rapid release of TNFα and expands the membrane for phagocytosis.

For host factors weddings and a Koch’s bacillus funeral: actin, lipids, phagosome maturation and inflammasome activation

The chapter describes the 10 years research of Anes Laboratory on the interactions of M. tuberculosis with macrophages namely with the actin. modulation by lipids, phagosome maturation and inflammasome activation

Caractérisation moléculaire de la modulation spatio-temporelle des fonctions du phagosome

La phagocytose est un processus par lequel des cellules spécialisées du système immunitaire comme les macrophages ingèrent des microorganismes envahisseurs afin de les détruire. Les microbes phagocytés se retrouvent dans un compartiment intracellulaire nommé le phagosome, qui acquiert graduellement de nombreuses molécules lui permettant de se transformer en phagolysosome possédant la capacité de tuer et dégrader son contenu. L’utilisation de la protéomique a permis de mettre en évidence la présence de microdomaines (aussi nommés radeaux lipidiques ou radeaux membranaires) sur les phagosomes des macrophages. Notre équipe a démontré que ces radeaux exercent des fonctions cruciales au niveau de la membrane du phagosome. D’abord nous avons observé que la survie du parasite intracellulaire L. donovani est possible dans un phagosome dépourvu de radeaux lipidiques. Parallèlement nous avons constaté qu’un mutant de L. donovani n’exprimant pas de LPG à sa surface(LPG-) est rapidement tué dans un phagosome arborant des radeaux membranaires. Pour comprendre le mécanisme de perturbation des microdomaines du phagosome par la molécule LPG, nous avons provoqué la phagocytose de mutants LPG- du parasite et comparé par microscopie les différences avec le parasite de type sauvage. Nous avons ainsi démontré que le LPG de L. donovani est nécessaire et suffisant au parasite pour empêcher la maturation normale du phagosome. Nous avons également découvert que la molécule LPG permet d’empêcher la formation des radeaux lipidiques sur le phagosome et peut aussi désorganiser les radeaux lipidiques préexistants. Enfin, nous avons montré que l’action de LPG est proportionnelle au nombre d’unités répétitives de sucres (Gal(β1,4)-Manα1-PO4) qui composent cette molécule. Nos travaux ont démontré pour la première fois le rôle important de ces sous-domaines membranaires dans la maturation du phagosome. De plus, nos conclusions seront des pistes à suivre au cours des études cliniques ayant pour but d’enrayer la leishmaniose. Le second objectif de ce travail consistait à effectuer la caractérisation des radeaux lipidiques par une analyse protéomique et lipidomique à l’aide de la spectrométrie de masse. Nous avons ainsi entrepris l’identification systématique des protéines présentes dans les radeaux membranaires des phagosomes et ce, à trois moments clés de leurmaturation. Le traitement des phagosomes purifiés avec un détergent nous a permis d’isoler les «Detergent Resistent Membranes» (DRMs) des phagosomes, qui sont l’équivalent biochimique des radeaux membranaires. Nous avons ainsi établi une liste de 921 protéines associées au phagosome, dont 352 sont présentes dans les DRMs. Les protéines du phagosome sont partagées presque également entre trois tendances cinétiques (augmentation, diminution et présence transitoire). Cependant, une analyse plus spécifique des protéines des DRMs démontre qu’une majorité d’entre elles augmentent en fonction de la maturation. Cette observation ainsi que certains de nos résultats montrent que les radeaux lipidiques des phagosomes précoces sont soit très peu nombreux, soit pauvres en protéines, et qu’ils sont recrutés au cours de la maturation du phagosome. Nous avons aussi analysé les phospholipides du phagosome et constaté que la proportion entre chaque classe varie lors de la maturation. De plus, en regardant spécifiquement les différentes espèces de phospholipides nous avons constaté que ce ne sont pas uniquement les espèces majoritaires de la cellule qui dominent la composition de la membrane du phagosome. L’ensemble de nos résultats a permis de mettre en évidence plusieurs fonctions potentielles des radeaux lipidiques, lesquelles sont essentielles à la biogenèse des phagolysosomes (signalisation, fusion membranaire, action microbicide, transport transmembranaire, remodelage de l’actine). De plus, la cinétique d’acquisition des protéines de radeaux lipidiques indique que ceux-ci exerceraient leurs fonctions principalement au niveau des phagosomes ayant atteint un certain niveau de maturation. L’augmentation du nombre de protéines des radeaux membranaires qui s’effectue durant la maturation du phagosome s’accompagne d’une modulation des phospholipides, ce qui laisse penser que les radeaux membranaires se forment graduellement sur le phagosome et que ce ne sont pas seulement les protéines qui sont importées.

L'évolution du phagosome

La phagocytose est un processus cellulaire par lequel de larges particules sont internalisées dans une vésicule, le phagosome. Lorsque formé, le phagosome acquiert ses propriétés fonctionnelles à travers un processus complexe de maturation nommé la biogénèse du phagolysosome. Cette voie implique une série d’interactions rapides avec les organelles de l’appareil endocytaire permettant la transformation graduelle du phagosome nouvellement formé en phagolysosome à partir duquel la dégradation protéolytique s’effectue. Chez l’amibe Dictyostelium discoideum, la phagocytose est employée pour ingérer les bactéries de son environnement afin de se nourrir alors que les organismes multicellulaires utilisent la phagocytose dans un but immunitaire, où des cellules spécialisées nommées phagocytes internalisent, tuent et dégradent les pathogènes envahissant de l’organisme et constitue la base de l’immunité innée. Chez les vertébrés à mâchoire cependant, la transformation des mécanismes moléculaires du phagosome en une organelle perfectionnée pour l’apprêtement et la présentation de peptides antigéniques place cette organelle au centre de l’immunité innée et de l’immunité acquise. Malgré le rôle crucial auquel participe cette organelle dans la réponse immunitaire, il existe peu de détails sur la composition protéique et l’organisation fonctionnelles du phagosome. Afin d’approfondir notre compréhension des divers aspects qui relient l’immunité innée et l’immunité acquise, il devient essentiel d’élargir nos connaissances sur les fonctions moléculaire qui sont recrutées au phagosome. Le profilage par protéomique à haut débit de phagosomes isolés fut extrêmement utile dans la détermination de la composition moléculaire de cette organelle. Des études provenant de notre laboratoire ont révélé les premières listes protéiques identifiées à partir de phagosomes murins sans toutefois déterminer le ou les rôle(s) de ces protéines lors du processus de la phagocytose (Brunet et al, 2003; Garin et al, 2001). Au cours de la première étude de cette thèse (Stuart et al, 2007), nous avons entrepris la caractérisation fonctionnelle du protéome entier du phagosome de la drosophile en combinant diverses techniques d’analyses à haut débit (protéomique, réseaux d’intéractions protéique et ARN interférent). En utilisant cette stratégie, nous avons identifié 617 protéines phagosomales par spectrométrie de masse à partir desquelles nous avons accru cette liste en construisant des réseaux d’interactions protéine-protéine. La contribution de chaque protéine à l’internalisation de bactéries fut ensuite testée et validée par ARN interférent à haut débit et nous a amené à identifier un nouveau régulateur de la phagocytose, le complexe de l’exocyst. En appliquant ce modèle combinatoire de biologie systémique, nous démontrons la puissance et l’efficacité de cette approche dans l’étude de processus cellulaire complexe tout en créant un cadre à partir duquel il est possible d’approfondir nos connaissances sur les différents mécanismes de la phagocytose. Lors du 2e article de cette thèse (Boulais et al, 2010), nous avons entrepris la caractérisation moléculaire des étapes évolutives ayant contribué au remodelage des propriétés fonctionnelles de la phagocytose au cours de l’évolution. Pour ce faire, nous avons isolé des phagosomes à partir de trois organismes distants (l’amibe Dictyostelium discoideum, la mouche à fruit Drosophila melanogaster et la souris Mus musculus) qui utilisent la phagocytose à des fins différentes. En appliquant une approche protéomique à grande échelle pour identifier et comparer le protéome et phosphoprotéome des phagosomes de ces trois espèces, nous avons identifié un cœur protéique commun à partir duquel les fonctions immunitaires du phagosome se seraient développées. Au cours de ce développement fonctionnel, nos données indiquent que le protéome du phagosome fut largement remodelé lors de deux périodes de duplication de gènes coïncidant avec l’émergence de l’immunité innée et acquise. De plus, notre étude a aussi caractérisée en détail l’acquisition de nouvelles protéines ainsi que le remodelage significatif du phosphoprotéome du phagosome au niveau des constituants du cœur protéique ancien de cette organelle. Nous présentons donc la première étude approfondie des changements qui ont engendré la transformation d’un compartiment phagotrophe à une organelle entièrement apte pour la présentation antigénique.

A role for the phagosome in cytokine secretion

Membrane traffic in activated macrophages is required for two critical events in innate immunity: proinflammatory cytokine secretion and phagocytosis of pathogens. We found a joint trafficking pathway linking both actions, which may economize membrane transport and augment the immune response. Tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) is trafficked from the Golgi to the recycling endosome (RE), where vesicle-associated membrane protein 3 mediates its delivery to the cell surface at the site of phagocytic cup formation. Fusion of the RE at the cup simultaneously allows rapid release of TNF alpha and expands the membrane for phagocytosis.

Étude protéomique et bioinformatique du phagosome de la drosophile

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle du réticulum endoplasmique lors de la phagocytose et l'implication de son recrutement sur les fonctions du phagosome

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude protéomique et bioinformatique du phagosome de la drosophile

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle du réticulum endoplasmique lors de la phagocytose et l'implication de son recrutement sur les fonctions du phagosome

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mycobacterium tuberculosis Inhibits RAB7 Recruitment to Selectively Modulate Autophagy Flux in Macrophages

Here we report a novel regulatory mechanism for autophagy-mediated degradation of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and specific strategy exploited by the virulent Mtb to evade it. We show while both avirulent (H37Ra) and virulent (H37Rv) mycobacteria could readily localize to autophagosomes, their maturation into autolysosomes (flux) was significantly inhibited by the latter strain. The inhibition of autophagy flux by the virulent strain was highly selective, as it did not perturb the basal autophagy flux in the macrophages. Selective inhibition of flux of Mtb-containing autophagosomes required virulence regulators PhoP and ESAT-6. We show that the maturation of Mtb-containing autophagosomes into autolysosomes required recruitment of the late endosome marker RAB7, forming the intermediate compartment amphisomes. Virulent Mtb selectively evaded their targeting to the amphisomes. Thus we report a crosstalk between autophagy and phagosome maturation pathway and highlight the adaptability of Mtb, manifested by selective regulation of autophagy flux.

Aderência, invasão e indução de apoptose por estreptococos do grupo B em células epiteliais respiratórias A549

Estreptococos do grupo B (EGB), principalmente sorotipo III são a principal causa de pneumonia neonatal, sepse e meningite. O potencial de virulência das amostras de EGB pode determinar a colonização ou a infecção do hospedeiro. Como o pulmão constitui uns dos primeiros órgãos durante o processo de invasão sistêmica por EGB, nós decidimos investigar os mecanismos de adesão e invasão de amostras do sorotipo III (90356-líquor e 80340-vagina) com linhagem de células epiteliais do pulmão humano (A549). Desta forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de aderência e invasão de duas amostras de EGB sorotipo III com células de epiteliais pulmonares A549, a persistência bacteriana intracelular, a fusão com compartimentos acídicos, potencial citotóxico e indução de apoptose. As amostras mostraram capacidade de aderir e invadir o epitélio pulmonar A549, onde a amostra 90356-líquor isolada de paciente a que apresentou maior propriedade adesiva e invasiva que a amostra 80340-vagina (p<0,05). Ambas as cepas mostraram persistência intracelular sem replicação no interior do epitélio respiratório até 24h de incubação. Além disso, verificamos que os EGB são capazes de promover vacuolização celular permanecendo viáveis dentro de vacúolos acídicos, sugerindo a ocorrência de fusão lisossomo-fagossomo. A amostra 90356-líquor também mostrou maior citotoxidade quando comparada com a amostra 80340-vagina. A análise por citometria de fluxo demonstrou, pela primeira vez, que o EGB induz apoptose em epitélio respiratório, podendo representar um mecanismo importante para o desenvolvimento da lesão celular aguda e a patogênese bacteriana.

Akt-Mediated Proinflammatory Response of Mononuclear Phagocytes Infected with Burkholderia cenocepacia Occurs by a Novel GSK3 beta-Dependent, I kappa B Kinase-Independent Mechanism

The environmental bacterium Burkholderia cenocepacia causes opportunistic lung infections in immunocompromised individuals, particularly in patients with cystic fibrosis. Infections in these patients are associated with exacerbated inflammation leading to rapid decay of lung function, and in some cases resulting in cepacia syndrome, which is characterized by a fatal acute necrotizing pneumonia and sepsis. B. cenocepacia can survive intracellularly in macrophages by altering the maturation of the phagosome, but very little is known on macrophage responses to the intracellular infection. In this study, we have examined the role of the PI3K/Akt signaling pathway in B. cenocepacia-infected monocytes and macrophages. We show that PI3K/Akt activity was required for NF-kappa B activity and the secretion of proinflammatory cytokines during infection with B. cenocepacia. In contrast to previous observations in epithelial cells infected with other Gram-negative bacteria, Akt did not enhance I kappa B kinase or NF-kappa B p65 phosphorylation, but rather inhibited GSK3 beta, a negative regulator of NF-kappa B transcriptional activity. This novel mechanism of modulation of NF-kappa B activity may provide a unique therapeutic target for controlling excessive inflammation upon B. cenocepacia infection. The Journal of Immunology, 2011, 187: 635-643.

Global changes in gene expression by the opportunistic pathogen Burkholderia cenocepacia in response to internalization by murine macrophages

Burkholderia cenocepacia is an opportunistic pathogen causing life-threatening infections in patients with cystic fibrosis. The bacterium survives within macrophages by interfering with endocytic trafficking and delaying the maturation of the B. cenocepacia-containing phagosome. We hypothesize that B. cenocepacia undergoes changes in gene expression after internalization by macrophages, inducing genes involved in intracellular survival and host adaptation.

Inactivation of macrophage Rab7 by Burkholderia cenocepacia

Strains of the Burkholderia cepacia complex can survive within macrophages by arresting the maturation of phagocytic vacuoles. The bacteria preclude fusion of the phagosome with lysosomes by a process that is poorly understood. Using murine macrophages, we investigated the stage at which maturation is arrested and analyzed the underlying mechanism. Vacuoles containing B. cenocepacia strain J2315, an isolate of the transmissible ET12 clone, recruited Rab5 and synthesized phosphatidylinositol-3-phosphate, indicating progression to the early phagosomal stage. Despite the fact that the B. cenocepacia-containing vacuoles rarely fused with lysosomes, they could nevertheless acquire the late phagosomal markers CD63 and Rab7. Fluorescence recovery after photobleaching and use of a probe that detects Rab7-guanosine triphosphate indicated that activation of Rab7 was impaired by B. cenocepacia, accounting at least in part for the inability of the vacuole to merge with lysosomes. The Rab7 defect was not due to excessive cholesterol accumulation and was confined to the infected vacuoles. Jointly, these experiments indicate that B. cenocepacia express virulence factors capable of interfering with Rab7 function and thereby with membrane traffic.

Intracellular survival of Burkholderia cenocepacia in macrophages is associated with a delay in the maturation of bacteria-containing vacuoles

Strains of the Burkholderia cepacia complex (Bcc) are opportunistic bacteria that can cause life-threatening infections in patients with cystic fibrosis and chronic granulomatous disease. Previous work has shown that Bcc isolates can persist in membrane-bound vacuoles within amoeba and macrophages without bacterial replication, but the detailed mechanism of bacterial persistence is unknown. In this study, we have investigated the survival of the Burkholderia cenocepacia strain J2315 within RAW264.7 murine macrophages. Strain J2315 is a prototypic isolate of the widespread and transmissible ET12 clone. Unlike heat-inactivated bacteria, which reach lysosomes shortly after internalization, vacuoles containing live B. cenocepacia J2315 accumulate the late endosome/lysosome marker LAMP-1 and start fusing with lysosomal compartments only after 6 h post internalization. Using fluorescent fluid-phase probes, we also demonstrated that B. cenocepacia-containing vacuoles continued to interact with newly formed endosomes, and maintained a luminal pH of 6.4 +/- 0.12. In contrast, vacuoles containing heat-inactivated bacteria had an average pH of 4.8 +/- 0.03 and rapidly merged with lysosomes. Additional experiments using concanamycin A, a specific inhibitor of the vacuolar H+-ATPase, revealed that vacuoles containing live bacteria did not exclude the H+-ATPase. This mode of bacterial survival did not require type III secretion, as no differences were found between wild type and a type III secretion mutant strain. Collectively, our results suggest that intracellular B. cenocepacia cause a delay in the maturation of the phagosome, which may contribute to facilitate bacterial escape from the microbicidal activities of the host cell.