Insights on PRAME and osteosarcoma by means of gene expression profiling

Osteosarcoma (OS) is the most frequent bone tumor in children and adolescents. Tumor antigens are encoded by genes that are expressed in many types of solid tumors but are silent in normal tissues, with the exception of placenta and male germ-line cells. It has been proposed that antigen tumors are potential tumor markers. The premise of this study is that the identification of novel OS-associated transcripts will lead to a better understanding of the events involved in OS pathogenesis and biology. We analyzed the expression of a panel of seven tumor antigens in OS samples to identify possible tumor markers. After selecting the tumor antigen expressed in most samples of the panel, gene expression profiling was used to identify osteosarcoma-associated molecular alterations. A microarray was employed because of its ability to accurately produce comprehensive expression profiles. PRAME was identified as the tumor antigen expressed in most OS samples; it was detected in 68% of the cases. Microarray results showed differences in expression for genes functioning in cell signaling and adhesion as well as extracellular matrix-related genes, implying that such tumors could indeed differ in regard to distinct patterns of tumorigenesis. The hypothesis inferred in this study was gathered mostly from available data concerning other kinds of tumors. There is circumstantial evidence that PRAME expression might be related to distinct patterns of tumorigenesis. Further investigation is needed to validate the differential expression of genes belonging to tumorigenesis-related pathways in PRAME-positive and PRAME-negative tumors.

BCR-ABL-mediated upregulation of PRAME is responsible for knocking down TRAIL in CML patients

Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-TNFSF10 (TRAIL), a member of the TNF-alpha family and a death receptor ligand, was shown to selectively kill tumor cells. Not surprisingly, TRAIL is downregulated in a variety of tumor cells, including BCR-ABL-positive leukemia. Although we know much about the molecular basis of TRAIL-mediated cell killing, the mechanism responsible for TRAIL inhibition in tumors remains elusive because (a) TRAIL can be regulated by retinoic acid (RA); (b) the tumor antigen preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) was shown to inhibit transcription of RA receptor target genes through the polycomb protein, enhancer of zeste homolog 2 (EZH2); and (c) we have found that TRAIL is inversely correlated with BCR-ABL in chronic myeloid leukemia (CML) patients. Thus, we decided to investigate the association of PRAME, EZH2 and TRAIL in BCR-ABL-positive leukemia. Here, we demonstrate that PRAME, but not EZH2, is upregulated in BCR-ABL cells and is associated with the progression of disease in CML patients. There is a positive correlation between PRAME and BCR-ABL and an inverse correlation between PRAME and TRAIL in these patients. Importantly, knocking down PRAME or EZH2 by RNA interference in a BCR-ABL-positive cell line restores TRAIL expression. Moreover, there is an enrichment of EZH2 binding on the promoter region of TRAIL in a CML cell line. This binding is lost after PRAME knockdown. Finally, knocking down PRAME or EZH2, and consequently induction of TRAIL expression, enhances Imatinib sensibility. Taken together, our data reveal a novel regulatory mechanism responsible for lowering TRAIL expression and provide the basis of alternative targets for combined therapeutic strategies for CML. Oncogene (2011) 30, 223-233; doi:10.1038/onc.2010.409; published online 13 September 2010

Regulation of TRAIL expression by PRAME and EZH2 as potential therapeutic target against solid tumors

We thank the Department of Pathologic Anatomy and the International Center for Research, from AC Camargo Hospital for the tissue microarray assays and for the donation of cancer cell lines, respectively. We thank Dr. René Bernards (Amsterdam, The Netherlands) for the gift of PRAME and EZH2 short hairpin RNA vectors.

Evaluation der Leukämie-Reaktivität von PRAME- und p53-spezifischen T-Zellen bei lymphohämatopoetischen Neoplasien im Rahmen einer adoptiven Immuntherapie

Der Transplantat-gegen-Leukämie (GVL) Effekt als immuntherapeutisches Mittel bei der allogenen hämatopoetischen Stammzell Transplantation (HSZT) ist hauptsächlich durch Spender Lymphozyten vermittelt, welche hämatopoetische Minor-Histokompatibilitäts Antigene bzw. Leukämie-assoziierte Antigene (z. B.: PRAME, p53) erkennen. Der adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen T-Zellen kann den GVL-Effekt, ohne ein Auftreten einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GVHD), steigern. Unter Verwendung von HLA-A2 und human CD8 transgenen Mäusen (CD8yCyA2Kb) konnten in dieser Arbeit PRAME spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen generiert werden. Diese zytotoxischen CD8+ T-Zellen zeigten in Chromfreisetzungsuntersuchungen lytische Aktivität gegen eine Vielzahl von Zelllinien, die PRAME endogen prozessieren sowie gegen das spezifische PRAME-Peptid. Des Weiteren wurden die hier generierten T-Zellen auf ihre zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie Blasten hin untersucht, und diese Untersuchungen zeigten AML-Reaktivität der PRAME-spezifischen sowie der als Vergleich genutzten p53- und HLA-A2-spezifischen T-Zellen. Das Potenzial der PRAME-spezifischen ZTL die GVL-Immunität in vivo zu erhöhen ohne das Vorkommen einer GVHD wurde in einem Tumor-Protektions-Model unter der Nutzung von NOD/SCIDgcnull Mäusen untersucht. Die PRA100- bzw. p53-ZTL wurden adoptiv in NOD/SCIDgcnull Rezipienten transferiert und gleichzeitig wurden die Tiere mit PRAME-, oder p53-exprimierende Tumorzelllinien inokuliert. Die Reduktion des Tumorwachstums bestätigte die Spezifität der T-Zellen auch in vivo. In weiteren in vivo Experimenten wurden NOD/SCIDgcnull Mäuse mit AML-Blasten rekonstituiert. Durch die Applikation von nur CD34 positiven Zellen aus einer AML-Probe, oder einer CD56 depletierten Probe, konnten Rekonstitutionen in 95 % aller Versuche erfolgreich beendet werden. Wurde eine Rekonstitution mittels PCR- und FACS-Analysen diagnostiziert, so folgten mehrere Applikationen der PRAME- oder p53-spezifischen ZTL. In diesen Untersuchungen konnten wir in einem therapeutischen AML-in vivo-Modell zeigen, dass die in diesen Untersuchungen generierten/verwandten ZTL in der Lage sind AML-Blasten in vivo zu bekämpfen und so die leukämische Last der Tiere im Blut sowie in der Milz auf unter 1 % zu regulieren. Der prozentuale Anteil humaner AML Zellen im Knochenmark konnte deutlich gesenkt werden (< 10 %). Zusammenfassend sind die von uns generierten PRAME-spezifischen T-Zellen in der Lage, in vitro und auch in vivo, endogen prozessiertes Protein auf Zelllinien und AML-Blasten zu erkennen und zu lysieren. Auch die p53-ZTL, welche als eine weitere Antigen-spezifische ZTL-Population in vivo getestet wurden, zeigten GVL-Effekte. Die Kenntnis von Tumor- bzw. Leukämie assoziierten Antigenen und die daraus erwachsene Möglichkeit der Generierung krankheitsspezifischer ZTL bietet die Grundlage für eine spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen.

Cancer/Testis Antigen Expression on Mesenchymal Stem Cells Isolated from Different Tissues

Background/Aims: The expression of cancer/testis antigens (CTAs) on additional normal tissues or stem cells may restrict their use as cancer targets. The objective of the present study was to evaluate the mRNA levels of some CTAs in a variety of tissues. Materials and Methods: mRNA of pericytes, fibroblasts and mesenchymal stem cells (MSCs) derived from adult and fetal tissues, human umbilical vein endothelial cells, MSC-derived adipocytes, selected normal tissues and control cancer cell lines (CLs) were extracted and quantitative polymerase chain reaction was performed for MAGED1, PRAME, CTAG1B, MAGEA3 and MAGEA4. Results: MAGED1 was expressed in all normal tissues and cells evaluated. CTAG1B was expressed at levels comparable to control CLs on MSCs derived from arterial, fetal skin, adipose tissue and saphenous vein, heart, brain and skin tissues. MAGEA4 was detected only in fibroblasts and differentiated adipocytes from MSCs, at levels comparable to the control CLs. Conclusion: The potential use of CTAs in immunotherapy should take into account the potential off-target effects on MSCs.

Pattern and clinical significance of cancer-testis gene expression in head and neck squamous cell carcinoma.

Cancer-testis (CT) antigens comprise families of tumor-associated antigens that are immunogenic in patients with various cancers. Their restricted expression makes them attractive targets for immunotherapy. The aim of this study was to determine the expression of several CT genes and evaluate their prognostic value in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). The pattern and level of expression of 12 CT genes (MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10, MAGE-C2, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-2, SSX-4, BAGE, GAGE-1/2, GAGE-3/4) and the tumor-associated antigen encoding genes PRAME, HERV-K-MEL, and NA-17A were evaluated by RT-PCR in a panel of 57 primary HNSCC. Over 80% of the tumors expressed at least 1 CT gene. Coexpression of three or more genes was detected in 59% of the patients. MAGE-A4 (60%), MAGE-A3 (51%), PRAME (49%) and HERV-K-MEL (42%) were the most frequently expressed genes. Overall, the pattern of expression of CT genes indicated a coordinate regulation; however there was no correlation between expression of MAGE-A3/A4 and BORIS, a gene whose product has been implicated in CT gene activation. The presence of MAGE-A and NY-ESO-1 proteins was verified by immunohistochemistry. Analysis of the correlation between mRNA expression of CT genes with clinico-pathological characteristics and clinical outcome revealed that patients with tumors positive for MAGE-A4 or multiple CT gene expression had a poorer overall survival. Furthermore, MAGE-A4 mRNA positivity was prognostic of poor outcome independent of clinical parameters. These findings indicate that expression of CT genes is associated with a more malignant phenotype and suggest their usefulness as prognostic markers in HNSCC.

Pattern and clinical significance of cancer-testis gene expression in head and neck squamous cell carcinoma

Les cancer-testis antigènes appartiennent à la famille des antigènes tumoraux spécifiques. Ils ont montré un pouvoir immunogène chez les patients porteurs de différents cancers. En effet, ils stimulent sélectivement les lymphocytes cytotoxiques, et leur expression spécifique dans les tissus tumoraux en fait une cible idéale pour une vaccination antitumorale. Le but de cette étude est d'identifier l'expression de certains de ces antigènes, d'analyser leur valeur pronostique et de déterminer la meilleure cible antigénique pour permettre une immunothérapie spécifique dans les carcinomes épidermoïdes des voies aérodigestives supérieures. Le profil et le taux d'expression de 12 cancer-testis antigènes (MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGEA10, MAGE-C2, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-2, SSX-4, BAGE, GAGE-1/2, GAGE-3/4) et de 3 autres antigènes tumoraux spécifiques (PRAME, HERV-K-MEL, NA-17A) ont été évalués par RT-PCR sur 57 échantillons de cancers ORL primaires. Les paramètres tumoraux et cliniques ont été prospectivement collectés afin de corréler ces données avec le résultat de nos investigations immunobiologiques. Quatre-vingt-huit pour cent des tumeurs expriment au moins 1 antigène. Une co-expression de 3 gènes ou plus est détectée chez 59% des patients. MAGE-A4 (60%), MAGE-A3 (51%), PRAME (49%) et HERV-K-MEL (42%) sont les gènes le plus fréquemment exprimés. Ils sont totalement absents des muqueuses saines avoisinantes. La présence de MAGE-A et NY-ESO-1 à la surface des cellules a été vérifiée par immunohistochimie. Nos analyses statistiques ont permis d'identifier une diminution de la survie liée au cancer chez les patients porteurs d'une tumeur exprimant de multiples cancer-testis antigènes et notamment MAGE-A4 dont l'expression indépendante d'autres éléments cliniques s'associe statistiquement à un taux de survie diminué. Nos résultats ont permis d'identifier un rôle pronostique de l'expression des gènes associés aux tumeurs dont l'expression est apparemment liée à un phénotype de malignité plus élevé. Cette constatation, corroborée par l'identification parallèle d'un infiltrat lymphocytaire spécifique confirme l'utilité potentielle de certains cancer-testis antigènes comme cible pour une immunothérapie ciblée dans les carcinomes des voies aérodigestives supérieures